Catálogo de publicaciones

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020

Este trabajo de Tesis se estructura en seis capítulos que tienen como objetivos estudiar los cambios a nivel de envoltura de Lactobacillus casei BL23, una bacteria Gram positiva, a través del análisis bioquímico y genético, cuando las células son sometidas a estrés osmótico empleando alta concentración de NaCl. Se verificó una diferencia en la sensibilidad a la lisis enzimática en la condición de crecimiento en alta sal (N), y se muestra que dos factores contribuyen a este efecto dado por una mayor permeabilidad de la enzima facilitando su acceso a su sustrato, asociado con un menor nivel de polímeros aniónicos (WTA y LTA) y una diferencia en los niveles de D- alanilación de estos y una disminución en el grado de entrecruzamiento del PG en las paredes de las células asociado a una actividad diferencial de HMW y LMW PBP. El estudio genético avala los resultados bioquímicos que demostraron una disminución tanto en el contenido de polímeros aniónicos como en el grado de D-alanilación de los mismos. La expresión génica de los genes responsables de la D-alanilación de los ácidos teicoicos (dltA y dltC) demostró una disminución de la actividad transcripcional durante el crecimiento en alta sal. La expresión del gen de síntesis de LTA (yfnI) también marcó una disminución durante el crecimiento en esta condición. Los cambios en el contenido como así también en el nivel de sustitución por ésteres de D- Alanina de ácidos teicoicos durante el crecimiento en estrés osmótico conducen a efectos pleiotrópicos que incluyen: 1) Mayor sensibilidad frente a antimicrobianos de naturaleza catiónica (Nisina) y glicopéptidos con blanco de acción la pared celular (Vancomicina) 2) Mayor capacidad de formación de Biofilm sobre superficies artificiales 3) Aumento en el pegado o “ binding” de cationes bivalentes La construcción y análisis de una mutante dltA que muestra una disminuida capacidad de crecimiento en alta sal, confirma la sospecha del rol de la D-alanilación en la capacidad de respuesta frente al estrés omótico. De los resultados obtenidos se desprende una aplicación, un nuevo método para la electroporación de las especies de Lactobacillus que consiste esencialmente en el debilitamiento de la pared celular a partir del crecimiento en condiciones de alta sal. 5 Con este nuevo método se obtienen mayores eficiencias comparadas con los métodos convencionales de electroporación y puede ser extensivo a otras especies del género Lactobacillus que muestren una fragilización de la pared como consecuencia del estrés osmótico.

Las propiedades funcionales de proteínas de soja han sido estudiadas fundamentalmente utilizando las fracciones 7S y 11S puras, poniéndose énfasis en las condiciones de gelación. Los estudios realizados con aislados proteicos de soja son escasos y se han llevado a cabo básicamente con aislados de origen comercial donde las condiciones de procesamiento se desconocen por lo que la información que puede obtenerse de los mismos es reducida. En el curso del presente trabajo se estudiarán, en primer lugar, los componentes proteicos que forman parte de un aislado obtenido a nivel de laboratorio. En segundo lugar se analizarán las modificaciones estructurales que sufren estos componentes al ser sometidos a tratamientos reductores y térmicos en distintas condiciones. Cabe señalar que hasta el momento sólo ha sido estudiado el efecto de tratamientos reductores sobre la funcionalidad de la glicinina pura. El efecto sobre la B-conglicinina y los aislados no ha sido considerado. Asimismo los estudios de asociación-disociación inducidos por calor de la glicinina, B-conglicinina y aislados proteicos se han realizado a pHs próximos a 7.6 y en condiciones controladas de fuerza iónica. Dichas condiciones no son representativas de las imperantes durante la elaboración de aislados. Por consiguiente, se estudiarán las reacciones de asociación-disociación que sufren los componentes del aislado cuando son sometidos a tratamientos térmicos en distintas condiciones durante el proceso de obtención. Finalmente se analizará el efecto de algunos de estos tratamientos reductores y térmicos sobre las características estructurales y funcionales de los aislados, con el fin de establecer relaciones entre tratamientos, modificaciones estructurales y funcionales.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Cátedra de Fisiología Humana. Facultad de Ciencias Médicas-CONICET- Universidad Nacional de Córdoba. 2015 - 88 h. con Anexos + CD. tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

La evaluación de la actividad antiviral in vitro contra los virus herpes simplex (HSV) tipos l y 2 de las diferentes clases de carragenanos obtenidos del alga roja patagónica Gigartina skottsbergii y sus derivados cíclicos mostró la presencia de varios compuestos con actividad antiherpética. Los estudios de modo de acción y propiedades antivirales se realizaron con tres carragenanos con la mayor potencia antiviral, pertenecientes a cada uno de los distintos tipos estructurales: 1T1, λ-carragenano, 1C1, carragenano K/i, y 1C3, carragenano μ/v. Los tres compuestos mostraron un amplio espectro de actividad antiherpética contra cepas de referencia de HSV-1 y HSV-2, mutantes TK' resistentes a aciclovir y aislamientos clínicos, con un índice de selectividad superior a 1000. La acción antiherpética de estos polisacáridos fue independiente de la célula huésped, la cepa de virus, la multiplicidad de infección y el ensayo de actividad antiviral empleado. Asimismo, en las concentraciones inhibitorias antivirales, los carragenanos carecieron de actividad anticoagulante. Los estudios del mecanismo de acción de 1T1, lC1 y 1C3; sobre la infección de células Vero con HSV-1 se llevaron a cabo analizando su efecto en las distintas etapas del ciclo de multiplicación viral. Su principal blanco de acción fue la adsorción del virus a la célula, interfiriendo con la unión del virión a los receptores primarios, que son los residuos heparan sulfato de proteoglicanos presentes en la superficie celular. No fueron activos en etapas posteriores del ciclo viral, y uno de los carragenanos, 1T1, mostró además propiedades virucidas produciendo inactivación del virión. Para evaluar la capacidad de inducir resistencia antiviral y también caracterizar mejor el blanco de ataque de los compuestos, se realizaron pasajes seriados de HSV-l en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de 1C3; y 1T1. Con 1T1, no se indujo resistencia, en tanto que las variantes virales seleccionadas con 1C3 mostraron un muy bajo nivel de resistencia, con valores de CI50 5-10 veces mayores que la cepa parental, y adquirieron la capacidad de formar sincicios en células Vero. El fenotipo sincicial fue independiente de la adquisición de resistencia parcial y se deberia a una alteración en la glicoproteína gB. Los tres carragenanos fueron también efectivos en inhibir la infección de HSV-1 y HSV-2 en astrocitos murinos, importante característica dado el caracter neurotrópico de estos virus. También mostraron efectos moduladores sobre la expresión de la proteína gliofibrilar ácida de los astrocitos. Se han realizado estudios in vivo con 1C3; y 1T1 utilizando el modelo de infección vaginal de ratones BALB/c con HSV-2, encontrándose protección superior al 90% en los animales que recibieron por lo menos dos dosis por via vaginal del carragenano 1T1. El conjunto de estos resultados indican la trascendencia de los carragenanos naturales estudiados como potenciales agentes antivirales, con promisorias posibilidades de aplicación terapéutica en forma tópica.

La centolla Lithodes santolla del Canal Beagle es un crustáceo explotado comercialmente en Argentina y Chile, con potencial a ser transportado en vivo en seco para su comercialización a otros centros urbanos. El transporte en seco implica factores estresantes (p. ej. hipoxia, cambios de temperatura y reperfusión), por lo que es necesario el estudio fisiológico y de supervivencia de la centolla. Se determinaron las defensas antioxidantes enzimáticas (superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa y glutatión-S-transferasa), no-enzimáticas (glutatión y ácido ascórbico) y los parámetros de estrés (oxidación de proteínas y peroxidación de lípidos) en machos comerciales. Además, se determinaron parámetros fisiológicos como la concentración de glucosa y el pH hemolinfático. Primero se analizaron las variaciones diarias y estacionales de las defensas antioxidantes. Las variaciones diarias podrían estar relacionadas con aumentos del consumo de O2 debido a la actividad locomotora. Por otro lado, las variaciones estacionales se debieron principalmente a las variaciones ambientales y también relacionadas a la muda y reproducción. En una segunda instancia, se estudió el sistema de defensas antioxidantes ante la exposición aérea a 8°C por 24 h y reinmersión en agua durante 24 h. Se observó que la centolla llega a un estado hipometabólico durante le exposición aérea, con la disminución de algunas enzimas antioxidantes, pero dejando otras activas, durante el cual los parámetros de estrés oxidativo no aumentaron. Una vez resumergidos, las defensas antioxidantes se encuentran altamente activas, con una recuperación del sistema luego de 8 h de reinmersión. En una tercera instancia se estudió la acción de las defensas antioxidantes ante la exposición aérea por 24 h a tres temperatura (4, 8 y 12°C), y la reperfusión en agua a 8°C luego de 12 h de reinmersión. Las centollas expuestas a 12°C que presentaron 100% de mortalidad luego de la exposición aérea. La recuperación de las centollas a 4°C y 8°C se logró durante el período de reinmersión, y no se observaron altos parámetros de estrés oxidativo. Estos resultados indican que la centolla es capaz de sobrevivir ante 24 h de exposición aérea, y de recuperarse una vez reinmersos, teniendo en cuenta las temperaturas de trabajo. El sistema de defensas antioxidantes en la centolla, en general, trabaja de manera concertada en respuesta a variaciones naturales (diarias y estacionales) como artificiales (exposición aérea y reperfusión) previniendo la generación del estrés oxidativo en la centolla L. santolla del Canal Beagle.

Los procesos moleculares que subyacen la formación de memorias a largo plazo involucran la activación de cascadas de señalización que transmiten las señales inducidas por la acción de neurotransmisores en la membrana celular hasta el núcleo, controlando la respuesta genómica en las neuronas. Esto resulta en la alteración de la fuerza de las sinapsis neuronales y en la configuración de una red neuronal asociada a la formación de la memoria. La vía de las MAPKs presenta un rol central integrando las señales producidas por los receptores de membrana y los efectores de esta cascada son factores de transcripción que inducen la expresión de genes de expresión inmediata temprana. Ante el desafío de ahondar en los mecanismos moleculares que subyacen la consolidación de memorias aversivas, con el objetivo de estudiar la modulación de la actividad del sistema glucocorticoide por parte del receptor CB1 cannabinoide, resulta de utilidad el trabajo con modelos in vitro acordes al sistema biológico de estudio. En nuestro caso, el modelo seleccionado fue la línea celular HT22, una línea que expresa de manera endógena los receptores CB1 y GR y deriva de hipocampo murino. En este sistema demostramos que la señalización del receptor CB1 media el efecto inductor de la dexametasona sobre el mRNA de Zif268 a través de un mecanismo que involucra la inhibición de la FAAH (hidrolasa de amidas de ácidos grasos), una enzima encargada de hidrolizar el endocannabinoide anandamida (AEA). A partir de estudios en ratones KO para el receptor CB1 y en concordancia con nuestros resultados in vitro, determinamos que la expresión del receptor CB1 es necesaria para el efecto inductor de la dexametasona sobre el mRNA de Zif268 en el hipocampo murino. Al evaluar el comportamiento de estos animales también encontramos que la expresión del receptor CB1 sería necesaria para que la dexametasona aumente la respuesta de evitamiento inhibitorio en experiencias de aversión moderada. Estos resultados sugieren que el sistema endocannabinoide (SEC), señalizando a través del receptor CB1, es necesario para observar los efectos de los glucocorticoides sobre la respuesta de evitamiento inhibitorio. A partir de los mecanismos descriptos en la línea celular HT22 postulamos que la dexametasona facilitaría la respuesta de evitamiento inhibitorio actuando a través de una activación indirecta del CB1, que se encontraría mediada por el aumento del contenido de endocannabinoides en la sinapsis neuronal como consecuencia de un efecto inhibitorio de los glucocorticoides sobre la actividad de la FAAH. Por otro lado, también demostramos en la línea celular HT22 que tanto agonistas (AM356) como antagonistas (AM251) del sistema cannabinoide inducen un aumento en los niveles del mRNA de Zif268 a través de un mecanismo que dependería de la activación de ERK. Hasta el momento, el mecanismo de acción propuesto para el SEC como facilitador de la consolidación de la memoria involucra sus efectos sobre la liberación de neurotransmisores y la modulación de la actividad GABAérgica. En este contexto, el presente trabajo provee evidencia novedosa de que ligandos cannabinoides sintéticos, actuando a través del receptor CB1, podrían modular la consolidación de la memoria, de manera directa, induciendo la transcripción de Zif268. Al estudiar el efecto del cotratamiento con AM356 y la dexametasona, encontramos que estos ligandos presentan una interacción positiva tanto a nivel del mRNA de Zif268 como en la respuesta de evitamiento inhibitorio. Si bien ambos ligandos per se aumentarían los niveles de mensajero de Zif268 mediante un mecanismo que involucraría la activación de ERK, el punto de interacción entre las vías de señalización disparadas por estos ligandos no se encuentra a nivel de esta kinasa. Por el contrario, el antagonista del CB1 AM251 inhibe el efecto del este glucocorticoide sobre Zif268 a través de un mecanismo que se encontraría mediado por la inhibición de ERK. Encontrar compuestos que inhiban la consolidación de la memoria resulta de gran interés para el tratamiento farmacológico preventivo de desórdenes de ansiedad, tales como el trastorno de estrés post-traumático (TEPT) y ciertas fobias. Existe evidencia para postular al condicionamiento clásico como un proceso involucrado en la etiología y el mantenimiento de estos desórdenes. Teniendo en cuenta que tanto la activación de ERK como la inducción de Zif268 serían necesarias para la consolidación de memorias aversivas, y que el cotratamiento con AM251 y dexametasona presenta un efecto inhibitorio sobre ERK en la línea celular HT22 y sobre Zif268 tanto in vitro como en el hipocampo murino, proponemos que una terapia combinada con altas dosis de dexametasona y un análogo del AM251 podría ser de utilidad para el tratamiento preventivo de trastorno de estrés post-traumático. Este trabajo aporta evidencia molecular novedosa acerca del rol del SEC, y en particular del receptor CB1, como mediador de los efectos de los glucocorticoides sobre la consolidación de memorias aversivas. Los ensayos realizados permitieron alcanzar los objetivos planteados, caracterizando la interacción entre ligandos del receptor CB1 y del GR a nivel conductual sobre la respuesta de evitamiento inhibitorio, y a nivel molecular sobre la actividad de la FAAH, la fosforilación de ERK y la expresión del mensajero de Zif268. Nuestros resultados ponen de manifiesto la complejidad de los sistemas neuronales y la necesidad de estudiar las vías de señalización en su conjunto. Conocer cómo las señales se integran y se transforman en una respuesta conductual determinada resulta fundamental para comprender los mecanismos que subyacen la consolidación de memorias.

Los genes homeóticos codifican para reguladores transcripcionales involucrados en la formación de patrones y las decisiones de destino celular durante la embriogénesis. Recientemente, ha despertado gran interés la función de dichos genes en tejidos adultos en continuo desarrollo así como también en procesos tumorigénicos. La mayor parte del crecimiento y morfogénesis de la glándula mamaria ocurre durante la vida subadulta y adulta del animal y ciertos estadios de la glándula postnatal presentan características de tipo embrionarias. Regulación de fomación de patrones, diferenciación celular e interacciones epitelio-estroma tienen lugar una vez finalizada la embriogénesis y reocurren durante cada ciclo de preñez, lactancia e involución. Debido a que la matriz extracelular influencia el desarrollo funcional y morfogenético de la glándula mamaria, investigamos si las señales provenientes de dicha matriz podrían estar involucradas en la expresión y regulación de genes homeóticos. Mediante una estrategia basada en reacciones en cadena de polimerasa, identificamos la expresión de 5 genes homeóticos pertenecientes a dos "clusters" del complejo Hox, en células mamarias murinas en cultivo. Un gen de cada uno de estos "clusters", Hoxa-1 y Hoxb-7, fue elegido para una caracterización más profunda. Encontramos que Hoxb-7 se expresa tanto en cultivo como in situ, donde su expresión es regulada a lo largo del desarrollo glandular y se localiza en el epitelio mamario. Hoxa-1 no se expresa en ningún estadio del desarrollo de la glándula murina normal pero sí se expresa en algunos tumores mamarios y en células mamarias funcionales, no malignas, cultivadas sobre plástico de cultivo. La expresión de ambos genes es reprimida cuando las células son cultivadas sobre una membrana basal reconstituída. Mientras que la regulación negativa de Hoxb-7 requiere estrictamente la presencia de membrana basal y cierta conformación celular, la de Hoxa-1 se logra mediante el cultivo de las células sobre un sustrato inerte antiadhesivo que permite una reorganización del citoesqueleto y concomitantemente cambios de morfología celular. En celulas tumorales, la expresión de Hoxb-7 es prácticamente indetectable y la expresión de Hoxa-1 no es regulada por ninguno de estos factores microambientales.

El consumo de kéfir se ha asociado a propiedades promotoras de la salud como efectos antimicrobianos, antitumorales e hipocolesterolémicos entre otros y es utilizado de manera empírica en el Este europeo para el tratamiento de desórdenes gastrointestinales. Nuestro grupo de trabajo ha aislado y caracterizado más de 120 bacterias y levaduras a partir de gránulos de kéfir hasta la fecha y de muchas de ellas se han estudiado las propiedades de resistencia a sales biliares, bajo pH, capacidad de adhesión a células epiteliales in vitro y caracterización de sus componentes de superficie. En el presente trabajo de tesis y proponiendo al kéfir como fuente de microorganismos potencialmente probióticos, se presentarán tres capítulos. En el primero se muestra la caracterización de dichos microorganismos en cuanto a su capacidad modulatoria de la respuesta inmune innata epitelial en un sistema reportero de inflamación in vitro; en el segundo capítulo se expondrá un estudio comparativo de los mecanismos de señalización implicados en la modulación, de manera comparativa entre bacterias y levaduras. Por último, en el tercer capítulo se analizará la posibilidad de aplicar microorganismos moduladores de la respuesta innata epitelial in vitro en modelos murinos de inflamación intestinal. De este modo, se puede resumir la organización racional del trabajo en la selección de microorganismos con propiedad inmunomodulatoria, el estudio mecanístico del efecto de inmunomodulación y la aplicación de estos microorganismos a un modelo de inflamación intestinal in vivo.