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Garavaglia, M. J. (2019). Aplicaciones bioinformáticas y moleculares para el estudio de la familia baculoviridae (Tesis de posgrado). Bernal, Argentina: Universidad Nacional de Quilmes.

En la degradación y remodelación de la pared celular intervienen numerosas enzimas y proteínas, y un aspecto común de la estructura de la mayoría de las mismas es su organización modular. Dicha organización incluye típicamente un dominio catalítico característico de cada enzima y uno o más dominios de unión a carbohidratos (CBM). Un CBM es definido como una secuencia contigua de aminoácidos dentro de una enzima activa involucrada en el metabolismo de carbohidratos, que posee la capacidad de unirse a los mismos. Hasta el momento, los CBM más estudiados corresponden a hongos y bacterias y se conoce muy poco de los de enzimas vegetales. Dentro de los CBM se destacan los dominios de unión a almidón (SBD). Desde abril de 2004 nuestro laboratorio trabaja en la caracterización de la almidón sintasa III (SSIII) de Arabidopsis thaliana (AT1G11720). Dicha proteína no había sido clonada ni caracterizada previamente. Los estudios preliminares mostraron que la porción amino terminal es portadora de tres regiones repetitivas con características de dominios SBD, hasta ese momento no descriptos en enzimas vinculadas con la síntesis de almidón, pertenecientes a la familia CBM53. Estudiando la capacidad de unión a distintos polisacáridos (almidón, amilosa, amilopectina, celulosa y xilanos) comprobamos que SBD123 tiene la capacidad de unirse a los cinco polisacáridos, dos de ellos componentes de la pared celular vegetal. Esto refleja la promiscuidad de tales dominios, ya que no sólo se unen a sustratos diferentes de su sustrato natural, sino que lo hacen con mayor avidez. Tales experimentos nos permitieron postular el uso de SBD123 como herramienta biotecnológica para modificar la estructura y/o el contenido de pared celular y de almidón de plantas. Para verificar nuestra hipótesis, se construyeron dos líneas de plantas transgénicas que sobreexpresan el extremo N-terminal de SSIII de A. thaliana específicamente en pared (E8-SBD123.1 y E8-SBD123.2) y que presentaron características fenotípicas destacables. Por lo tanto, se propusieron como objeto de estudio los dominios de unión a almidón (“Starch Binding Domains”, SBD, familia CBM53) de la almidón sintasa III de Arabidopsis thaliana y los CBM de ATXYN1, una endo-1,4-beta-xilanasa también de A. thaliana (familia CBM22). El abordaje fue llevado a cabo, utilizando análisis bioinformáticos, evolutivos e ingeniería de proteínas, así como técnicas moleculares y fisiológicas que nos brindaron información sobre su bioquímica, estructura y función y de su rendimiento o in vitro o in vivo como herramienta biotecnológica. En primer lugar, realizamos una caracterización de los parámetros fenotípicos de las plantas E8-SBD123 observando un aumento general en el tamaño y en la biomasa de dichas plantas en comparación con Col-0, además de una modificación en los parámetros de crecimiento reproductivo (tasa elongación del tallo, proporción de tallo y la longitud del hipocótilo). Estos parámetros se encuentran asociados a la etapa de crecimiento reproductivo, gobernada por la auto-preservación del SAM (meristema apical del tallo) por proliferación celular y la extensión del tallo por expansión celular. Sin embargo, no se observaron diferencias en la longitud del hipocótilo cuando las plántulas fueron sometidas a oscuridad continua. Adicionalmente se determinó que existe un aumento en la tasa de crecimiento, confirmado por técnicas de microscopía óptica. En el caso de las hojas, observamos que un aumento del 20% en el área foliar en las plantas transgénicas puede ser explicado solamente por un aumento del 20% del área celular promedio, no siendo significativa la contribución del número celular. Adicionalmente, observamos alteraciones en la composición de la pared celular de las plantas transgénicas en distintos órganos. Específicamente observamos aumento en los niveles de hemicelulosas y pectinas, los cuales pueden deberse a una respuesta de la planta para soportar las fuerzas de tensión. Por último, detectamos que estas plantas son capaces de producir mayor cantidad de azúcares fermentables en comparación con Col-0. Debido a que utilizamos a los SBD de la SSIII para alterar la estructura de la pared celular, y a que los precursores para la síntesis de celulosa y almidón son compartidos, decidimos evaluar los niveles de almidón transitorio y sacarosa, en hojas de las plantas de A. thaliana transformadas. Para esto, determinamos el contenido de almidón en función del tiempo, encontrando una disminución significativa a mitad del día en las líneas E8-SDB123.1 y E8-SDB123.2. Además, detectamos una variación en la relación amilosa/amilopectina. Por medio de TEM (microscopía electrónica de trasmisión), no pudimos determinar diferencias en el número de gránulos de almidón por cloroplastos, pero si una alteración en la forma y tamaño de los gránulos de almidón. Adicionalmente, se evidenció una disminución significativa en la actividad almidón sintasa total, y un aumento en la actividad de enzimas como la sacarosa sintasa (SUS) y la invertasa ácida (IA) en ambas líneas transgénicas, en comparación con la línea control. De esta forma, proponemos que el aumento en la actividad IA puede actuar como fuerza motriz de la expansión celular informada en las plantas transgénicas, y que tanto la alteración en la composición de la pared, como el aumento en la biomasa observado en las líneas transgénicas, pueden explicar un aumento en la demanda de azúcares en el apoplasto y, en consecuencia, un aumento en la actividad SUS.

La apolipoproteína A-I (apoA-I) es la proteína mayoritaria de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), a las que se les atribuyen propiedades antiaterogénicas por su papel en el transporte reverso del exceso de colesterol desde los tejidos periféricos hacia el hígado para su catabolismo y eliminación. En los ensayos realizados que se describen a lo largo de este trabajo, diferentes mutantes de cisteína de apoA-I fueron diseñadas, purificadas y marcadas en conjunto con otras previamente empleadas en el laboratorio. La sonda fluorescente pireno se introdujo en posiciones correspondientes a las caras hidrofóbicas e hidrofílicas de las hélices H4, H5 y H10. Se caracterizó la estabilidad estructural y funcional de estas variantes mutantes marcadas para validar los modelos para este estudio. Explotando las propiedades multiparamétricas de la sonda pireno la relevancia de las hélices H5 y H10 en eventos de auto-asociación de apoA-I en solución se evidenció, resaltando su participación en regiones de contacto durante ciertos pasos de oligomerización. Estos eventos fueron luego evaluados mediante el desarrollo de distintos modelos de asociación de equilibrio único y múltiple, donde más de un evento fue observado, destacándose la formación temprana de dímeros que sería la unidad mínima y funcional con capacidad de generar HDL discoidales (dHDL). La relevancia de estas posiciones fue también estudiada en entornos lipídicos donde no tuvieron gran utilidad; con la excepción de complejos de HDL generadas in vitro, en particular con una mutante de la hélice H5, como así también en HDL generadas in vivo por macrófagos THP-1. En conclusión, el arreglo temprano de ciertas estructuras oligoméricas en solución puede influir en el desarrollo de estructuras más complejas como son las dHDL. Más estudios son necesarios para poder comprender mejor las funciones estructurales que cumplen apoA-I en sus distintas formas oligoméricas, que podrían tener importantes aplicaciones en áreas diversas como medicina y la industria biotecnológica.

La DM es una patología extremadamente frecuente en todo el mundo, que genera un incremento del alto riesgo cardiaco y muerte por causas cardiovasculares. Si bien esta patología posee tratamiento farmacológico que apunta a disminuir los niveles de glucemia para evitar el riesgo microvascular y de órgano blanco, una vez que la DM se encuentra establecida, gran parte del daño ya se ha producido. En este sentido, abordar estadios tempranos de la DM como es la prediabetes en donde ya hay cambios leves pero consistentes de la glucemia, es una forma de prevenir el desarrollo a la DM y la posterior CMD. Estudiar la prediabetes implica encontrar los cambios que originan y participan de la patogénesis de la enfermedad establecida. Conocer los eventos moleculares iniciales de la enfermedad es esencial para entender el desarrollo de la misma, y de esta manera abordar estrategias terapéuticas de forma temprana en los pacientes para prevenir el progreso hacia una CMD consolidada. A su vez, como mencionamos anteriormente, el ion Ca2+ tiene un rol primordial en el corazón, no sólo porque es necesario para producir la contracción del cardiomiocito, sino también porque es modulador de múltiples enzimas encargadas de la producción de energía y regulación de diferentes procesos, entre ellos la apoptosis celular, pudiendo activar cascadas de señalización deletéreas. En este contexto, planteamos como hipótesis que en el estadio de prediabetes ocurre apoptosis en el corazón debido a pérdidas de Ca2+ desde el RS. Este manejo de Ca2+ alterado, afecta la comunicación del RS con la mitocondria, generando cambios funcionales y estructurales en las mismas, participando de los mecanismos que desencadenan la apoptosis. Estas alteraciones se deben a la hiperactividad de la enzima CaMKII.

Leptolegnia chapmanii (Seymour) es un Peronosporomycete (Oomycete) patógeno facultativo de larvas de mosquito. Los aislamientos conocidos de este microorganismo se restringen al continente americano, al norte en Estados Unidos y al sur en la Argentina. Por su parte, el aislamiento nativo argentino, actualmente incluido en la colección de hongos entomopatógenos del Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (CEPAVE) ha sido material de investigación desde hace dos décadas. De esta manera y previamente para el este aislamiento, se determinó un rango de mosquitos hospedadores, se confirmó su inocuidad sobre organismos “no blanco” y se determinaron algunas condiciones ambientales idóneas para su desarrollo e infectividad en condiciones de laboratorio y semi campo. Por su parte, el mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), de gran importancia por ser el principal vector de enfermedades tales como la fiebre amarilla, dengue, fiebre Chikungunya, entre otras, habita ambientes antrópicos, estando presente en áreas domiciliarias y peri domiciliarias, siendo el control de sus poblaciones una necesidad. En el presente trabajo de investigación se profundizaron dos áreas fundamentales en el conocimiento de L. chapmanii. Por un lado se estudiaron aspectos ecológicos como son el parasitismo, la persistencia y la dispersión de este patógeno en ambientes en donde naturalmente se desarrollan poblaciones larvales del mosquito Ae. aegypti, así como el efecto de la radiación UV-A sobre su virulencia y su compatibilidad con otros productos insecticidas. El otro enfoque fue más práctico, al procurar una mejora en la masificación, almacenamiento y aplicación de L. chapmanii como agente de control biológico. Dentro de los resultados obtenidos, encontramos que a posteriori, de la introducción del patógeno en recipientes en donde naturalmente se presenta el establecimiento y desarrollo de los estados acuáticos de Ae. aegypti, su persistencia y patogenicidad sobre las poblaciones del mosquito introducidas periódicamente, decreció a lo largo del tiempo con variaciones entre las diferentes áreas de ubicación. De esta manera, la mortalidad de las larvas fue significativamente más baja (p<0.05) en los recipientes ubicados en un área peri domiciliaria (al exterior) sin protección a la radiación (89 % en la primera semana y 9 % a la sexta semana), comparada con la mortalidad en los recipientes ubicados al interior (97% a la primera semana y 42% a la sexta) y al exterior con protección solar (89% a la primera semana y 29% a la sexta), sugiriendo esto algún tipo de influencia por parte de la radiación solar sobre la viabilidad y virulencia del entomopatógeno. En cuanto a los ensayos realizados para evaluar la capacidad de dispersión por parte del patógeno, no se evidenció la propagación del mismo por medio aéreo o asociado a la dinámica poblacional del mosquito en sus diferentes estados. En medio acuático se encontró una baja capacidad de dispersión por parte de las zoosporas. Tomando como base los resultados obtenidos y con el fin de elucidar cómo la radiación ambiental puede afectar la producción, virulencia y patogenicidad de las zoosporas de L. chapmanii, se realizaron ensayos de exposición a radiación UV-A con larvas de Ae. aegypti muertas por acción del patógeno, en etapa previa a la zoosporogénesis, así como con zoosporas en suspensión. Los resultados obtenidos demostraron que las larvas de Ae. aegypti (en donde se desarrollaron las estructuras reproductivas) protegieron a los zoosporangios y zoosporas durante la exposición a radiación UV-A, no evidenciándose diferencias en la producción de las estructuras reproductivas al menos para los tiempos de exposición manejados. Por su parte, la virulencia de las zoosporas en suspensión (sin protección ante la radiación UV-A) decreció con la creciente exposición a UV-A. Respecto a los ensayos de cultivo in vitro con los medios tradicionales PYG y Emerson YPss y con el medio alternativo a base de semilla de girasol (ESG), se registró una menor tasa de crecimiento por parte de L. chapmanii en el medio sólido ESG en comparación a los otros dos. Sin embargo con la biomasa desarrollada en este medio (ESG) tanto en estado sólido como líquido, se obtuvo la mayor y más rápida producción de zoosporas. Otra ventaja comparativa que se encontró con el medio ESG, fue el menor costo de producción, siendo una alternativa viable para la producción masiva a futuro del patógeno. Por su parte, de la reciente prueba para la masificación de L. chapmanii en un bioreactor con medio PYG líquido, el microorganismo presentó un patrón de crecimiento adecuado para su posterior manipulación. Los ensayos de patogenicidad realizados con el producto cosechado y larvas de Ae. aegypti, presentaron buenos resultados preliminares. Cabe anotar que se requieren mayores ensayos para realizar conclusiones más acertadas en este aspecto. Se realizaron pruebas de formulación con L. chapmanii en matriz de alginato de calcio, encontrando que el micelio encapsulado nunca fue infectivo; las zoosporas encapsuladas perdieron rápidamente su capacidad infectiva y el patógeno no fue capaz de atravesar la barrera física generada por el alginato de calcio. Por su parte en las pruebas con sustratos sólidos de uso agrícola como material para el almacenamiento y aplicación de L. chapmanii, la vermiculita presentó los mejores resultados en comparación con la arena y mantillo de bosque, sin embargo su tiempo de vida útil no superó una semana. Con el fin de determinar la compatibilidad de L. chapmanii con otros productos larvicidas, se comparó el desarrollo del mismo en medio de cultivo sólido con la adición en diferentes concentraciones de los productos mencionados. De lo anterior, se encontró una reducción en su tasa de crecimiento en los medios de cultivo con las mayores concentraciones de diflubenzuron y aceite de neem, no teniendo implicancias en la posterior viabilidad y virulencia de las zoosporas producidas. Por último se evaluó la perdida de virulencia por parte de L. chapmanii por el prolongado tiempo de mantenimiento in vitro en medio de cultivo sólido. Los ensayos se realizaron partiendo del aislamiento del patógeno a partir de larvas de Ae. aegypti infectadas, en medio PYG-agar, evaluándose cada dos semanas la producción de zoosporas así como su virulencia y patogenicidad sobre larvas de Ae. aegypti. En los ensayos se registró una reducción en cuanto a la producción de zoosporas a lo largo del tiempo, no siendo evidente la pérdida de viabilidad o virulencia por parte de las mismas, al menos durante el periodo de estudio. Con esta serie de ensayos consideramos que se avanzó en el conocimiento de L. chapmanii como patógeno de larvas de mosquito, confirmándose su potencial como biocontrolador, quedando aún mucho por profundizar.