Catálogo de publicaciones

Las phasinas son un grupo de proteínas que se encuentran asociadas a gránulos de polihidroxialcanoatos (PHA). Además de su rol estructural como parte de la cubierta del gránulo, se han encontrado diferentes funciones estructurales y regulatorias asociadas a varias de estas proteínas, y se han desarrollado aplicaciones biotecnológicas utilizando proteínas fusionadas a phasinas. A pesar de su diversidad funcional, la estructura de estas proteínas ha sido analizada en detalle en muy pocos estudios. PhaP de Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) pertenece al grupo más representado de la multifuncional familia de las phasinas. Esta proteína ha sido clonada y expresada en Escherichia coli. Las cepas recombinantes de E. coli que sobreexpresan phaPAz crecen más y acumulan más polímero, lo que sugiere que PhaPAz ejerce un efecto promotor del crecimiento. Se observó también que la expresión de PhaPAz tiene un inesperado efecto protector en E. coli no productora de PHA, tanto en condiciones normales como en condiciones de estrés, resultando en un mayor crecimiento y mayor resistencia a estrés oxidativo y estrés térmico. El objetivo de este trabajo doctoral es realizar una caracterización funcional y estructural de esta phasina para estudiar sus diversas propiedades y dilucidar el mecanismo por el cual ejerce su efecto protector. Su estructura primaria reveló que no posee claros dominios hidrofóbicos, característica que parece ser común a la mayoría de las phasinas, a pesar de su capacidad de unión a gránulos lipídicos. La estructura secundaria de esta proteína consiste en α-hélices, combinadas con regiones desestructuradas que le confieren una notable flexibilidad dependiente del entorno. Los datos experimentales obtenidos revelaron que PhaPAz es un tetrámero formado por interacciones de tipo coiled coil entre los monómeros. Estas características estructurales tambén fueron encontradas en otras phasinas y podrían estar relacionadas con su diversidad funcional. Se realizaron experimentos de actividad chaperona in vitro para dilucidar el mecanismo por el cual PhaPAz ejerce su efecto protector. PhaPAz demostró evitar la agregación térmica de la proteína Citrato Sintasa (CS) y facilitar el proceso de replegado de la enzima luego de la desnaturalización por métodos químicos in vitro. Estos experimentos mostraron que PhaPAz tiene actividad chaperona in vitro. Se utilizaron técnicas de microscopía de fluorescencia y de transmisión electrónica para analizar la localización intracelular de PhaPAz en cepas de E. coli productoras y no productoras de PHB con el objetivo de estudiar el rol de PhaPAz en el plegado de proteínas in vivo, el agregado de proteínas y la dinámica de formación de cuerpos de inclusión. PhaPAz colocalizó con los cuerpos de inclusión de PD, proteína que forma grandes y visibles agregados cuando es sobreexpresada en E. coli. Se observó una reducción en el número de cuerpos de inclusión cuando PD fue coproducida con PhaPAz o con la chaperona GroELS. Estos resultados demuestran que PhaPAz presenta actividad chaperona tanto in vitro como in vivo en E. coli recombinante, y sugieren que las phasinas podrían tener un rol protector general en los productores naturales de PHA. Estas observaciones hacen posible el uso de esta proteína en el desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas, como por ejemplo la producción de proteínas recombinantes y otros productos heterólogos en E. coli.

Se ha descripto que algunos ARNm de polen son sintetizados durante el desarrollo del polen y acumulados en grano de polen maduro deshidratado, para ser traducidos luego de la germinación del polen. Nuestra hipótesis es que la regulación de la acumulación de estos ARNm de polen pre-sintetizados está mediada por cuerpos citoplasmáticos. Para probar dicha hipótesis, analizamos la localización celular de algunos ARNm pre-sintetizados durante el desarrollo del polen utilizando el sistema MS2-CP. Utilizamos como sistema biológico a Arabidopsis thaliana que permite llevar a cabo un análisis genético, molecular y de desarrollo de la expresión específica de genes de polen. Por otro lado, estudiamos gránulos de estrés (SG) y cuerpos de procesamiento (PB) en polen maduro de Arabidopsis como posibles estructuras celulares donde estos ARNm pre-sintetizados polínicos puedan ser almacenados. En otra línea de estudio, caracterizamos cuerpos de cajal (CB) para investigar si su número y tamaño varían durante los procesos de división celular y diferenciación celular que ocurren en el desarrollo del grano de polen. Nuestros resultados demuestran la presencia de agregados de ARNm citoplasmáticos en polen maduro en líneas transgénicas que contienen el sistema MS2-CP. Validamos y cuantificamos estos agregados de ARNm usando un análisis automatizado de MATLAB. Luego verificamos si estos agregados de ARNm co-localizan con gránulos de estrés y/o cuerpos de procesamiento mediante el análisis de líneas transgénicas que expresan el sistema MS2-CP y a la vez proteínas marcadas de SG o PB. Hemos demostrado que uno de cada cinco agregados, aproximadamente, co-localiza con alguna de las proteínas marcadoras de PB, lo que sugiere que los PB son sitios de almacenamiento de los ARNm en granos de polen maduro. Además, analizamos de qué manera se afecta la presencia y la localización de los agregados citoplasmáticos en ausencia de los genes marcadores de SG y PB. Hemos determinado que dichas proteínas serían necesarias para la localización de los ARNm en acúmulos citoplasmáticos. Nuestros resultados además sugieren que los CB responden durante el desarrollo del polen a las diferentes necesidades fisiológicas de los distintos tipos de células gametofíticas masculinas. Estos resultados contribuirán a entender los mecanismos de regulación transcripcional y traduccional en granos de polen de Arabidopsis thaliana.

Las estrategias para poder clonar los genes involucrados en la síntesis, movilización o metabolismo del PHB en otras especies bacterianas abarcan 3 tipos: I) Complementación de cepas que no poseen actividad de alguna de las enzimas que intervienen en el camino biosintético del polímero. II) Hibridización de ácidos nucleicos utilizando sondas heterólogas de la zona conservada . III) Secuenciación directa de las proteínas de gránulo y construcción de sondas homólogas. Durante el desarrollo de mi tesis de investigación utilicé la estrategia de la secuenciación directa de las proteínas de gránulos. Para lograr esto era necesario saber que tipo de proteínas están asociadas al gránulo y comparar su patrón de corrida en PAGE con los patrones de corrida de otras especies y establecer cual era la probable PHB sintasa. El patrón de proteínas mostró 3 bandas intensas en el gel: una proteína de 22 kDa que cuyo extremo aminoterminal ya había sido secuenciado (Steinbüchel, dato no publicado). Está sería la proteína estructural de gránulo (fasina); las otras dos bandas son de proteínas de 40 kDa y 43 kDa. En cambio la proteína de 40 kDa, sería la PHB sintasa, debido a que se encuentra en gran cantidad el momento de recolección de las bacterias para analizar su patrón de proteínas, fue el de mayor acumulación de PHB. Por lo tanto procedí y logré el secuencimiento del extremo aminoterrninal de dicha proteína. Con las secuencias de las proteínas de 22 kDa y 40 kDa, diseñé dos sondas y con ellas realicé estudios de Southern tanto sobre ADN genómico como sobre plásmidos que contienen genes clonados de B. megaterium que intervienen en el metabolismo del PHB. Con estos experimentos se detectó un segmento de ADN cromosómico de B. megaterium que hibridaba con la sonda de fasina. Cuando se secuenció este fragmento se descubrió que contiene 3 genes que estuvieron involucrados en la transactivación de la Tiolasa II de E. coli. Dos de dichos genes mostraron, por comparación con secuencias proteínas y secuencias de ADN de los bancos de datos, que tenían una gran homología con un par de proteínas sensor-activador involucradas en la regulación del operón ato de E. col mediada por el complejo σ54 holoenzima RNA polimerasa. También mostraron una gran homología con otro activador de B. subtilis dependiente de σ54.El tercer gen mostraba homología con el gen pbt que codifica para la enzima Fosfobutiril transferasa (Pbt) en C. acetobutuylícum. Los análisis de la actividad enzimática de esta posible enzima Pbt de B. megaterium mostraron un patrón de expresión complejo: l) Sufre represión catabólica 2) Su pico de expresión se encuentra en el principio de la fase estacionaria 3) Se aumenta la expresión de este gen por la presencia de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina. Finalmente, mediante experimentos de expresión en E. coli, tanto de la enzima Pbt como del activador dependiente de σ54 clonados de B. megaterium, corroboré que dicho activador está involucrado en la transcripción del gen pbt.

Fil:Petroni, Eberto Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Existen diversos procesos sociales, políticos y culturales de las poblaciones humanas que pueden dejar huellas en su acervo génico. En consecuencia, el análisis del ADN constituye una herramienta complementaria para su estudio. En esta tesis se abordaron distintos aspectos de las poblaciones que habitaron el actual Noroeste Argentino (NOA) y el resto del Área Centrosur Andina en tiempos prehispánicos a partir del análisis del ADN antiguo, es decir, del material genético extraído de restos óseos. Utilizando al ADN mitocondrial como el principal marcador y a fin de contribuir al estudio de la dinámica y el estilo de vida de estas poblaciones, se emplearon dos escalas de análisis: local y regional. A nivel local, en la Quebrada de Humahuaca se intentó establecer: a) la procedencia de los habitantes de un sitio del Período Incaico, hallándose evidencias del origen local de una parte de la población, que habría sido probablemente relocalizada desde otros poblados cercanos; y b) las relaciones de parentesco entre individuos de dos asentamientos, obteniéndose indicios de que aquellos enterrados en un mismo recinto o unidad habitacional se encontraban emparentados. En una escala de análisis regional, se evaluó la variabilidad y la diferenciación genética entre distintas poblaciones prehispánicas del Área Centrosur Andina. Por un lado, no se encontraron evidencias de diferenciación entre poblaciones como las de los actuales territorios del NOA, norte de Chile y Bolivia. Por el otro, en líneas generales se observó la existencia de estructuración considerando toda el área analizada, sobre la que habrían incidido factores como diferencias temporales y las características particulares de cada población en cuanto a su interacción con otras. Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido poner a prueba hipótesis vinculadas al estilo de vida, los procesos migratorios y las interacciones entre distintos grupos, contribuyendo especialmente al conocimiento de las dinámicas poblacionales prehispánicas del NOA y del resto del Área Centrosur Andina.

El girasol es uno de los principales cultivos oleaginosos del mundo por su volumen de producción y composición en ácidos grasos insaturados. En promedio, durante los últimos cinco años, la producción mundial se ha mantenido estable concentrándose el 72% de la misma entre Argentina y la Unión Europea. A pesar de esto y debido a las condiciones de los precios internacionales y la productividad comparativa con otros cultivos, el área de producción se está desplazando a regiones más áridas a nivel mundial cobrando relevancia la incidencia de estreses abióticos como sequía, salinidad y bajas temperaturas. Pese a la importancia económica del girasol a escala mundial, el grado de avance de los conocimientos públicos sobre el genoma de girasol es limitado cuando se lo compara con cultivos como el arroz, el maíz, la soja, el tomate, el trigo, la papa, la cebada. Sin embargo, en los últimos cinco años, en paralelo al avance de este trabajo, se han iniciado distintos proyectos a nivel nacional e internacional orientados al análisis genómico de girasol con lo cual ha aumentado significativamente la disponibilidad de secuencias genómicas y de ADNc, con el consecuente impacto en el avance de las investigaciones y el conocimiento sobre esta especie. El objetivo de este trabajo es contribuir al conocimiento de las regiones codificantes del genoma de girasol a partir de una estrategia de genómica funcional que sirva como base para la caracterización transcripcional simultanea de los perfiles de expresión inducidos bajo condiciones de estrés y el desarrollo de marcadores funcionales. Para lo cual se abordo el desarrollo de un banco local de secuencias que se expresan o ESTs ("expressed sequence tags") diferenciales para distintos órganos y/o estadios de desarrollo de girasol y el desarrollo de una plataforma bioinformática para la caracterización de los perfiles transcripcionales de las mismas en respuesta a estrés abióticos. En una primera etapa se evaluaron distintas estrategias de secuenciación a pequeña y mediana escala para la identificación de genes diferencialmente expresados en girasol a partir de la generación colecciones de ADNc diferencial. La técnica utilizada se basó en la hibridación substractiva como herramienta para la identificación de genes diferencialmente expresados en un tejido definido, disminuyendo significativamente la redundancia en la secuenciación de clones que representan a genes abundantes y maximizando la detección de los transcriptos “raros” o poco abundantes. Esta estrategia posibilitó un incremento de la eficiencia de secuenciación dentro del marco de un proyecto genómico de pequeña escala que apunta a la identificación de genes de utilidad para propósitos de mejoramiento y la búsqueda de marcadores funcionales. Como resultado, se obtuvieron clonotecas diferenciales a partir de hoja, tallo, raíz y flor en dos estadios de desarrollo (R1 y R4). El uso de diferentes fuentes de ARN como objeto o “tester” y referencia o “driver” fue de utilidad para la selección y detección de transcriptos poco abundantes. La especificidad órgano- específica varió dentro de un rango de 75 a 100% de las secuencias no- redundantes (unigenes) dentro de cada clonoteca de ADNc. La clonoteca correspondiente al estadio R4 de flor fue la menos redundante con un 62% de secuencias únicas y la que aportó el número más elevado de secuencias nuevas de girasol. El análisis bioinformático se llevó a cabo mediante la instalación de un servidor local (INTA 01) conteniendo las herramientas de distribución pública para la edición, análisis y ensamblado de secuencias como Phred/Phrap, CAP3 y algoritmos de comparación de secuencias como BLAST y el desarrollo de BioPipeline® una plataforma desarrollada en entorno Windows para el análisis automatizado de secuencias utilizando los mismos programas y algoritmos mencionados anteriormente. La información de secuencias generadas fue depositada en la base dbESTs de NCBI para su distribución pública. Para el manejo local de esta información se desarrolló una base relacional de tipo ACeDB para la integración de la información generada y su anotación funcional. Sobre un total de 919 secuencias que fueron editadas y anotadas, 318 representan secuencias únicas. Las comparaciones contra bases de datos públicos arrojaron un valor del 60% de secuencias no-redundantes con similitud a secuencias conocidas. El número de genes novedosos predichos varió según la clonoteca analizadas, en un rango que va de 56% en las clonotecas de flor estadio R4 al 16% en las de flor R1. Las comparaciones con los ESTs de girasol depositados y reportados en bases de datos mostraron que 197 secuencias (59,9%) del total) representaban secuencias nuevas, sin similitud significativa con secuencias conocidas. Este enfoque fue exitoso respecto del aislamiento de un número significativo de secuencias reportadas asociadas en su función inferida (probable) a caracteres de importancia agronómica, procesos regulatorios y fisiológicos clave. En una segunda etapa se abordó la evaluación de la expresión relativa simultánea de los transcriptos correspondientes a las secuencias de la base de ESTs desarrollada bajo diferentes condiciones de estrés abiótico utilizando la tecnología de micromatrices de ADN. Se imprimieron los fragmentos representativos de los 318 unigenes anotados en las clonotecas previamente descriptas en micromatrices sobre soporte de vidrio. Se evaluaron tres muestras biológicas tanto para tratamiento de frío (estrés térmico), tratamiento de salinidad (estrés salino) y controles representados por plantas crecidas en condiciones regulares. Estos estreses fueron seleccionados considerando al girasol como una planta con grado intermedio-alto de sensibilidad a bajas temperaturas en la zona radicular, así como también particularmente susceptible al desarrollo en condiciones de alta salinidad. El análisis transcripcional permitió detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresión. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostró variación en sus niveles medios a través de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenció sobre- expresión respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrés (por frío o por salinidad). De manera análoga, 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observó una sub-expresión respecto del control en ambos tratamientos. Dentro del grupos 1 y 3, se detectaron perfiles de expresión diferenciales para ambos tipos de estrés, siendo la sobre expresión y/o sub expresión de los genes evaluados más pronunciada en respuesta al estrés por frío respecto al estrés por salinidad. Finalmente, surgieron 80 genes candidato en la separación de tratamientos de acuerdo a su p-valor en la prueba de comparación de medias por análisis de la varianza y su ubicación en la región periférica del plano de ordenación generado por los dos primeros ejes principales de un Análisis de Componentes Principales (ACP) de la matriz de expresión génica escalada gen a gen por la desviación estándar residual del análisis de la varianza. De estos genes, 7 fueron validados por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Real Time PCR), habiéndose obtenido patrones transcripcionales similares con ambas estrategias de análisis La diferencia en expresión génica fue analizada en relación al origen de las secuencias en evaluación. Las secuencias provenientes de la colección de hoja mostraron en general patrones de subexpresión génica en respuesta a ambos estreses (la mayoría corresponden a genes asociados al proceso de fotosíntesis) mientras que las secuencias aisladas de colecciones de tallo o flor en estadio R4 mostraron patrones de inducción génica frente a los mismos estreses. Si se considera que los cambios transcripcionales en respuesta a frío y salinidad fueron evaluados en hoja, estos resultados confirman la eficiencia de la técnica de SSH utilizada para la generación de las colecciones de ADNc órgano específicas y explica la alta relación de transcriptos que muestra cambios en su perfil en respuesta a estreses en relación a los que no varían su nivel transcripcional en las condiciones evaluadas. Durante la segunda etapa de este trabajo se realizó un análisis de los 80 genes candidatos, detectándose 48 como sobre o sub expresados frente a uno u otro estrés, indicando la implicancia de mecanismos regulatorios comunes a ambos estreses. Asimismo 17 y 12 genes se detectaron inducidos o sub expresados específicamente frente a un estrés y no frente al otro. De acuerdo al análisis funcional comparativo estos genes estarían involucrados en mecanismos de regulación incluyendo procesos de transcripción, traducción, degradación/plegado o interacción de proteínas o asociados a mecanismos de generación y procesamiento de especies reactivas de oxigeno. De estas secuencias, 12 corresponden a secuencias con funcionalidad desconocida. Sólo 3 de las secuencias analizadas en este trabajo mostraron patrones transcripcionales opuestos incluyendo una con similitud a un transportador de lípidos. La información generada a partir de la caracterización del banco de ESTs constituye por una parte una fuente de información sobre genes candidatos involucrados en mecanismos de respuesta a estreses abióticos que pueden ser incluidos en ensayos de complementación en plantas transgénicas modelo y asimismo permite identificar secuencias nuevas no descriptas anteriormente para el desarrollo de marcadores funcionales a ser utilizados en programas de mejoramiento asistido de este cultivo

Todos los animales que poseen simetría bilateral se encuentran definidos por dos ejes de simetría ortogonales, el eje anteroposterior (A-P) que corre de la boca al ano y un eje perpendicular a este, el eje dorsoventral (D-V). A pesar de la gran variedad de modos de desarrollo embrionario y formas finales encontradas en los animales, las redes regulatorias y factores de transcripción que dan origen a estos ejes se encuentran muy conservados. De aquí surge una pregunta central, cómo estas redes regulatorias tan conservadas crean tanta diversidad morfológica, se adaptan a nuevos ambientes y de qué manera las novedades evolutivas se incorporan en un sistema de patronamiento ya establecido. El eje DV es un buen sistema de estudio ya que se conoce en detalle en Drosophila melanogaster pero no en otros insectos. Los insectos además presentan una gran variedad de especies y modos de desarrollo embrionario lo que nos permite estudiar de qué manera las redes regulatorias se adaptan a novedades evolutivas y la existencia de varias técnicas que permiten testear el funcionamiento de los genes y sus interacciones. En este contexto hemos utilizado a Rhodnius prolixus como modelo para el estudio del establecimiento del eje DV en un embrión de banda germinal intermedia donde al final del desarrollo el embrión posee la misma forma que el adulto. Hemos estudiado en detalle el desarrollo embrionario de R. prolixus para una mejor comprensión de los patrones de expresión de los genes estudiados y su función. Además, se han buscado y anotado varios genes envueltos en la formación del eje DV: toll, dorsal, decapentaplegic, zerknült, twist y zelda. Mostraremos el patrón de expresión y los fenotipos resultado de ARNi parental de toll, dpp y dorsal, los cuales representan puntos clave en la regulación de la cascada D-V.

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales