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Introducción: El arsénico es un metaloide ampliamente distribuido en el ambiente el cual presenta potentes efectos tóxicos. La contaminación provocada por arsénico inorgánico (iAs) es uno de los mayores problemas sanitarios a nivel mundial. Si bien se han reportado efectos adversos del iAs sobre la función reproductiva, poco se conoce de sus acciones sobre la liberación hormonal y la fisiología adenohipofisaria. Objetivos: 1) Estudiar el efecto citotóxico del iAs sobre la fisiología adenohipofisaria y caracterizar los mecanismos de acción. 2) Investigar el papel del iAs como agente xenoestrogénico en la adenohipófisis y el útero. Resultados: 1) La exposición al iAs, a través del agua de bebida en diferentes concentraciones (5, 25 o 100 ppm) durante 30 días en ratas machos, disminuyó los niveles plasmáticos de prolactina (PRL) en forma dosis dependiente, mientas que la hormona luteinizante (LH) se vio afectada sólo con la máxima concentración utilizada. La administración del metaloide in vivo alteró la expresión del ARNm de genes de respuesta al estrés oxidativo en la adenohipófisis sugiriendo que, en estas condiciones, el iAs induce estrés oxidativo en la glándula. Confirmando los resultados in vivo, el iAs, en concentraciones micromolares, disminuyó la liberación de PRL en forma tiempo-dependiente sin afectar la de LH en cultivos primarios de células adenohipofisarias. Además, el iAs redujo la viabilidad celular adenohipofisaria, efecto debido principalmente a la inducción de apoptosis. Este proceso se caracterizó por un incremento de las especies reactivas del oxígeno, la despolarización del potencial de la membrana mitocondrial y un aumento en la expresión del ARNm de MT-1 y HO-1. El tratamiento con el antioxidante Nacetilcisteína previno el efecto citotóxico y la inhibición de la liberación de PRL inducida por iAs. 2) La administración del iAs a dosis bajas (0,1 ppm) durante 30 días a ratas hembras ovariectomizadas (OVX) indujo la aparición de proestros y estros respecto al control OVX. En la adenohipófisis, se observó un estímulo en la proliferación celular, especialmente de los lactotropos y un incremento en la secreción de PRL. Este metaloide también reguló la expresión proteica del REa y de su variante truncada. En el útero, la exposición al metaloide causó modificaciones citoestructurales mostrando un incremento del área glandular y de la altura del epitelio. Además, el iAs alteró la expresión del REa en las células epiteliales y en el estroma. Conclusiones: El iAs es un disruptor endocrino cuyos efectos varían con la dosis y el tiempo de exposición. A concentraciones micromolares, el iAs induce apoptosis e inhibe la secreción de prolactina. La generación de estrés oxidativo parece ser el principal mediador de los efectos tóxicos del metaloide. Por otro lado, a concentraciones más bajas, el iAs reproduce las acciones del estrógeno, estimulando la proliferación celular en tejidos hormona-dependientes.

Tesis presentada para optar al título de Magister Scientiae en el área Agricultura Intensiva en Zonas Aridas y Semiáridas de la Argentina, de la Universidad de Buenos Aires, en 2009

El metabolito activo de la vitamina D es el calcitriol o 1α,25(OH)2 vitamina D3 (1,25D). El 1,25D ingresa a la célula difundiendo a través de la membrana plasmática y se une a su receptor, el receptor de la vitamina D (VDR). Este complejo desencadena acciones rápidas, no genómicos (como la activación de vías de señalización MAPKs, y la generación de segundos mensajeros, como el aumento del Ca2+ intracelular) o efectos genómicos que requieren generación de nuevas proteínas. Dado que la mayor parte de los efectos del 1,25D reportados involucran al VDR y éste se expresa en la mayoría de los tejidos, esta hormona esteroide se considera pleiotrópica. En el laboratorio donde trabajo, se ha demostrado que el VDR se expresa en el músculo esquelético y que el tratamiento con 1,25D (10-9 M) es capaz de promover a proliferación y la activación de vías de señalización como las MAPKs, Akt, con la participación de Src, muy rápidamente, tanto en mioblastos proliferativos como en miotubos diferenciados. Por otro lado está ampliamente documentado que el 1,25D tiene efectos anti-proliferativos y pro-apoptóticos en varios tipos de cáncer. En este trabajo de Tesis Doctoral, se evidenció que en la línea de músculo esquelético normal C2C12, durante la fase proliferativa, el tratamiento con 1,25D (10-9 M) promueve la expresión del VDR y la activación de p38 MAPK y ERK 1/2, que promueven la expresión de las CDK 4/6. Más tarde, durante el arresto promotor de diferenciación, iniciado por el 1,25D, la expresión del VDR y la activación de la p38 MAPK son esenciales para inducir el aumento en la expresión de la ciclina D3, de los CKIs p21Cip1/WAF1 y p27Kip1, y del marcador de diferenciación muscular miogenina, el cual también requiere que la ciclina D3 se exprese. En las células C2C12 que están en la etapa de diferenciación temprana, en la fase de alineación (previo a la fusión celular para la formación del miotubo), la hormona esteroide 1,25D unida a su receptor tiene la capacidad de activar la tirosina quinasa no receptora Src y las MAPKs ERK 1/2 y p38MAPK, a tiempos cortos (hasta de una hora), sin embargo no es capaz de modificar la expresión de proteínas (como las ciclinas D1 y D3 o la caveolin-1). El rabdomiosarcoma (RMS) es el cáncer de tejido blando más común entre los niños y tiene características de músculo esquelético, a pesar de tener múltiples orígenes. La línea RD es una línea celular de rabdomiosarcoma humano, originada de biopsias de una paciente caucásica de siete años de edad. A pesar de la evidencia acumulada de los efectos antineoplásicos de la hormona esteroide 1,25D, en diferentes tipos de cáncer, solo existe un reporte de los efectos de este esteroide en RMS, en líneas diferentes a la línea RD.En esta Tesis Doctoral, se evidenció que las células RD expresan basalmente VDR y que el tratamiento con la hormona durante 24 y 48 horas promueve un incremento de este receptor. Además el 1,25D (10-9 M) promueve la activación de p38 MAPK, vía su quinasa upstream inmediata MKK 3/6 y Src a tiempos cortos en las células RD. De relevancia, se observó que la activación de p38 MAPK es necesaria para la activación de Src, pese a ser esta una quinasa upstream de las MAPKs. El tratamiento con 1,25D durante 72 horas provoca una marcada disminución en la expresión del VDR junto con una inhibición en la proliferación (ya que decrece la cantidad de células vivas y aumenta la expresión de p15INK4). Conjuntamente, la hormona no promueve la diferenciación celular (ya que no se observan cambios morfológicos y disminuye la expresión de marcadores de diferenciación tempranos) y estimula la apoptosis (aumentando la expresión de los mediadores ciclina D1 y CDK4 y causando picnosis mitocondrial y pérdida de la red mitocondrial).En conclusión, el metabolito activo de la vitamina D, el calcitriol tiene efectosopuestos en el músculo esquelético normal y el transformado, ya que en el primero promueve la proliferación seguida de un arresto pro-diferenciativo, mientras que en RMS es capaz de inducir la apoptosis.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal- IMBIV-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba-2015 - 128 h. con Apéndices + CD. tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicación Derivada de la Tesis. Abstract en español e inglés.

El mantenimiento de la salud intestinal es complejo y tiene sus bases en un delicado balance entre la clase de dieta, la flora comensal intestinal y la mucosa, que incluye el epitelio digestivo y la capa de moco gástrico que lo recubre. Interponiéndose en este equilibrio, se encuentra la presencia de bacterias entéricas potencialmente patógenas, su proliferación y su actividad metabólica, las cuales pueden perturbar la función digestiva, conduciendo a diarrea, tasas de crecimiento pobres e incluso la muerte. Esta clase de infecciones entéricas son comunes en lechones y otros animales de temprana edad (Montagne et al., 2003). La dieta tiene una importante influencia en la salud intestinal, pudiendo provocar tanto efectos beneficiosos como perjudiciales en el animal. La fibra dietaria es el componente al cual se le adjudica una de las mayores capacidades para realizar modificaciones en el ambiente intestinal (Montagne et al., 2003). Se trata de una heterogénea clase de compuestos que no son hidrolizados por las enzimas digestivas de los animales no rumiantes, y consecuentemente son los sustratos principalmente utilizados en procesos de fermentación bacteriana en el colon. Hasta hace unos años, se consideraba que la fibra era un factor negativo en los alimentos para lechones en primeras edades. Los alimentos de iniciación existentes en el mercado poseen por lo general bajos contenidos de fibra bruta y el cambio de un alimento a otro con mayor contenido fibroso resulta a menudo en reducción del consumo, una menor digestibilidad de nutrientes y un aumento en la incidencia de episodios diarreicos (Mosenthin et al., 1999). Sin embargo, estudios recientes han demostrado que no siempre la fibra es la culpable de esta clase de procesos (Gill et al., 2000), siendo en varios países una práctica cada vez más frecuente incluir fibras solubles e insolubles en alimentos balanceados para lechones con el objetivo de reducir la problemática digestiva en destetes y transiciones (Lizzardo et al., 1997; Gill et al., 2000; Schiavon et al., 2004; Mateos et al., 2006). Existe discrepancia entre los resultados obtenidos por parte de los distintos autores en base a los beneficios o perjuicios de la inclusión de fibra, y hoy en día no hay consenso entre los investigadores acerca del tipo de fibra a incluir en los alimentos de primeras edades ni en la duración temporal de dicha inclusión.

Esta tesis presenta un estudio experimental sobre la cinética de generación, solvatación y recombinaci ón de electrones en metanol, acetonitrilo y amoníaco (líquido y supercrítico). Los electrones se generan en el fuido por fotoexcitación ultravioleta de aniones ioduro (especie donante), en su forma libre y conformando pares iónicos con los contraiones amonio, tetraetilamonio y tetra-n-butilamonio (que representaremos NR4+). La energía absorbida desencadena un proceso de transferencia de carga, mediante el cual uno de los electrones 5p del ión ioduro es promovido verticalmente al entorno del solvente (proceso CTTS). En una centena de femtosegundos, los electrones se termalizan en el fuido y toman diferentes canales de desactivación, algunos de los cuales perduran por varios cientos de picosegundos. Este trabajo se focaliza en estudiar el comportamiento dinámico de electrones de baja energía (aquellos generados por absorción de un único fotón ultravioleta), los cuales no logran alcanzar la banda de conducción del fuido y por lo tanto permanecen próximos al sitio de absorción de luz. El canal de desactivación elegido por el electrón dependerá de la estructura de solvatación de la especie donante y de la interacción ejercida por el contraión. El electrón podrá: (i) recombinarse con el átomo de iodo progenitor, o (ii) escapar de dicho entorno transform ándose en una especie solvatada. A fin de estudiar la estructura de solvatación de los distintos donantes de electrones se realizaron experimentos de espectroscopía de absorción UV-vis, en régimen estacionario, en amoníaco (líquido y supercrítico). Para ello, se emplearon celdas estancas especiales y un sistema que permite la manipulación del fuido a alta presión. Asimismo, se llevaron a cabo simulaciones de dinámica molecular clásica para todos los sistemas donante-solvente estudiados. Se caracterizó, además, la evolución temporal de la absorbancia NIR del electrón mediante experimentos de espectroscopía láser de bombeo-muestreo, con una resolución temporal de 200 fs. Los sistemas (NR4+I-)-metanol, (NR4+I-)-acetonitrilo y (NR4+I-)-NH3 se estudiaron en celdas ópticas convencionales y en celdas de alta presión. La excitación se lleva a cabo por medio de un pulso en el ultravioleta (bombeo, o pump en inglés) y la absorción transitoria de las especies generadas se monitorea tras un pulso en el infrarrojo cercano (muestra, o probe en inglés), controlando el retardo entre ambos. Los cambios registrados en el perfil temporal de absorbancia permitieron caracterizar el comportamiento cinético del sistema en las distintas condiciones de trabajo.

Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipo celular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, las pruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que pueden obtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embriones y con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lo tanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante para mejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción con factores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factores inducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso de reprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticas humanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, los hemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condiciones de generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación, moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir de ello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemos cultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fide de las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estado indiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro, e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhiben características morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios de células madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares en cultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estado pluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad de colonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con las colonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estado pluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas en hipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando las colonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, pero se indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa de proliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectores retrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células a reprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en los plásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a las proteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad de activación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectores generados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posible efecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en la célula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muerte celular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlar debido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con el agente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducir con estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollo de protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia. PALABRAS CLAVE células madre, células madre embrionarias humanas, células madre pluripotentes inducidas, hipoxia celular, reprogramación nuclear, pluripotencia, estado pluripotente, diferenciación

El peso al nacer es una de las medidas más utilizada como proxy de la salud y bienestar infantil en la literatura económica. Aquellos niños con bajo peso al nacer (LBW), convencionalmente definido como menos de 2500 gramos, suelen experimentar efectos severos sobre la salud, la mortalidad, la morbilidad y la discapacidad. Por otro lado, el bajo peso al nacer también se traduce en costos sustanciales en el sector de la salud e impone una carga significativa sobre la sociedad en su conjunto. El desarrollo corporal de las madres al igual que su estilo de vida determinarán el peso del bebé al momento de nacer. Este estudio se centra en el desarrollo de la vida fetal y explora cómo la desnutrición en el útero afecta al peso al nacer y durante los primeros años de vida mediante el uso de las fechas exactas de nacimiento de los niños menores de 5 años y la explotación de la naturaleza calendárica de la incidencia de las déficits nutricionales derivadas de la exposición con el mes de ayuno musulmán que ocurre durante el Ramadán. La estrategia de identificación econométrica utiliza a las variaciones en el tiempo de exposición al Ramadán durante la gestación y la religión para identificar el efecto el peso.

Fil:Rubinstein, Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La actividad física ha estado presente en la vida diaria del hombre a lo largo del tiempo, modificándose su significancia dependiendo del momento socio-cultural que fue transitando. En las últimas décadas, el ejercicio de baja intensidad ha sido utilizado como uno de los tratamientos más efectivos para prevenir distintas patologías ya que reduce factores de riesgo cardiovasculares y la actividad del sistema nervioso simpático. Sin embargo, no es claro si los efectos benéficos del ejercicio sobre la función cardíaca y al menos algunas de las variables que regulan el remodelamiento ventricular post ejercicio, están relacionados con la intensidad del mismo. Por otro lado, si bien se conoce que durante el ejercicio hay una activación del sistema autónomo simpático, se desconoce si una sobreestimulación de éste modifica las respuestas obtenidas en condiciones normales. Por estos motivos, nuestro objetivo fue estudiar el efecto del ejercicio intenso y moderado sobre la función ventricular basal sistólica y diastólica y su respuesta al estímulo β-adrenérgico, así como también sobre variables histológicas que pueden modificar el remodelamiento ventricular post ejercicio. Para estudiar el efecto de la sobreestimulación simpática, utilizamos un modelo de ratón transgénico con sobreexpresión específica cardíaca de la proteína Gsα, que tiene la característica particular de inducir un estado de hiperactividad simpática, que se traduce en aumento de la frecuencia cardíaca y de la contractilidad. En este estudio, se utilizaron dos líneas de ratones machos de 3 meses de edad, una cepa normal no transgénica (noTG) y otra de ratones transgénicos (TG) con la característica mencionada. Se utilizó un protocolo de natación, por ser un tipo de ejercicio mixto, y fue realizado de forma grupal para generar un nado intenso y constante a lo largo del tiempo de protocolo. Se utilizaron dos intensidades de ejercicio, uno intenso (90 minutos de nado dos veces al día, 6 días a la semana por 4 semanas) y otro moderado (90 minutos de nado una vez al día, 6 días a la semana por 4 semanas). Por lo tanto, se realizaron 6 grupos experimentales: 2 grupos control sedentario (noTG y TG), 2 grupos con ejercicio intenso (noTG y TG) y 2 grupos con ejercicio moderado (noTG y TG). Una vez finalizados los protocolos, se realizó la evaluación de la función ventricular “in vivo” e “in vitro" basal, sistólica y diastólica, como así también de la reserva miocárdica (con isoproterenol). Posteriormente a la eutanasia de los animales, se calcularon los índices de hipertrofia, se realizó el análisis histológico del colágeno intersticial (colorimetría), la densidad capilar (inmunomarcación), el área de los miocitos (fluorescencia) y la expresión de la proteína Akt (western blot). Los resultados obtenidos mostraron que la función ventricular evaluada en condiciones basales estuvo conservada para ambas intensidades de ejercicio. Sin embargo, se observó una importante disminución en los animales noTG con ejercicio intenso, de la reserva miocárdica no sólo inotrópica, sino también cronotrópica y lusitrópica en el ejercicio intenso tanto “in vivo” como “in vitro", a diferencia del moderado, que no tuvo modificaciones significativas respecto al sedentario. Fue interesante observar que la realización del ejercicio intenso en los animales TG con la hiperactividad simpática, atenuó significativamente la alteración deletérea de la reserva miocárdica, sugiriendo un posible efecto benéfico. Desde el punto de vista estructural, no se detectó la presencia de fibrosis en ninguno de los grupos experimentales, mientras que la densidad capilar estuvo significativamente aumentada en los animales con ejercicio moderado, sin modificación significativa con el ejercicio intenso. El área de los miocitos, al igual que los índices de hipertrofia, aumentaron en los dos grupos de ejercicio intenso y se observó levemente aumentado aunque no significativamente en el grupo noTG con ejercicio moderado. Esta variable no se modificó en el grupo de ratones TG. Finalmente, la expresión de la proteína Akt no mostró cambios en ninguno de los 6 grupos experimentales. Por lo menos en nuestro conocimiento, no fue mostrado previamente que el ejercicio intenso puede inducir una marcada reducción de la reserva miocárdica no sólo inotrópica sino también cronotrópica y lusitrópica. Estas limitaciones al aumento no sólo de la contractilidad, sino también al llenado ventricular y al aumento de la frecuencia cardíaca podría limitar severamente la capacidad funcional miocárdica de pacientes que realizan esta intensidad de ejercicio. Por otro lado, también detectamos, que la hiperactividad simpática asociada al ejercicio, podría ser una herramienta útil para atenuar esta disfunción miocárdica. Con los datos obtenidos en el presente estudio no podemos afirmar si la hipertrofia inducida por el ejercicio intenso en nuestras condiciones experimentales es del tipo fisiológica o patológica. La severa disminución de la reserva miocárdica, si bien es compatible con un tipo de hipertrofia no adaptativa o patológica, no alcanza para definir qué tipo de hipertrofia induce esta intensidad de ejercicio, ya que por otro lado, otras variables como la ausencia de fibrosis o la conservación de la densidad capilar, sugieren una hipertrofia adaptativa. La falta de modificación de la proteína Akt, relacionada con la hipertrofia fisiológica, tampoco permite llegar a una conclusión definitiva. Debido a la originalidad de los resultados obtenidos, es importante continuar con las líneas de investigación relacionadas con el ejercicio para esclarecer los interrogantes que surgen del presente estudio. Finalmente, sería interesante continuar la investigación con diversos grupos de mayor cronicidad de ejercicio y de desentrenamiento, buscando la reversibilidad de la hipertrofia y de la disminución de la reserva contráctil encontrada tanto “in vivo” como “in vitro", para determinar la naturaleza de la hipertrofia desarrollada. El campo de investigación en el ejercicio tiene importantes proyecciones debido a estudios recientes en deportistas de alto rendimiento, como así también en la sobrevida de enfermedades cardiovasculares y del sedentarismo.