Catálogo de publicaciones

En esta tesis se realiza el estudio de las prácticas de recolección de vegetales silvestres que llevaron a cabo los grupos cazadores recolectores de la costa norte de Santa Cruz (CNSC) entre el Holoceno medio y tardío. El proyecto arqueológico de la CNSC es dirigido por la Dra. Alicia Castro y abarca el estudio arqueológico de las sociedades que habitaron el litoral marino en el norte de esta provincia. La escala espacial comprende de norte a sur, el límite interprovincial de Chubut y Santa Cruz hasta la localidad de bahía Laura. En sentido este-oeste abarca la franja litoral de costa propiamente dicha y hacia el interior un territorio de extensión variable que se ha denominado franja intermedia. Los resultados arqueológicos más relevantes del proyecto CNSC evidencian un aprovechamiento intensivo tanto del litoral marino como de sus recursos faunísticos, desde el Holoceno medio al tardío (Castro et al. 2003, Zubimendi et al. 2011). Se han registrado diferentes estrategias de uso del espacio por parte de estos grupos humanos en relación con los recursos que el sector en particular ofrecía (Zubimendi 2010). En este contexto, desde un enfoque paleoetnobotánico, se propone en la presente tesis analizar la interacción entre los grupos cazadores recolectores y las plantas a través de las prácticas de recolección. Estas últimas se definen a partir de la selección, obtención, gestión y consumo de plantas silvestres. Las hipótesis que guiaron esta investigación son: que las sociedades cazadoras recolectoras de la CNSC utilizaron y consumieron plantas silvestres. Asimismo, que en la interacción hombre-planta existieron criterios organolépticos, de las propiedades biofísicas de la madera, simbólicos y de disponibilidad que definieron la selección y recolección de plantas dentro de las sociedades cazadoras recolectoras de la CNSC. En este sentido que la recolección de vegetales silvestres se desarrolló en relación a otras estrategias de subsistencia y movilidad de los grupos que habitaron la CNSC. Por último, que estas sociedades desarrollaron procesamientos poscolecta de los vegetales a través de una tecnología adecuada. Para contrastar estas hipótesis se utilizó una aproximación holística y, por lo tanto se estudiaron distintas líneas de evidencias. En primer lugar, se recopilaron fuentes bibliográficas del siglo XVI al XXI, a partir de las cuales se extrajeron categorías referidas a las prácticas de recolección desarrolladas por los distintos grupos que habitaron Patagonia, los usos de las plantas, el procesamiento de las mismas y los agentes de recolección en el contexto histórico en el que se produjo esa información. Se realizaron entrevistas etnobotánicas a pobladores locales de la ciudad de Puerto Deseado y la localidad de Tellier. Dichas entrevistas fueron abiertas, semiestructuradas a través de las cuales se analizaron las dimensiones: prácticas de recolección, categorías de uso de plantas, sistemas de clasificación y transmisión de conocimiento. Se desarrolló la observación participante y colecta de ejemplares en las recorridas con tres informantes por las chacras y la ría Deseado. En tercer lugar, se recopilaron publicaciones científicas sobre el registro arqueobotánico de Patagonia continental argentina y se analizaron los resultados expuestos en ellas. En este sentido, se tuvo en cuenta la identificación taxonómica del resto recuperado, tipo de restos (macro o microvestigio), estado de conservación (i.e. seco, carbonizado), período temporal y ubicación espacial del hallazgo. Esta información permitió desarrollar criterios amplios para la elaboración de la colección de referencia. Esta última se presenta en dos secciones: una conformada por macrorrestos vegetales (tallo, hoja y frutos) en la que se desarrolla además un protocolo experimental de carbonización controlada para la interpretación de los restos antracológicos. La otra sección, presenta el material de referencia de microvestigios (tejidos de frutos, hojas y tallos). En relación a los macrorrestos vegetales, se identificaron partes leñosas y no leñosas de 10 sitios arqueológicos de tres sectores: Golfo San Jorge, Cabo Blanco y Punta Medanosa. Es importante mencionar que el registro arqueobotánico recuperado proviene de distintos tipos de sitios: alero, cueva, a cielo abierto y conchero. En relación a los procesamientos poscolecta, específicamente la molienda se analizaron publicaciones científicas de arqueología de Patagonia continental Argentina con menciones sobre estos instrumentos. Se extrajo la siguiente información: sitio, contexto, cronología, materia prima, existencia de análisis de adherencias, presencia /ausencia de microrestos y su identificación. Posteriormente se realizaron prospecciones asistemáticas sobre el sector sur de la ría Deseado donde se tomaron muestras in situ y se recuperó un artefacto de molienda que fue analizado en el laboratorio. De este último se tomaron muestras a través del raspado y pipeteado con agua desmineralizada. De la colección Museo del Hombre y su Entorno (Caleta Olivia) se analizaron cinco instrumentos a partir de la toma de muestras in situ. Los resultados obtenidos permitieron identificar que las familias con mayor cantidad de taxa utilizados y mencionados a través de las distintas líneas de investigación (i.e. fuentes documentales, etnobotánica, registro arqueobotánico de Patagonia y registro arqueobotánico de CNSC) fueron principalmente: Asteraceae y Fabaceae. En las fuentes documentales además de ambas familias se mencionaron con mayor frecuencia taxa de Apiaceae, mientras que en las entrevistas etnobotánicas también predominó Lamiaceae. En el registro arqueobotanico de Patagonia predominó, además de las anteriores, Poaceae y en el caso de CNSC, a través del registro antracológico, además de Asteraceae predominaron Anacardiaceae, Berberidaceae y Solanaceae. En cuanto a las categorías de uso, en las fuentes documentales el 35,4% de los taxa mencionados para un único fin correspondió a la categoría de uso alimenticia, el 22,2% respondió a medicinal y el 19,2% fueron plantas multipropósito. En relación a las entrevistas etnobotánicas para las localidades de Tellier y Puerto Deseado, el 47% de los taxa mencionados se clasifican en categorías de uso medicinal, mientras que el 27% combustible y el 15% multipropósito. Es notable la disminución de la categoría de uso alimenticia que respondería a la incorporación de dietas basadas en productos industriales y manufacturados. En el caso del registro arqueobotánico de Patagonia analizado desde de las publicaciones científicas existentes, se deduce que no es posible cuantificar la recuperación de taxa por categoría pero sí inferirlas: alimenticias, cestería, combustible, y artefactos en madera. En este caso es significativa la ausencia de la categoría medicinal. Para CNSC los macro y microrrestos recuperados permitieron obtener información acerca de usos relativos a la categorías combustible, alimenticia, artefactos en madera y posiblemente medicinal. La evidencia recuperada para CNSC, a partir de la identificación de 11 familias y 16 taxa: Adesmia, Atriplex/Suaeda, Berberis, Bulnesia, Chuquiraga, cf. Cercidium, cf. Grindelia, Colliguaja, Discaria, Ephedra, Lycium, Pinus, Prosopidastrum, Prosopis contrasta en forma positiva la hipótesis de que los cazadores recolectores utilizaron y consumieron plantas silvestres. Para el estudio de la interacción de los grupos cazadores recolectores y las plantas silvestres en CNSC, se generó un modelo a partir del cual se registraron criterios de selección de distintos grupos y poblaciones de Patagonia continental argentina (fuentes bibliográficas) y las entrevistas etnobotánicas de Tellier y Puerto Deseado. Se discutió el valor de la analogía y de qué manera podía ser utilizada en las inferencias del registro arqueológico. Se registraron los criterios de selección para las plantas silvestres en la esfera de precolecta y colecta que estarían asociados principalmente a las características organolépticas de las plantas (i.e. aroma, sabor, color y textura). En el caso de las plantas combustibles los criterios registrados en las entrevistas a pobladores locales fueron: facilidad para hacer brasa, duración de la brasa, poder calórico, facilidad para el encendido, producción de humo, disponibilidad de la especie. A través de los estudios anatómicos del registro antracológico, se observó que los leños de la estepa arbustiva del Golfo San Jorge presentaron por un lado, una producción de resinas y aceites esenciales que podrían haber funcionado como caracteres organolépticos para los grupos cazadores recolectores. Por otra parte los taxa con mayor densidad de carbones en los fogones y carbones dispersos fueron los de mayor dureza, capacidad de producción de brasa y duración de la misma (i.e. Schinus, Berberis ) así como también de rápido encendido (ricos en resinas) y corta duración (i.e. Senecio/Baccharis, Lycium). En otros casos por el contrario, los taxa seleccionados son característicos por su rápido consumo y producción de ceniza (i.e. Atriplex/Suaeda). Se considera posible inferir la selección de estos taxa a partir de las propiedades de las maderas y criterios organolépticos. También se concluyó que los taxa utilizados en los fuegos no variaban en relación al sitio alero, cueva, conchero o a cielo abierto sino que respondían a actividades específicas para las que fuera elaborado el fogón. Se discutió la funcionalidad de los fogones a partir de la termoalteración de restos malacológicos (i.e. sitio 112, Las Hormigas) y restos líticos (i.e. El Oriental), entre otros. Se discute a partir de los resultados antracológicos las estrategias de movilidad y subsistencia de los grupos cazadores recolectores del Holoceno medio y tardío, siendo utilizadas en todos los casos leñas disponibles alrededor de los sitios, pero que los taxa fueron seleccionados de acuerdo a la funcionalidad del fogón y de las actividades desarrolladas en los sitios. Es importante destacar la selección de la madera de Berberis para la confección de un artefacto de madera, fragmento de arpón, que fue recuperado junto a otros seis arpones en hueso. Hallazgos importantes para discutir la tecnología de captura de pinnípedos y peces (en el caso del arpón de madera) asociada a rompecráneos para el Holoceno tardío donde la costa fue habitada con mayor intensidad. También se registraron para CNSC artefactos potencialmente utilizados en el procesamiento poscolecta de recursos vegetales silvestres. La recuperación de microvestigios de dos de los instrumentos permitió la identificación de dos taxa Prosopidastrum globosum y aff. Prosopis, resultados que estimulan a ampliar la muestra analizada. Los resultados obtenidos permiten inferir que los grupos cazadores recolectores que habitaron la CNSC gestionaron los recursos vegetales silvestres durante el Holoceno medio y tardío.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

Los bacteriófagos que infectan bacterias ácido lácticas (BAL) son el principal problema de fallas en la fermentación generando grandes pérdidas económicas. Lactobacillus casei resulta de especial interés porque además de contribuir con las propiedades organolépticas del producto final, muchas cepas presentan propiedades probióticas y son parte de productos comerciales. El uso de las mismas es el resultado de años de investigación que valida los supuestos beneficios en los alimentos. Debido a esto, la infección por fagos de estas cepas específicamente elegidas es perjudicial ya que no pueden ser reemplazadas con facilidad. En esta tesis estudiamos dos aspectos fundamentales de la relación fago-bacteria en Lactobacillus casei. Por un lado, la caracterización a nivel genómico y proteómico de los fagos Lactobacillus casei J-1 y PL-1 con particular énfasis en el aparato de reconocimiento del receptor o placa base a nivel estructural y funcional. Por otro, la presencia de profagos presentes en L. casei BL23 con el objetivo de evaluar el riesgo en la generación de fagos con capacidad infectiva en la industria láctea. Las placas base ubicadas en la punta de la cola son grandes complejos multiproteicos conformados por un ensambaje de seis proteínas distales de la cola (Dit), tres proteínas de la cola asociadas a lisinas (Tal) y un número variable de proteínas de unión al receptor (RBPs) que reconocen estructuras presentes en las envolturas bacterianas. Sin embargo, la secuenciación de los fagos J-1 y PL-1 ha mostrado que carecen de las canónicas RBPs. En su lugar, hemos demostrado que la Dit, hasta ahora sólo descripta como estructural, cumple un rol en el reconocimiento del receptor siendo la ramnosa al menos uno de los azúcares reconocidos por estos fagos. En la secuencia de Dit de J-1 y PL-1 existen dos inserciones ausentes en las “clásicas” Dits. La primera inserción presenta homología a módulos de unión a carbohidratos (CBMs, en este caso CBM1) mientras que para la segunda no se encontró similitud. La resolución de la estructura por rayos X de este dominio reveló un plegado similar a CBMs y se lo denominó CBM2. Con el objetivo de descifrar la función de estos módulos, se realizaron ensayos de unión a las bacterias y de inhibición de la adsorción que demostraron que el CBM2, pero no el CBM1, era el responsable del reconocimiento. Ensayos con el polisacárido de pared (CWPS) rico en ramnosa purificado de L. casei BL23 inhibieron la unión del CBM2 a las bacterias. La reconstrucción por microscopía electrónica de la placa base de los viriones enteros muestra que el CBM2 se encuentra en la periferia del complejo, óptimo para reconocer al CWPS. Análisis de secuencia revela que estas Dit evolucionadas están conservadas en fagos que infectan BAL. En resumen, estos resultados identifican a las Dit evolucionadas como los antireceptores en los fagos J-1 y PL-1. A su vez, generando nanoanticuerpos que reconocen al complejo Dit y la región N-terminal de Tal se mostró que uno de ellos bloquea la infección. Por otro lado, Tal tiene la capacidad de hidrolizar el peptidoglicano bacteriano que permitiría la inyección del ADN. Los fagos pueden encontrarse no solo en los sustratos usados como materia prima sino también como profagos en las propias cepas iniciadoras. La inducción de profagos y generación de virus con potencial de infectar otras cepas es un riesgo en la industria láctea. Hemos identificado 3 profagos completos (PLE1, PLE2, PLE3) en el genoma de L. casei BL23. Usando PCR cuantitativa, mostramos que 2 de ellos se inducen aunque con distintas cinéticas (PLE2 y PLE3). Según datos de secuenciación, microscopía electrónica y espectrometría de masa, al menos uno forma un virión potencialmente infectivo. Análisis estructural de las placas base de los profagos muestra nuevamente la presencia de CBMs en las proteínas Dit. Estos resultados resaltan la relevancia de los CBMs en las Dits evolucionadas en los primeros pasos de la infección y sugieren que deberían considerarse como dispositivos bona-fide de adhesión y no solo como proteínas meramente con función estructural como habían sido descriptas hasta hoy. El estudio del complejo multi-proteico involucrado en el reconocimiento al huésped y conservado en fagos que infectan cepas de BAL junto con el estudio de la inducción de profagos aporta datos de relevancia que podrían utilizarse para desarrollar estrategias anti-fágicas en la industria láctea.

El cultivo de soja [Glycine max (L.) Merr.] tiene una amplia difusión y ocupa el cuarto puesto en rendimiento a nivel mundial detrás del arroz, maíz y trigo; EE. UU. y Arg, son el primer y tercer productor mundial de soja en el mundo, respectivamente. Ambos países poseen una amplitud de ambientes diversos en cuanto a clima (precipitaciones, fotoperiodo, temperaturas, etc.) y suelo que permiten evaluar un gradiente importante de GM. Todos los años se evalúan en ensayos comparativos de rendimiento multi-ambientales (ECR) diversas variedades en distintos países alrededor del mundo. El objetivo de los ECR es no solo evaluar variedades sino también la identificación de mega-ambientes. Aunque el rendimiento de un genotipo es el resultado combinado de los efectos del G, el E y la interacción GE, solo G y GE son relevantes para la evaluación de las variedades y la identificación de mega-ambientes. En este trabajo se evaluaron en ECR en ambientes de EE. UU. y Arg. variedades de soja con un rango de madurez entre 3.7 a 4.9 durante dos campañas en cada país. En EE. UU. se agruparon las variedades en GM “cortos” (3.7 a 4.4) y otro GM llamado “largos” (4.2 a 4.9). En los ambientes de Arg. también se registraron las variables días a R1, días a R8, altura en R8 (cm), vuelco (escala) y peso de 1000 granos (gr). Los objetivos del trabajo fueron 1) estimar los componentes de variancia de G, E y GE para la variable rendimiento en grano, 2) mediante gráficos biplot GGE estudiar los efectos de G y e interacción GE y existencia de mega-ambientes entre ambos países, 3) identificar genotipos estables y con buena adaptación y 4) caracterizar los ambientes de Arg. y los genotipos utilizados mediante las variables fenotípicas evaluadas. Los resultados del análisis de variancia mostraron que para ambos grupos (“cortos “y “largos”) la magnitud de la interacción GE respecto a G no justifica dividir la región en estudio en distintos mega-ambientes. Los ambientes de Estados Unidos y de Argentina mostraron un patrón de heredabilidad similar, una correlación positiva y mega-ambientes comunes, permitiendo concluir que existen ambientes comunes para seleccionar variedades para ambos países para el rango de madurez empleado. Se identificaron genotipos estables y adaptados a la región. Los resultados obtenidos para caracterizar los genotipos en los ambientes de Arg. permitieron concluir que el comportamiento de las variedades con germoplasma seleccionado para los ambientes de EE. UU. se comportó de manera similar según su GM con variedades locales de Arg.

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causa la principal enfermedad que afecta al maíz en la Argentina. Su genoma consiste en diez segmentos de ARN de doble cadena (S1 a S10) que codifican para un total de trece proteínas. El virus es transmitido de manera persistente y propagativa por insectos de la familia Delphacidae. Luego de adquirir el virus, sólo una pequeña proporción de los insectos vectores pueden transmitir la enfermedad al alimentarse de plantas sanas. Se desconocen aún las bases moleculares de la transmisión de MRCV y en general de las funciones que las proteínas virales cumplen durante la infección. Para establecer si existe una correlación entre la acumulación viral y la transmisión, se desarrolló un protocolo útil para la cuantificación de MRCV u otros ARN endógenos en insectos individuales mediante RT‐qPCR. Se optimizaron los pasos a seguir desde el almacenamiento de muestras hasta la cuantificación viral. Debido a que la técnica de RT‐qPCR requiere la previa validación de controles internos invariables en los tratamientos a estudiar, se seleccionaron, clonaron y secuenciaron 7 genes de mantenimiento del delfácido transmisor Delphacodes kuscheli y se evaluó la estabilidad de su expresión durante la infección con MRCV. Se determinó que, de los 7 genes estudiados, el gen de la ubiquitina es el más establemente expresado y por lo tanto adecuado para ser utilizado como control interno de referencia. La plataforma desarrollada no sólo permitirá la cuantificación precisa del título de MRCV en individuos D. kuscheli, sino que además abre el camino a futuros estudios del cambio en la expresión de genes endógenos de los insectos infectados con MRCV. Esto permitirá aportar datos moleculares para lograr una compresión más integral de la interacción MRCV‐delfácido vector. En paralelo, se decidió estudiar la función que cumplen las proteínas de MRCV durante la replicación viral en el insecto expresándolas en células Sf9 (de insecto no hospedante) y se analizó su localización subcelular por inmunofluorescencia y en células vivas. Se determinó que tanto las proteínas estructurales P3, P4 y P8 como la proteína no estructural P7‐1, se distribuyen en el núcleo y el citoplasma celular. Dado que el tamaño de estas proteínas excede el límite permitido por el complejo del poro nuclear, los resultados sugieren que las mismas serían transportadas activamente al núcleo celular. Asimismo, se observó que la proteína P5‐2 se localiza exclusivamente en el núcleo. Es posible que estas proteínas de MRCV capaces de ingresar al núcleo celular jueguen un rol en la regulación transcripcional de las células del hospedante. Se observó que la proteína P5‐1 posee una distribución citoplasmática heterogénea de aspecto granuloso y que dicha distribución se torna homogénea en ausencia del tripéptido carboxilo terminal TKF, el cual es un presunto motivo de unión a proteínas PDZ o de importación a peroxisomas. Por otro lado, se determinó que P6 forma grandes cúmulos perinucleares amorfos y es capaz de relocalizar parte de la tubulina celular a éstas formaciones. Esto sugiere un posible rol para P6 en la formación del material fibrilar que se observa en células de insecto y planta infectadas con MRCV. La proteína P9‐2 fue capaz de localizar en la membrana plasmática e indujo la formación de filopodios membranosos en la superficie de las células, por lo que esta proteína podría estar involucrada en el transporte del virus a través de la membrana durante la infección del insecto vector. Por su lado, la proteína de cápside externa P10 fue capaz de localizar en el retículo endoplasmático y de colocalizar completamente con tubulina, sugiriendo que el MRCV explota el sistema de secreción y el citoesqueleto de tubulina para el ensamblado y/o transporte viral. Finalmente, P9‐1 fue capaz de formar inclusiones citoplasmáticas conspicuas similares a cuerpos de inclusión virales (VIBs) o viroplasmas. A continuación, se utilizaron algunas combinaciones de fusiones fluorescentes de proteínas del MRCV para analizar su colocalización subcelular. No se logró observar colocalización entre la proteína P9‐2 y P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 o P10. Tampoco se observó colocalización entre P9‐1 y P10 o P5‐2. Por otro lado, se determinó que P6 colocaliza con P10, P9‐1 y P7‐2, indicando que P6 podría cumplir algún rol en la formación del viroplasma y/o reclutamiento de otras proteínas a estas estructuras, así como en el movimiento intracelular de los viriones. Dado que la localización subcelular de P9‐1 es similar a la distribución característica de las proteínas mayoritarias de viroplasma de reovirus, decidimos estudiar más en profundidad sus propiedades funcionales y bioquímicas. Observamos que, al igual que otras proteínas mayoritarias de viroplasmas de reovirus, P9‐1 se auto asocia en complejos de alto peso molecular al ser expresada en bacterias, auto interacciona in vivo localizadamente en los cuerpos de inclusión que forma en células de insecto, tiene la capacidad de unir ácidos nucleicos de simple cadena, posee actividad ATPasa y alberga un dominio importante para la formación de cuerpos de inclusión en su mitad carboxilo terminal. Estos resultados indican que P9‐1 es el componente mayoritario de los viroplasmas y por lo tanto juega un rol fundamental en la replicación y ensamblado del MRCV en las células hospedantes.

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad del maíz en nuestro país provocando grandes pérdidas económicas. El virus es transmitido por chicharritas de la familia Delphacidae e infecta además diversas gramíneas como trigo, cebada, avena y sorgo, dando lugar a síntomas severos. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de ARN doble cadena (ARNdc) que codifican para trece proteínas. Durante el ciclo de infección, el MRCV replica en cuerpos de inclusión citoplasmáticos virales denominados viroplasmas, y nuestro grupo demostró que están compuestos principalmente por la proteína no estructural P9-1 (Maroniche, 2011). Para otros reovirus se ha demostrado que los viroplasmas contienen además ARN viral y proteínas virales minoritarias junto con componentes celulares del hospedante. Con el fin de avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad en primer lugar se analizaron las interacciones de las proteínas del MRCV entre sí utilizando la técnica de doble híbrido de levaduras (Y2H). Se identificaron cuatro interacciones positivas: P6 con P6 y con P9-1, P9-1 con P9-1, y P9-2 con P9-2. Se definieron además las regiones de P6 y de P9-1 involucradas en las interacciones utilizando mutantes de deleción y se encontró que la región central de P6 con un posible dominio “coiled-coil” es necesaria para la interacción consigo misma y con P9-1, mientras que los últimos 24 residuos de P9-1 intervienen en la formación de dímeros de P9-1. Estos resultados, junto con resultados previos del grupo (Maroniche, 2011), permitieron postular a P6 como componente minoritario del viroplasma e indicaron que la región C-terminal de P9-1 sería necesaria para la formación del viroplasmas. Adicionalmente se evaluó la interacción de las proteínas virales P6, P7-2, P9-1, P9-2 y P10 con proteínas celulares que son candidatas a cumplir roles relevantes en la interacción MRCVhospedante. Ente otros resultados, se encontró que P7-2 interactúa con la proteína SKP1 (SPhase Kinase Associated Protein 1) componente del complejo E3 ligasa del sistema ubiquitinaproteasoma (UPS). Estos resultados son de gran relevancia ya que sugieren que P7-2 tiene la capacidad de interferir con el UPS. Para continuar con la caracterización de las proteínas virales P9-1 y P6 e identificar posibles componentes celulares asociados con los viroplasmas, se realizaron relevamientos de una biblioteca de ADN copia (ADNc) de hoja de trigo por Y2H. Se encontró que P9-1 es capaz de interactuar con una proteína con posible función de aldosa 1-epimerasa y otra con posible función de aciltransferasa. Por su parte, P6 mostró interacción con una posible tiorredoxina. Dado que las proteínas identificadas intervienen en el metabolismo de la planta, se postula que su interacción con proteínas virales podría estar asociada con la generación de síntomas. Finalmente se determinó que tanto P6 como P9-1 contienen potenciales motivos PEST de degradación vía proteasoma. Se construyeron mutantes sin estos motivos y se observó un incremento en los niveles de acumulación de P6 y P9-1 mutadas en plantas, sugiriendo que los PEST serían funcionales. Si bien aún resta comprender los mecanismos precisos que subyacen a las interacciones proteína-proteína encontradas en este trabajo de Tesis y sus consecuencias biológicas, estos resultados significan un importante avance en el conocimiento de la función y rol de las proteínas codificadas por el MRCV, en especial de P6 y P9-1.

En esta Tesis doctoral se profundizó en el estudio de la interacción lípido-receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) en dos aspectos: por un lado, el mecanismo de inhibición de ácidos grasos libres (AGLs), antagonistas no competitivos del AChR, y por el otro, la ubicación del AChR en dominios líquido-ordenados (Lo) condicionada por dos características particulares de la membrana. Con la finalidad de dilucidar el mecanismo de antagonismo de los AGLs sobre el AChR, se utilizaron AGLs con un doble enlace único en diferentes posiciones de una cadena acílica de 18 átomos de carbono. Estudios funcionales realizados con la técnica de patch-clamp han mostrado que solo el cis-6-18:1 y el cis-9-18:1 reducen la duración del estado de canal abierto del receptor, sugiriendo, por lo tanto, un mecanismo de bloqueo alostérico del canal. Mediante espectroscopía de fluorescencia se comprobó que todos los AGLs se ubican en la interfase lípido-AChR, quedando el cis-6-18:1 restringido a los sitios denominados sitios anulares, mientras que el resto de los AGLs ocupa también sitios no-anulares. Por otro lado, estudios de polarización de fluorescencia mostraron que el AGLs cis-9-18:1 es el que ocasiona el mayor desorden en la membrana. Se comprobó i) que todos los cis-AGLs generan cambios conformacionales del AChR a nivel transmembrana, ii) que los cis-9-18:1, cis-11-18:1 y cis-13-18:1 perturban al AChR en su estado de reposo e iii) que los cis-6-18:1 y cis-9-18:1 son los que causan una mayor perturbación del estado desensibilizado. De esta manera, la posición e isomería del ángulo de torsión de los AGLs insaturados serían un factor clave en el bloqueo del AChR, sugiriendo entonces que los AGLs con un único doble enlace y ubicados superficialmente en la membrana inhiben en forma directa la función del AChR, posiblemente al perturbar una secuencia aminoacídica transmembrana involucrada en los cambios alostéricos necesarios para la apertura del canal iónico. Se postula que en la membrana plasmática el AChR se encuentra en dominios lipídicos denominados ?balsas? (?rafts?). Sin embargo, el AChR no muestra preferencia por dominios Lo en sistemas modelo compuestos por esfingomielina (SM), colesterol (Col) y POPC (1:1:1), pero sí lo hace un segmento transmembrana (γM4) que exhibe mayor contacto con los lípidos. Es decir, su distribución no dependería exclusivamente de sus propiedades intrínsecas sino también de señales extrínsecas a la proteína. En este trabajo de Tesis se estudió la posible partición diferencial del AChR en los dominios Lo en dos sistemas modelo diferentes en función de: a) la presencia de diferentes especies puras de SM en la membrana, y b) la existencia de asimetría transbicapa en el sistema modelo, mediante el agregado de SM de cerebro (bSM) en la hemicapa externa. Tanto la existencia de asimetría como la presencia de 16:0-SM o 18:0-SM, en comparación con las bSM y 24:1-SM, producen una partición preferencial del AChR en los dominios Lo. De este modo, la localización del AChR en estos dominios depende no solo de sus propiedades sino también de las características propias de la membrana en la que se encuentra. Entender la interacción lípido-AChR es de gran importancia para determinar tratamientos que puedan mejorar o inhibir la función del AChR y tratar enfermedades que lo involucren.

La importancia del conocimiento de la estructura interfacial reside en el hecho de que en ella se producen los fenómenos de transferencia electroquímica y adsorción. La comprensión de estos últimos es de relevancia en áreas tales cinética electroquímica, coloides, corrosión, membranas biológicas, química física de componentes de suelos, etc. En el presente trebajo se estudia el fenómeno de adsorción iónica sobre mercurio en contacto con soluciones acuosas rnezcla de electrolitos. Los estudios sobre la adsorción se han realizado en su mayoría a partir de sistemas binarios 122, comprobándose para ellos un cumplimiento satisfactorio del modelo aceptado (Grahame-Stern-Gouy-Chapmam 28) para su interpretación 52 53. Los estudios sobre este fenómeno.apartir de mezclas de electrolitos se han realizado bajo la suposición, no comprobada para estos sistemas, de que el anión fluoruro no se adsorbe específicamente. Sin embargo, existen evidencias de que dicho anión muestra un comportamiento inverso al indicado, tanto en sistemas binarios 134 como en mezclas de electrolitos acuosos 79 156 , aunque en el último caso esto no ha sido determinado fehacientemente. Por otra parte, en general, las cantidades específicamnte adsorbidas, a carga sobre el metal constante, muestran diferencias cuando se comparan sistemas binarios con mezclas. En el estudio de la adsorción a partir de mezclas acuosas de electrolitos se presenta el problema de tener que regular dos variables de concentración independientes, y existe controversia a cerca de cual es el conjunto de estas más adecuado a utilizar en la isoterma de adsorción específica 134 129 125. Se han propuesto para estos casos la fuerza iónica y la molalidad de uno de los electrlitos, así como las actividades de las sales 115. En el presente trabajo se propone también la utilización de las actividades individuales de los aniones , ya que estos son los que se adsorben específicamente. Hasta el presente no ha sido publicado ningún estudio de la adsorción específica competitiva de aniones. El estudio de la adsorción a partir de mezclas de dos electrolitos acuosos en las que ambos aniones son capaces de adsorberse específicamente, permite investigar varios de los aspectos mencionados 9 130. Por esta razón, en el presente trabajo, se estudia la interfase mercurio- KCL(aq) + Kl (aq). En este caso ambos aniones presentan una adsorción específica elevada (fuerte), aunque en distinto grado, sobre dicho metal a partir de sus soluciones binarias individuales. También en las soluciones mezcla de estas sales es posible estimar los coeficientos de actividad iónica con bastante exactitud, lo cual permite analizar el sistema bajo distintas variables de concentración con el fin de intentar hallar la más adecuada. En el capítulo I se desarrollan los puntos teóricos referentes al tema en cuestión, en el II se detalla la parte experimental, en el III se presentan los resultados obtenidos y los cálculos realizados. El análisis de aquellos se realiza en el capítulo IV.

Las citoquinas pro-inflamatorias son inducidas en condiciones patológicas en el sistema nervioso central (SNC) en situaciones de trauma o infección, y se ha demostrado que son capaces de exacerbar y/o disminuir una lesión (Rothwell and Luheshi, 2000). Asimismo, son expresadas de manera constitutiva e inducible por las células del SNC y actúan fisiológicamente sobre las neuronas en el cerebro normal adulto, modulando la plasticidad sináptica, la transmisión sináptica, etc. (Vitkovic et al., 2000). El sistema de la interleuquina-l (IL-1) juega un rol decisivo en la respuesta inflamatoria. La expresión de sus ligandos (IL-1α, lL-1β e IL-1ra) y de sus receptores ha sido demostrada en varias regiones del SNC y bajo diversas condiciones (Rothwell and Luheshi, 2000). Otros trabajos han demostrado no sólo una variedad de efectos de la lL-1 en el cerebro o en neuronas y glia in vitro, sino que los resultados publicados hasta la fecha resultan muchas veces contradictorios, demostrando efectos opuestos en el mismo sistema de estudio. El objetivo general de esta tesis es estudiar de manera sistemática y profunda los roles fisiológicos y los efectos farmacológicos de la IL-1 en el cerebro. Para ello se investigó a la molécula en cuatro modelos diferentes en los cuales se estudiaron las respuestas de la glia, las citoquinas, la neurodegeneración y las variaciones en el comportamiento, de forma de obtener una visión global de la fisiología de la IL-1 en el SNC. (1) Observamos similitudes y diferencias regionales en la respuesta aguda a la IL-1β. Por ejemplo, detectamos reclutamiento de neutrófilos en todas las regiones inyectadas, pero neurodegeneración sólo en el giro dentado. (2) En un modelo en rata de la enfermedad de Parkinson observamos Ia activación atípica de la microglia en la región lesionada, con una regulación particular de la expresión de citoquinas. (3) Demostramos que la neurogénesis en el mesencéfalo no es un fenómeno fisiológicamente relevante. (4) Demostramos que la IL-1α endógena hipocampal tiene un rol modulador del aprendizaje aversivo. De esta manera, caracterizamos funciones y/o efectos de la IL-1 en el SNC, obteniendo evidencia empírica no sólo de funciones especificas de la IL-1 sino también de características más generales de la gliosis/inflamación en el SNC. Así, observamos que los efectos de la IL-1 dependen tanto de las concentraciones utilizadas como de la región que se está estudiando y, probablemente, de la densidad glial en la misma. Por ejemplo, observamos que la IL-1 endógena modula el aprendizaje, pero que, cuando se inoculan cantidades farmacológicas de la misma, causa degeneración en la misma región (hipocampo).

En líneas celulares de origen leucémico se han encontrado deleciones en el brazo corto del cromosoma 9, donde se localizan los genes del interferón de tipo I, lo que en un principio hizo suponer que el interferón se comportaba como un gen supresor de tumor. Se propuso ver si la producción de interferón estaba alterada en las leucemias linfoblásticas agudas (LLA), y si esas alteraciones génicas estarían relacionadas con la capacidad de producción de interferón a por las células malignas al ser inducidas con virus Sendai. Se determinó la capacidad de las células leucémicas de 21 pacientes de LLA, de la línea celular establecida K 562 y de dadores normales de producir interferón a "in vitro" al ser inducidos con virus Sendai con un priming de interferón α. La producción de interferón a por los blastos leucémicos y células normales fue muy variable oscilando entre 633 a 8850 pg/ml/5x10 6 células, no siendo estadísticamente significativo, tampoco se hallaron diferencias entre los subgrupos de LLA. En 4 de los 7 casos estudiados por Southern blot se pudo estudiar la producción de interferón α, presentando uno de ellos deleción de genes de interferón α. De las 21 leucemias en dos casos produjeron una cantidad de interferón α mínima. Esto sugiere que la malignidad en las LLA con baja producción de interferón α podría deberse a la pérdida de algún gen supresor de tumor. Se investigó la frecuencia y asociación de alteraciones del p 16, el interferón α y el interferón β en un total de 39 casos de LLA. De ellos, diez pacientes (25,6 %) presentaron anormalidades de al menos uno de los tres genes estudiados. Se encontró en un porcentaje del 13% deleciones en los genes del interferón α y β, así como también en los recientemente identificados genes supresores de tumor p15 y p16 (23%) los cuales se encuentran próximos a los genes el interferón. Estos datos indican que en las LLA, representando un cuarto de las LLA totales estudiadas el gen p16 está delecionado con mayor frecuencia que los genes de los interferones de tipo 1. Además de p16, el 37,5% está asociado con deleciones del interferón, sugiriendo una asociación entre ambas. Estos datos sugieren que la ausencia de p16, inhibidor de las ciclinas, podría modificar el ciclo celular normal y favorecer la transformación blástica. Su asociación con la deleción de los genes de los interferones de tipo I podría constituir eventos de la leucemogénesis. El porcentaje de deleciones, a su vez dependió del fenotipo de la célula leucémica, siendo mayor en los casos de LLA T que en aquellas precursoras B. Para un mejor tratamiento de la enfermedad es necesario partir de un buen diagnóstico, para lo cual se buscó detectar clonalidad, de tipo B o T por medio de la identificación de fragmentos reordenados, ya sea de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (clonalidad B) o de la cadena γ del receptor de los linfocitos T (clonalidad T). A su vez por medio de un mapeo de restricción se llegó a una correcta identificación del subtipo de reordenamiento Vγl en las LLA T. Esto cobra importancia, sobre todo para el seguimiento posterior de la enfermedad mínima residual, sin embargo no es suficiente para la determinación del linaje celular.