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En este trabajo se ha efectuado un estudio de la preparación de la nicotinamida a partir del ácido nicotínico y de la urea, ensayándose diferentes métodos de purificación y aislación del producto obtenido. La purificación de la nicotinamida se hace dificil por la presencia de productos de la descomposición termica de la urea (amelida, ácido cianúrico, ácido ciánico, biuret). Propiedades y usos de la nicotinamida: la nicotinamida es un polvo blanco, cristalino, de PF 129-131 ºC, muy soluble en agua y alcohol, poco soluble en acetona e insoluble en éter. En acetato de etilo es moderadamente soluble. La carencia,de la nicotinamida o derivados del ácido nicotinico en la dieta del hombreprovoca la pelagra. Otros métodos de obtención de la nicotinamida. Purificación de la misma: Además del método estudiado en el presente trabajo, hay varias otras formas de obtención que se pueden resumir como sigue: a) Por deshidratación del nicotinato de amonio. b) Por amidación directa del ácido nicotinico y sus ésteres. c) por hidrólisis de la 3-cianopiridina. La nicotinamida obtenida en las diversas formas mencionadas, se purifica luego por diversos solventes, con la ayuda además de diversas sustancias inorgánicas. Parte experimental Reacción de obtención de la nicotinamida: Se utilizó un balón de tres bocas, provisto de refrigerante, termómetro y agitador. Además de los reactivos (ácido nicotínico y urea), se agregó también molibdato de amonio como catalizador. La reacción se produce manteniendo la mezcla a 190 ºC durante media hora. Aislación de la nicotinamida: a)Con butanol y purificación con hidróxido de calcio. Se extrae el producto de la reacción descripta anteriormente con n-butanol, filtra y trata con (H0)2Ca y C activado. El ácido nicotinico no reaccionado precipita como nicotinato de Ca. En el filtrado se encuentra la nicotinamida. De este filtrado se cristalizaron luego tres cosechas de nicotinamida. b) Como oxalato de nicotinamida: Se extrae el producto de la reac- ción fundamental, con agua. El ácido nicotinico no reaccionado se precipitó llevando la solución al punto isoeléctrico del ácido. La solución acuosa de nicotinamida se trató con ácido oxálico, precipitándose en esta forma oxalato de nicotinamida. Este oxalato puede tratarse luego en diversas formas: l) Suspendiéndolo en metanol anhidro, haciéndose burbujear luego en esta suspensión NH3 seco. Al cesar el desprendimiento de calor, la reacción ha llegado a su fin, obteniéndose un precipitado de oxalato de amonio y la solución de nicotinamida. Se separa la nicotinamida evaporando el solvente sobre baño maria. 2) Disolvióndolo en agua caliente y agregando a esta solución una suspensión de (H0)2Ca. Se obtiene un precipitado de oxalato de calcio; la nicotinamida se separa del filtrado evaporando sobre baño maria. Este procedimiento admite como variante, dejar enfriar la solución acuosa de oxalato de nicotinamida, precipitando en esta forma una serie de impurezas. El filtrado resultante se enfría a 17°C, para su purificación. Se comprobó que este último método no da resultados adecuados, a pesar de los múltiples ensayos de recristalización y purificación ensayados. Otra variante que se probó fue de introducir en el método anterior una extracción con acetato de etilo. Sumario y discución: Además de la reacción de obtención propiamente dicha de la nicotinamida, se estudiaron sus diferentes métodos de aislación, purificación y reconocimiento, variándose en los mismos una serie de factores básicos (concentraciones, temperatura, agitación, etc.). Se estudiaron asimismo las posibles causas de perdidas de nicotinamida, que tienen como resultado un bajo rendimiento de nicotinamida. Conclusiones: Se hace un estudio de los rendimientos de los diversos métodos utilizados, llegándose a la conclusión que el método que mejor rendimiento da es él que utiliza el (HO)2Ca y C activado para la purificación de la solución butanólica de nicotinamida. En cuanto a la sencillez del procedimiento, la extracción del producto crudo con agua y la purificación ulterior por enfriamiento y acetato de etilo es la forma más indicada de operar. El métodode obtención de la nicotinamida a partir de urea y ácido nicotinico, fue estudiado por algunos autores. Asimismo hay autores que han estudiado ciertos métodos de purificación de la nicotinamida impura, obtenida mediante diversos procedimientos. Colaboración del presente trabajo: La colaboración que pretende haber aportado este trabajo al estudio de la preparación de la nicotinamida, se puede resumir como sigue: a) Interrelación del método de obtención de la nicotinamida a partir de la urea y ácido nicotinico con los métodosde purificación conocidos. b) Posibilidad de obtener una nicotinamida pura por este método. c) Rendimiento de nicotinamida pura por este método. d) Estudio de la posibilidad de obtener nicotinamida pura mediante precipitación como oxalato y ulterior liberación con (H0)2Ca. La utilización del hidróxido de calcio se estudió como alternativa al empleo del NH3; el empleo de este último ha sido estudiado muy recientemente por un autor. e) Separación del ácido nicotínico no reaccionado mediante su precipitación en su punto isoelóctrico. f) Al estudiarse un método de purificación de la nicotinamida por enfriamiento, se comprobó que no es mayormente adecuado, no obteniéndose los resultados que los autores del mismo pretenden haber hallado.

Toxoplasma gondii es uno de los parásitos protozoarios más ampliamente distribuidos a nivel mundial, y usualmente causa una enfermedad asintomática en los humanos. Sin embargo, la reactivación de la infección crónica en pacientes inmunocomprometidos, y la toxoplasmosis congénita de una infección primaria adquirida durante el embarazo, presentan cuadros clínicos muy severos e incluso puede causar la muerte del paciente. Además, debido a que T. gondii causa mortalidad de los neonatos en ovejas, también representa una causa importante de pérdida económica en las granjas. En este trabajo dos familias de ADN repetitivas de T. gondii fueron caracterizadas. ABGTg7 (721 bp) presenta dos monómeros repetidos completos y 55 nt de un tercero, mostrando una disposición de tandems directos cuya unidad repetida es de aproximadamente 340 bp. ABGTg8 (1002 bp) contiene dos elementos repetidos distintos: uno denominado ABGTg8.2 y un elemento ABGTg7. ABGTg7 y ABGTg8.2 muestran patrones de hibridación muy similares en Southern-blots de ADN de T. gondii digerido con distintas endonucleasas de restricción, sugiriendo que ambos elementos principalmente se encuentran en la misma estructura repetitiva en tandem en el genoma. Análisis de PFGE mostraron que estos elementos repetidos se encuentran en al menos tres de los 4 cromosomas más grandes de T. gondii. Ensayos de sensibilidad a la endonucleasa Bal 31 indicaron que se encuentran localizados cerca de los telómeros de los cromosomas así como también en otras regiones de los mismos. Cinco fagos lambda recombinantes genómicos fueron aislados y dos clusters diferentes completos de la estructura repetitiva fueron analizados. Ambos clusters contienen uno de sus extremos conservados con un fragmento de 4.4 Kbp donde se halla ubicado ABGTg8.2, ligado a numerosos fragmentos Sal I conteniendo todos al menos una copia de los monómeros de ABGTg7. Dentro de estos clusters ambos elementos repetidos forman parte de una estructura compleja en tandem, donde los monómeros de ABGTg7 se encuentran dispuestos tanto como tandems directos como flanqueados por otros elementos repetitivos sin o con baja homología entre ellos. Esta estructura repetitiva en tandem cumple los requerimientos asignados al ADN satelital. Por otra parte, se evaluó el uso potencial de la secuencia ABGTg7 para el diagnóstico de la toxoplasmosis humana. Se realizaron ensayos de hibridación mediante la técnica de Dot-blot en muestras de sangre de pacientes con toxoplasmosis cerebral (CT), linfoadenopatía toxoplásmica (ATL) y toxoplasmosis diseminada en pacientes trasplantados (TR). Se estudió un total de 84 individuos. Se encontraron señales positivas por Dot-blot en 12 (66.7%) de 18 casos con CT confirmada, 9 (52.9%) de 17 casos con ATL y 2 (66.7%) de 3 casos con TR con toxoplasmosis. En paralelo se realizaron ensayos de PCR en los pacientes con ATL, resultando en la detección de ADN de T. gondii en 10 casos (58.8%). Un estudio comparativo entre el Dot-blot y la PCR fue realizado también en ratones experimentalmente infectados con taquizoitos, el cual arrojó resultados similares: 60% y 70% de valores positivos respectivamente. Finalmente la suma de valores positivos obtenidos con ambos tests (Dot-blot más PCR) incrementó el número de sospechas de infección toxoplásmica en los pacientes con ATL a un 76.4% de casos. Por otro lado, si se consideran los resultados positivos obtenidos simultáneamente por las dos técnicas, se confirmó el resultado en el 35.2% de los casos. Estos resultados indican que la sonda repetitiva ABGTg7 es un recurso adicional útil para el diagnóstico de la toxoplasmosis humana. Finalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudios básicos sobre la organización genómica de estos elementos repetidos, se desarrolló un ensayo de PCR basado en la secuencia ABGTg7 con el objeto de ser evaluado como herramienta diagnóstica.

Las células madre embrionarias humanas (CMEh) se caracterizan por su capacidad para auto-renovarse, sin perder sus propiedades, casi ilimitadamente. Una de las principales propiedades de estas células es la pluripotencia, es decir la capacidad para diferenciarse y dar origen a las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo. Debido a su capacidad de autorenovación y a su naturaleza pluripotente las CMEh representan un modelo experimental único para numerosas áreas de investigación en biología y medicina. Estudios recientes realizados para dilucidar los mecanismos que dirigen la diferenciación de CMEh a cardiomiocitos in vitro, han recapitulado muchos de los procesos que ocurren in vivo durante el desarrollo cardíaco temprano. Numerosos trabajos han demostrado que el factor inhibitorio de leucemia (LIF por su nombre en inglés) puede promover la proliferación o inducir la diferenciación celular de manera específica, dependiendo del tipo celular o estadío del desarrollo en el que actué. No obstante, poco se sabe acerca de la relevancia biológica de esta citoquina durante el proceso de diferenciación cardíaca humana. El objetivo principal de nuestro proyecto de investigación consistió en estudiar el rol de LIF durante la generación y el mantenimiento de cardiomiocitos a partir de CMEh. Para ello, en primera instancia, desarrollamos un nuevo protocolo de diferenciación de CMEh a cardiomiocitos, que incluye el uso de un medio de composición definida y el agregado secuencial de factores específicos que dirigen la diferenciación hacia mesodermo cardíaco. A continuación, evaluamos el efecto del agregado de LIF en diferentes etapas de la diferenciación cardiaca. Nuestros resultados nos permiten postular que la presencia de LIF a lo largo de la diferenciación cardíaca ejerce un efecto citoprotector que estaría asociado a una diminución de los niveles de apoptosis. En una segunda etapa logramos generar en nuestro laboratorio una línea de células pluripotentes inducidas (CMPIs) a partir de la reprogramación de fibroblastos dérmicos y evaluamos su rendimiento al ser sometidas al protocolo de diferenciación cardíaca. Las CMPIs presentan expresión génica, proteica y modificaciones epigenéticas muy similares a las CMEh. Estas características las equiparan a las CMEh, y por ende son vistas como substitutos accesibles. Palabras clave: Células madre embrionarias humanas, mesodermo, diferenciación cardíaca, LIF, gp130/STAT3, células madre pluripotentes inducidas.

La nodulación es un modelo muy interesante de la diferenciación celular y del desarrollo en plantas así como también de la interacción de las leguminosas con microorganismos simbiontes. En nuestro grupo estudiamos los mecanismos de señalización durante la organogénesis de los nódulos en las raíces de Phaseolus vulgaris L. (poroto común, también conocido como frijol). El poroto es de gran importancia económica y una fuente de proteínas para la nutrición de más de 500 millones de personas en los países en desarrollo (Graham y Vance, 2003). Las leguminosas establecen asociaciones simbióticas con bacterias gram-negativas (rizobios) y con hongos arbusculares (HA) que facilitan la adquisición de nutrientes tales como el nitrógeno y el fósforo. La simbiosis entre las leguminosas y los rizobios da lugar a la formación de nódulos en la raíz y a la fijación simbiótica de nitrógeno (Denarie y Cullimore, 1993). La interacción del microsimbionte se inicia con un diálogo molecular que involucra flavonoides liberados por la raíz, los cuales inducen en la bacteria la síntesis de un lipo-quitooligosacárido conocido como Factor Nod (FN), el cual es a su vez es liberado por la bacteria hacia la raíz. El FN actúa como un regulador de crecimiento de la planta, disparando los procesos de diferenciación que culminan con la formación de las estructuras simbióticas, llamadas nódulos. Dentro de los nódulos las bacterias simbióticas se diferencian y se engloban en simbiosomas, los cuales son estructuras especializadas intracelulares desarrolladas de novo dentro de nódulos de las raíces (Oldroyd y Downie, 2008).

La melatonina caracterizada originalmente en la glándula pineal fue más tarde identificada en la retina de diversas especies, así como las enzimas involucradas en su síntesis, la serotonina-N-acetiltransferasa (NAT) y la hidroxiindol-O-metiltransferasa (HIOMT). El hámster dorado ha sido considerado frecuentemente el modelo clásico para el estudio de la melatonina pineal, sin embargo, la melatonina retiniana en esta especie ha recibido relativamente poca atención. El objetivo de este trabajo de tesis consistió en examinar la biosíntesis del metoxiindol en la retina del hámster, así como elucidar algunos de los mecanismos involucrados en la regulación de su síntesis y su posible rol fisiológico a nivel local. En este sentido, se describe por primera vez la presencia de un ritmo en el contenido retiniano de melatonina en el hámster dorado, con valores máximos en la segunda mitad de la noche. La síntesis de melatonina en la retina del hámster es independiente de la actividad pineal. Asimismo, se demuestra la capacidad de las retinas aisladas de sintetizar melatonina. La síntesis de melatonina es regulada directamente por la señal fótica ambiental, sin indicación de la existencia de un ritmo de naturaleza endógena en los experimentos realizados en este trabajo. El GABA, postulado como un neurotransmisor retiniano regulatorio de procesos asociados a oscuridad, estimula la producción in vitro de melatonina retiniana, probablemente a través de receptores de tipo A, en tanto que antagonistas específicos del receptor GABAA suprimen el incremento in vitro de melatonina en oscuridad. El "turnover" de GABA es máximo en la fase de oscuridad y precede al aumento en el contenido de melatonina. En conjunto, estas evidencias sugieren que el GABA actúa como intermediario entre la señal de oscuridad y la inducción de la síntesis del metoxiindol. El AMPc ha sido postulado como la señal intracelular involucrada en la inducción génica de la NAT retiniana. La existencia de una correlación temporal entre el ritmo en el contenido de AMPc y el de melatonina (ambos regulados de manera análoga por la señal fótica ambiental) avala resultados previos. Sin embargo, en este trabajo se postula adicionalmente que el GMPc participa en la regulación de la síntesis de melatonina retiniana, tanto por sus efectos in vitro, como por la correlación temporal entre las variaciones diarias de ambas moléculas. Considerando que el GABA estimula la acumulación de GMPc, pero inhibe la de AMPc, se sugiere que el efecto gabaérgico sobre la síntesis de melatonina podría estar mediado por el incremento en los niveles de GMPc retinianos. Por otra parte, se demuestra que la melatonina estimula la producción de GMPc, a través de una acción dual sobre la síntesis y degradación, ambos efectos tendientes al incremento en los niveles del nucleótido cíclico. La activación de la enzima de síntesis, así como la inhibición de la enzima de degradación podrían ocurrir a través de la disminución de los niveles de calcio citoplasmático. En este sentido, la melatonina inhibe en forma inmediata (luego de 10 seg) la captación de 45Ca2+ en fracciones sinaptosomales crudas. La melatonina incrementa la captación de 3H-glutamato, a través de un mecanismo independiente del calcio extracelular, así como la liberación de 3H glutamato, por un mecanismo dependiente del catión. La exposición más prolongada a melatonina (durante 20 min) estimula la captación de 45Ca2+ por fracciones crudas sinaptosomales. Considerando que análogos permeables del GMPc provocan efectos similares a los de la melatonina sobre estos parámetros, el metoxiindol podría actuar a través del incremento en el contenido del nucleótido. En este trabajo de tesis, se describe también la presencia de receptores específicos, de alta afinidad, con un perfil farmacológico compatible con el descripto para receptores de melatonina de tipo ML-1. Los resultados sugieren además que estos receptores podrían estar acoplados con una proteína G inhibitoria. De este modo, la melatonina disminuye significativamente los niveles retinianos de AMPc, quien a su vez podría actuar como un segundo mensajero del metoxiindol y/o regular negativamente su propia síntesis. En todos los casos, los efectos de la melatonina fueron dependientes del horario, mostrando una alta correlación con la variación diaria en la concentración de receptores al metoxiindol. La densidad máxima se observó a la medianoche, coincidiendo con el horario de máxima sensibilidad. La variación diaria en la concentración de sitios receptores podría deberse a mecanismos de "up y down-regulation" inducidos por el ligando endógeno. En conjunto, los resultados obtenidos permiten postular la participación de la melatonina retiniana en los mecanismos de transducción y procesado de la información fótica como una señal "senso-parácrina", es decir una molécula sintetizada y liberada por los fotorreceptores en respuesta a un estímulo sensorial (la oscuridad) y que actúa localmente modulando diversos aspectos de la fisiología retiniana.

Fil:Wyszogrodzki, Irma Celina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Con el objetivo de estudiar la participación del receptor dopaminérgico D2 (RD2) en células hipofisarias productoras de prolactina hemos desarrollado ratones mutantes incapaces de expresar el gen de RD2 (Drd2) selectivamente en lactotropos. Para producir estos ratones con mutaciones nulas de Drd2 restringidas a lactrotropos generamos ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre bajo el control transcripcional del promotor de prolactina de ratón (Prl-Cre) y luego los cruzamos con ratones mutantes condicionales para el gen del RD2 (Drd2^flox/flox) para producir ratones mutantes y transgénicos compuestos (Drd2^flox/flox.Tg Prl-Cre). La caracterización molecular y bioquímica mostró que los ratones Drd2^flox/flox.Tg Prl-Cre no expresan Drd2 en el lóbulo anterior de la hipófisis pero sí en el lóbulo intermedio y en todas las áreas del cerebro donde Drd2 se expresa normalmente. En consecuencia, esta nueva cepa de ratones con mutaciones nulas de Drd2 restringidas a lactotropos fue denominada pitD2RKO. Los ratones pitD2RKO presentan niveles elevados de prolactina que resultan extremadamente altos en hembras adultas que desarrollan prolactinomas hipofisarios. Como consecuencia de la falta de receptores RD2 lactotrópicos, los niveles de prolactina de los ratones pitD2RKO no aumentan luego de la administración aguda del antagonista de RD2s, haloperidol. Las curvas de crecimiento corporal de los ratones pitD2RKO resultaron normales así como los distintos parámetros asociados al eje de la hormona de crecimiento (GH), en marcado contraste con lo estudiado en ratones mutantes totales del RD2 (Drd2^+) que son enanos. Esta observación indica que la ausencia de RD2s de los lactotropos hipofisarios no es responsable del déficit severo presente en el eje de GH de los ratones Drd2^+. Sorprendentemente, las hembras pitD2RKO presentan un aumento considerable de la ingesta de alimento y del peso corporal a partir de los 90 días de edad, probablemente como consecuencia de los elevados niveles crónicos de prolactina. Finalmente, analizamos los prolactinomas experimentales resultantes en nuestro nuevo modelo y ampliamos el estudio a adenomas hipofisarios humanos; en ambos casos, de manera interesante, observamos un aumento en la proliferación celular y en la angiogénesis de los adenomas respecto a las hipófisis controles, contrariamente a lo publicado.

La Influenza Aviar es considerada una zoonosis con potencial pandémico. El agente etiológico responsable de esta enfermedad es el Virus de Influenza A, cuyo reservorio natural son las aves silvestres acuáticas. En ellas, la infección con el Virus de Influenza Aviar (AIV) generalmente es asintomática, mientras que en las aves de corral la infección con AIV puede producir una variedad de síntomas que se extienden desde presentaciones asintomáticas o suaves a una enfermedad aguda y fatal. En consecuencia, se generan grandes pérdidas económicas asociadas al control y erradicación de este agente en las aves domésticas. Por ello, en la presente tesis nos propusimos estudiar, primero, la presencia del AIV en las aves silvestres acuáticas de la Argentina y, luego, su introducción y difusión en aves de corral con diferente estado inmunológico. Los resultados obtenidos permitieron evidenciar la circulación de veinte Virus de Influenza Aviar de Baja Patogenicidad (LPAIV) de diversos subtipos en las aves silvestres que habitan en la Argentina. Estos LPAIV aislados presentaron características genéticas particulares en sus genes que los diferencian de los AIV aislados en otras regiones. En particular, se evidenció la existencia de un linaje Sudamericano con evolución independiente para los seis genes que codifican las proteínas internas del Virus de Influenza Aviar. Debido a que la mayoría de los LPAIV aislados en nuestro país fueron de subtipo H6, se estudió la patogenia de estos virus en las aves de corral. Los resultados demostraron que estos virus de subtipo H6 tienen capacidad de infectar pollos y de transmitirse por contacto, evidenciando el riesgo potencial de introducción de estos virus en las aves de corral. Por otra parte, se sabe que en la Argentina, como en cualquier país con una producción avícola intensiva, existe una alta incidencia del Virus de Anemia Infecciosa Aviar (CAV) dentro de los planteles de aves domésticas. Actualmente, se carece de conocimiento acerca de la importancia que puede tener el estado de inmunosupresión provocado por este agente en la evolución de la patogenia del AIV. Por ello, en el trabajo de tesis que se presenta a continuación se estudió de patogenia del LPAIV subtipo H6 en pollos inmunosuprimidos experimentalmente por la infección con una cepa de CAV autóctona. Los resultados obtenidos demostraron que el AIV utilizado, aislado de aves silvestres en la Argentina, tiene igual capacidad de infectar pollos y de transmitirse por contacto directo en aves inmunocompetentes e inmunosuprimidas con CAV. En conjunto, los resultados presentados en esta tesis permiten colaborar con mejores análisis de riesgo para el diseño de estrategias de control y prevención con el objetivo de proteger las aves domésticas de nuestro país. Además, haber aumentado la información acerca de la epidemiología de la Influenza Aviar en la región es de suma importancia para comprender en mayor profundidad las potenciales consecuencias de esta enfermedad, tanto en las aves silvestres como en las aves domésticas. Sumado a esto último, es importante destacar que la Influenza Aviar es una zoonosis, con lo cual el aumento de la información disponible sobre este agente infeccioso es de relevancia para el sistema de Salud Pública nacional.

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Biológica en 2014

Tesis (Doctorado en Ciencias Económicas) -- Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Económicas. Escuela de Graduados ; Argentina, 2018.