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En la mama normal, LIF es el principal activador del factor de transcripción STAT3,responsable de inducir la apoptosis del epitelio secretorio durante la involución. En el cáncer de mama STAT3 se encuentra frecuentemente activo aunque su rol biológico es aún controversial. En este trabajo nos propusimos evaluar si el LIF producido localmente es responsable de la activación de STAT3 en tumores mamarios murinos. Por estudios in vivo e in vitro determinamos que LIF se sobre-expresa en estos tumores, donde actúa como principal activador de STAT3. Encontramos además que LIF ejerce un efecto opuesto en células normales y tumorales, inhibiendo e induciendo, respectivamente, la supervivencia celular. A continuación, decidimos evaluar si el estrés mecánico inducido por la acumulación de leche al final del amamantamiento dispara la expresión de factores relevantes en la involución y tumorigénesis mamaria. Para ello, diseñamos un dispositivo que permite “estirar” radialmente células creciendo en cultivo sobre membranas elásticas. Encontramos que el estímulo mecánico es capaz de disparar en células mamarias la activación de cascadas de señales y la expresión de genes fundamentales en la involución y el desarrollo tumoral. En conjunto, nuestros resultados brindan nuevas evidencias de la importancia de los factores locales en la regulación de procesos normales y patológicos de la glándula mamaria.

Las células madre embrionarias (ESCs) son células derivadas del macizo celular interno (ICM) del blastocisto. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente en cultivo y de dar origen a células de las tres capas germinales, propiedad conocida como pluripotencia. Existen tres factores de transcripción fundamentales para la regulación génica de las células madre pluripotentes, Oct4, SOX2 y Nanog. Estudios de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) han revelado que estos factores ocupan al mismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo el genoma, sugiriendo que estos factores actúan como el núcleo de una red regulatoria que modula la expresión de genes involucrados en la diferenciación celular. Mientras que in vitro las ESCs pueden ser mantenidas indefinidamente en estado indiferenciado, in vivo, conforme progresa el desarrollo, las células del ICM abandonan su estado pluripotente para seguir diversos programas de diferenciación. El inicio de dichos programas depende, en gran medida, de la regulación de la expresión de genes tejidoespecíficos. Sin embargo, entender cuáles son estos genes y cómo son regulados no es suficiente para explicar el comienzo del proceso de diferenciación celular. Existen además, cambios en la organización de la cromatina a nivel global y de loci específicos, registrándose múltiples evidencias que relacionan la estructura de la cromatina de los genes marcadores de estadio indiferenciado con el mantenimiento de la pluripotencia. Nuestra hipótesis postula que existiría una relación bidireccional entre los niveles y la actividad de proteínas que remodelan la cromatina y de los factores de transcripción críticos en el mantenimiento de las propiedades de las células pluripotentes. El objetivo general de este trabajo es contribuir al esclarecimiento de la regulación epigenética que ocurre en las ESCs durante la diferenciación y el estado epigenético de éstas cuando son mantenidas en estado indiferenciado. Para ello, nos propusimos, en primer lugar analizar el patrón de expresión de proteínas modificadoras de la cromatina en ESCs indiferenciadas y en distintos estadios de diferenciación. Luego, una vez detectados genes de interés,evaluar el efecto de la modificación de sus niveles de expresión sobre el mantenimiento del estado indiferenciado y en la diferenciación de las ESCs. Por último, nos propusimos estudiar si los factores de transcripción relevantes en la preservación de la pluripotencia regulan la expresión los genes en estudio. Para nuestro primer objetivo, analizamos la expresión de enzimas relacionadas con el remodelado de la cromatina mediante RT-qPCR en ESCs indiferenciadas y las comparamos con la de células terminalmente diferenciadas. Posteriormente, diferenciamos ESCs mediante un protocolo no dirigido y analizamos la expresión de estos genes lo largo del proceso de diferenciación. Esta búsqueda arrojó una serie de genes candidato que podrían tener un rol en el mantenimiento de las propiedades básicas de las ESCs. Posteriormente, elegimos uno de estos genes, la metiltransferasa Prmt8, para continuar nuestros estudios. Los otros genes que surgieron de este análisis forman parte de otros proyectos de tesis. Utilizando tanto un protocolo de diferenciación no dirigido como uno dirigido hacia linaje neural, comprobamos que el gen de Prmt8 se regula negativamente durante el proceso de diferenciación. Por otra parte, construimos una línea estable de mESCs que contiene en su genoma un shRNA inducible contra Prmt8. Probamos que al inducir este shRNA los niveles de mensajero de esta enzima disminuyen, y que esto en un principio no afecta la capacidad de autorenovación de las células. Mediante análisis de inmunofluorescencia estudiamos la presencia y localización de marcadores del estado indiferenciado. No encontramos diferencias sustanciales en los marcadores analizados al comparar las células cultivadas en presencia del inductor del shRNA con las células control. Por otro lado, diferenciamos la línea que sub-expresa Prmt8 y encontramos que estas células parecen diferenciarse de forma diferente al control. Por último, analizamos si la expresión forzada de los factores de transcripción de pluripotencia modula la expresión de Prmt8 en un sistema heterólogo. En conjunto los datos sugieren que Prmt8 es regulado positivamente por los factores de transcripción de pluripotencia, y modulado durante la diferenciación, hecho que podría ser clave en la determinación del tipo celular de destino. En el futuro planeamos realizar estudios de inmunoprecipitación de la cromatina para estudiar la interacción de estos factores con el promotor de Prmt8. Por otra parte, nos interesa estudiar con mayor profundidad si la presencia de esta metiltransferasa es vital para la diferenciación hacia algún tipo celular en particular. Creemos que los conocimientos generados en el campo de la epigenética de células madre pueden contribuir a plantear estrategias que ayuden, en un futuro, a diseñar nuevas terapias celulares.

La tuberculosis (TB) es la primera causa de muerte en pacientes HIV+. La infección por Mycobacterium tuberculosis induce la activación de células T CD8+, sin embargo, aún se desconoce si estas células pueden mediar protección contra esta enfermedad. Durante la infección por HIV, que incrementa dramáticamente el riesgo a desarrollar TB, los linfocitos T CD4+ específicos para M. tuberculosis disminuyen drásticamente. Por lo tanto, la caracterización de las respuestas T CD8+ en pacientes coinfectados con TB y HIV podría revelar potenciales blancos terapéuticos para el desarrollo de terapias adyuvantes. En el presente trabajo de tesis caracterizamos las respuestas T CD8+ específicas contra M. tuberculosis en pacientes coinfectados con TB y HIV-1 (HIV-TB) a través del estudio de la distribución de las poblaciones de memoria y efectoras en células T CD8+ por citometría de flujo y de la caracterizaron de las respuestas antígeno-específicas mediante la estimulación ex vivo con antígenos de M. tuberculosis en estos pacientes. A su vez, evaluamos el rol de la activación de los macrófagos y de la vía de PD-1 sobre la función citotóxica de las células T CD8+, para lo cual desarrollamos un sistema in vitro que nos permitió evaluar las respuestas T CD8+ citotóxicas específicas contra M. tuberculosis utilizando macrófagos diferenciados de monocitos como células blanco. Llamativamente, los pacientes HIV-TB mostraron una inhibición de las respuestas T CD8+ específicas para M. tuberculosis asociada a una diferenciación deficiente en comparación con dadores sanos y pacientes HIV+. Específicamente, las células diferenciadas terminalmente mostraron un fenotipo poco diferenciado, con menor expresión de la molécula CD45RA. A su vez, el porcentaje de estas células correlacionó positivamente con la expresión de PD-1 en células CD27+, sugiriendo que el agotamiento y la diferenciación deficiente en células T CD8+ están asociados en el marco de la coinfección HIV-TB. Estudios previos de nuestro grupo mostraron que los pacientes HIV-TB presentan un desbalance en los niveles de hormonas adrenales inmunomoduladoras, como el cortisol y la dehidroepiandrosterona (DHEA). A su vez, trabajos previos demostraron que la administración de DHEA incrementa respuestas específicas contra M. tuberculosis y otros patógenos en modelos murinos y durante la TB activa en humanos. Nosotros observamos que el nivel plasmático de DHEA correlacionó positivamente con el porcentaje de células T CD8+ diferenciadas terminalmente, lo que sugiere que el desbalance endócrino asociado a la coinfección por HIV y TB contribuye a la disfunción de estas células. Posteriormente, evaluamos el efecto modulador de DHEA sobre la función y el estado de diferenciación de células T CD8+. Así, DHEA incrementó las respuestas T CD8+ específicas para M. tuberculosis como también su diferenciación terminal in vitro. Con el objeto de estudiar el rol de la activación de los macrófagos y de la vía de PD-1 sobre la función citootóxica de células T CD8+, establecimos un sistema in vitro para evaluar las respuestas T CD8+ citotóxicas específicas contra M. tuberculosis utilizando macrófagos diferenciados de monocitos como células blanco. Mediante este ensayo pudimos detectar la citotoxicidad específica contra diversos estímulos incluidos antígenos de M. tuberculosis. A su vez, este método nos permitió determinar que la degranulación citotóxica es el principal mecanismo involucrado en la citotoxicidad producida durante el co-cultivo de células T CD8+ aisladas con macrófagos diferenciados in vitro. Los resultados mostraron que la activación por IFN-γ, que induce una polarización de los macrófagos hacia un perfil M1, incrementó notablemente la citotoxicidad antígeno-específica inducida por células T CD8+ sobre macrófagos diferenciados in vitro en comparación con los macrófagos no activados o activados alternativamente. A su vez, la expresión de PD-L1 en los macrófagos se incrementó prominentemente luego de su activación con IFN-γ. En concordancia con esto, tanto la expresión de PD-L1 en monocitos/macrófagos como la expresión de PD-1 en células T CD8+ provenientes de derrames pleurales de pacientes con pleuritis tuberculosa se vio incrementada notablemente respecto de su expresión en células de sangre periférica, indicando que la vía de PD-1 se encuentra inducida en el sitio de infección durante la pleuritis tuberculosa. Finalmente, observamos que la inhibición de la vía de PD-1/PD-L1 mediante el bloqueo de PD-L1 incrementó la citotoxicidad específica inducida por células T CD8+ tanto en macrófagos no activados como en macrófagos activados por IFN-γ. Por el contrario, el bloqueo de PDL-1 no tuvo efecto sobre la citotoxicidad ejercida sobre macrófagos polarizados hacia un perfil M2. En su conjunto, los resultados del presente trabajo de tesis muestran que la función citotóxica específica contra M. tuberculosis es deficiente en las células T CD8+ de pacientes coinfectados con HIV y Tuberculosis. A su vez, observamos que el desbalance hormonal característico de estos pacientes contribuye a la disfunción que presentan estas células y pudimos probar la capacidad de la hormona adrenal DHEA para restaurar, al menos parcialmente, esta función. Finalmente, determinamos la importancia de la activación de los macrófagos hacia un perfil M1 sobre la capacidad citotóxica de las células T CD8+, así como el rol inhibitorio de esta función por parte de la vía PD-1/PD-L1, mediante el desarrollo de un método fehaciente para evaluar la citotoxicidad in vitro. Así, nuestros hallazgos contribuyen al conocimiento de la inmunopatología Tuberculosa en pacientes infectados con HIV, ayudando a dilucidar los procesos que subyacen a la mayor susceptibilidad a la Tuberculosis en estos pacientes. Asimismo, nuestros resultados ratifican la importancia de la inmunidad mediada por células T CD8+ durante la infección tuberculosa, contribuyendo al conocimiento de estas células como posibles blancos terapéuticos en el desarrollo de mejores tratamientos para la TB en pacientes HIV+ así como de una tan necesaria vacuna efectiva contra la Tuberculosis.

El presente trabajo de tesis tuvo por objetivo principal estudiar la regulación del transporte de glucosa en células tiroideas. Se utilizó un análogo no metabolizable de la glucosa, la 2-deoxiglucosa, a fin de determinar la actividad de transporte de glucosa en la línea celular FRTL-5. Se encontró que tanto la insulina como la TSH estimulan el transporte, y que juntas a 72 horas tienen un efecto sinérgico, mientras que a tiempos cortos el efecto de la interacción es aditivo. La forskolina reproduce el efecto de la TSH indicando que esta actúa por la vía de la proteína kinasa A (PKA). El IGF-1 tiene un efecto similar a la insulina, aunque no tan potente. El forbol miristato acetato (PMA) estimula el transporte de 2-DOG, indicando que este transporte es también regulado por la vía de la PKC. Se encontró que el efecto de la insulina es revertido parcialmente por un inhibidor de PKC, la staurosporina. Además se verifica aditividad entre la vía de la PKA y la vía de la PKC. Los yodoaraquidonatos IL-δ e ILω, que son hipotéticos intermediarios del fenómeno autorregulatorio, inhiben el transporte estimulado por TSH, insulina o ambas hormonas.

El gen de proopiomelanocortina (POMC) se expresa en un grupo de neuronas hipotalámicas, en otras del tallo encefálico y en melanotrofos y corticotrofos hipofisarios. La expresión en cada uno de estos grupos está controlada por distintas secuencias regulatorias. Para estudiar la regulación transcripcional de POMC en neuronas hemos producido una serie de ratones transgénicos conteniendo regiones flanqueantes de este gen. Los resultados obtenidos indican que secuencias 5’ distales del gen de POMC dirigen la expresión al sistema nervioso central de ratones transgénicos bajo un control temporal y espacial preciso. Las neuronas de POMC liberan β-endorfina (β-EP), un péptido opioide endógeno al que le han sido atribuidas una gran cantidad de funciones. Para determinar más precisamente la contribución de β-EP a respuestas opioides, se utilizaron ratones deficientes en este péptido. Los estudios se dirigieron a investigar la participación de la β-EP en los mecanismos de control del peso corporal y la relación existente entre este neuropéptido y el consumo de alcohol. Observamos que los ratones deficientes en β-endorfina (β-EP -/-) alcanzan luego de la pubertad un mayor peso corporal que sus hermanos normales, y esto se debería, en parte, a una alteración en la liberación de oxítocina que genera un aumento en la liberación de leche. Investigamos la respuesta de los ratones β-EP -/- al etanol analizando el efecto de la droga sobre la locomoción horizontal y la coordinación motora. El análisis de los resultados mostró una marcada diferencia en la respuesta al etanol, indicando la participación del sistema endorfinérgico en esta respuesta.

Las aves representan un eslabón fundamental en la economía internacional. A nivel mundial, alrededor del 40% de la carne consumida es de origen aviar. La industria avícola ha experimentado en los últimos años un crecimiento muy importante tanto dentro del mercado local como del internacional, permitiendo ubicar a la Argentina en el octavo lugar como exportador mundial de carne de pollo junto con otros productos. El tipo de crianza intensiva utilizada dentro de la producción avícola facilita la aparición de factores que perjudican la estabilidad de los planteles, afectando si status sanitario. Por otra parte, tanto las enfermedades respiratorias como las inmunosupresoras suelen estar íntimamente asociadas con este tipo de crianza. El virus de la Bursitis Infecciosa Aviar (IBDV) es un patógeno de alta relevancia en la producción avícola debido a que causa, entre otros efectos, inmunosupresión, dejando así a los animales propensos a nuevas infecciones. El blanco principal del IBDV es la bursa de Fabricio, órgano exclusivo de las aves, donde se desarrollan y maduran los linfocitos B. En el presente trabajo de tesis doctoral se abordó el estudio de la respuesta inmune inducida por cepas de virulencia intermedia, habitualmente utilizadas como vacunas, en el hospedador natural. Se analizaron distintas facetas como la inducción de la expresión de citoquinas en distintos órganos, la capacidad de proliferación de linfocitos y las poblaciones celulares involucradas. Se estudiaron las vías de inoculación oral e intramuscular, habitualmente utilizadas en la vacunación comercial siendo la oral la vía de entrada natural del virus. Los resultados mostraron que altas dosis de virus de cepas intermedias son capaces de imitar efectos reportados con cepas de mayor virulencia como son: una fuerte infiltración de linfocitos T en la bursa de Fabricio (analizada por citpmetría de flujo), junto con una sobreexpresión de interleuquina 6 e inter ferón gama en este órgano (analizado por RT-PCR en tiempo real) e inmunosupresión (corroborada en ensayos de coinfección con otro agente viral aviar). La segunda parte del presente trabajo de tesis se abocó al estudio de la proteína no estructural VP5 de IBDV. Su función ha sido ampliamente discutida en la bibliografía respecto a su actividad apoptótica, ya que parece tener efectos opuestos en distintos estadíos del ciclo de replicación viral. Por otra parte, también existen reportes ambiguos respecto a su localización subcelular. En el presente trabajo, mediante ensayos in vitro y utilizando técnicas de Imaging, se determinó la localización de la proteína en la membrana plasmática no exponiendo ningún dominio al espacio extracelular, contradiciendo reportes que indicaban que se trataba de una proteína de transmembrana de clase dos. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis permitieron desarrollar un método de desafío sin utilizar cepas virulentas de IBDV. Asimismo se caracterizó una amplia variedad de efectos de cepas de virulencia intermedia del virus que, aunque son habitualmente utilizadas como vacuna, no habían sido descriptos hasta el presente trabajo de tesis. En la segunda parte, se determinó la localización de la proteína viral VP5. Estos resultados brindan un abanico de posibles mecanismos de acción de la misma, que luego de ser abordados posibilitarán el desarrollo de herramientas y estrategias sanitarias para combatir este importante patógeno aviar.

La alergia a las proteínas de la leche de vaca (ALV) es la alergia alimentaria que se presenta con mayor prevalencia en el mundo y en nuestro país, pudiendo afectar hasta un 10% de la población pediátrica. En las últimas décadas se han producido cambios en la epidemiología de las reacciones alérgicas y, en particular, las alergias alimentarias han despertado una especial atención porque constituyen lo que se ha llamado la segunda ola epidémica de alergia. Además, se ha agravado la forma en que se presentan, reportándose mayor incidencia de anfilaxias causadas por alimentos. Por estos motivos, existe un marcado interés en comprender la fisiopatogenia de estos desórdenes inflamatorios y el desarrollo de terapias correctivas del defecto inmunológico que se produce en estos pacientes. Dado que las reacciones IgE-dependientes son las más prevalentes y las que originan reacciones anafilácticas, resulta crítico comprender las bases moleculares y celulares de la síntesis de la IgE. En el presente trabajo de Tesis se decidió abordar el estudio de la asociación entre la ALV y el desarrollo de pólipos juveniles (PJ) colorrectales en pacientes pediátricos que presentan sangrado rectal al momento del diagnóstico, e investigar la biología de la IgE. A partir de la caracterización del infiltrado inflamatorio alérgico que domina el estroma de los PJ, en los cuales la frecuencia de células mononucleares y eosinófilos está significativamente elevada, estudiamos distintos marcadores de una respuesta TH2-dependiente. Encontramos que las citoquinas tipo 2, interleuquina- (IL-) 4, IL-5 e IL-13, se encuentran significativamente elevadas en el estroma de los pólipos, como así también las alarminas IL-33 y TSLP, mediadores pro-inflamatorios que intervienen en las primeras etapas de una reacción alérgica. A partir de la historia clínica y los resultados positivos de la serología para IgE de los pacientes con PJ, estudiamos la localización y mecanismos de síntesis de la IgE. Encontramos centros germinales activos en la lámina propia de los PJ y marcadores biológicos que indican una síntesis local de IgE a través de mecanismos de recombinación para cambio de isotipo directo y secuencial. Asimismo, encontramos que en centros germinales individuales se sintetizan más de un isotipo de inmunoglobulina y que, según un análisis sin distinción del isotipo, se emplean genes variables de las familias VH1/7, VH3 y VH5 en la síntesis de las regiones variables de las cadenas pesadas. Como control se analizaron en todos los casos biopsias de tejido colónico adyacente a los pólipos, donde no encontramos un infiltrado inflamatorio, ni IgE, o citoquinas tipo 2. Por lo tanto, en el estroma de los PJ existen centros germinales en los que se sintetiza IgE, donde el nivel de IgE presente allí se correlaciona con la concentración de IgE presente en el plasma de cada individuo. Estos resultados en su conjunto permitirían alcanzar un mejor conocimiento de la regulación de los procesos alérgicos, de la localización y mecanismos de síntesis de IgE, y sobre la asociación entre el sangrado rectal, la presencia de pólipos colorrectales y la síntesis mucosal de IgE. Por lo tanto, es importante estudiar en pacientes con sangrado rectal la presencia de pólipos y la potencial asociación con una enfermedad alérgica para indicar la remoción de los pólipos, y definir una conducta terapéutica.

El termino Inteligencia Emocional (IE) se refiere a la capacidad de reconocer nuestros propios sentimientos y los ajenos, de motivarnos, y de manejar adecuadamente las emociones (Goleman, 1996). Estos aspectos surgen de trabajo de Salovey y Mayer (1990), quienes sostienen que la Inteligencia Interpersonal (II) es un área de la IE. La II se define como la capacidad para comprender a los demás: qué los motiva, cómo operan y cómo trabajar cooperativamente con ellos. En particular, la empatía es un aspecto de la inteligencia interpersonal, que se manifiesta en la habilidad que se posee para entender lo que están sintiendo otras personas y ubicarse en situaciones desde su perspectiva. Esta habilidad social, favorece el liderazgo, facilita el trabajo en equipo y puede contribuir a persuadir, dirigir y resolver situaciones que promuevan la cooperación. Se sostiene que la capacidad empática en los docentes de los primeros años de la universidad, influye de manera directa en la predisposición de los estudiantes hacia el estudio y cursado de las materias. Este trabajo involucró a docentes y estudiantes de primer y segundo año de las carreras de Bioquímica y Licenciatura en Biotecnología de la Universidad Nacional del Litoral. Se estudió la influencia de la capacidad empática de los docentes, en el desempeño académico de los estudiantes, teniendo en cuenta la promoción-aprobación de asignaturas. Se espera que los resultados de este estudio signifiquen un aporte para soslayar, en parte, el problema de la gran cantidad de estudiantes que abandona la universidad durante los primeros años.

El Programa Nacional de Vigilancia de Infecciones Hospitalarias de Argentina (VIHDA) permite la recolección sistemática de datos y el relevamiento de todos los episodios de infección relacionados a factores de riesgo en más de 130 nosocomios públicos y privados de Argentina. En 2010 la tasa de infección (TI) de neumonía asociada a ventilación mecánica (NAVM) en la Unidad de Terapia Intensiva Pediátrica (UTIP) del Hospital Público Descentralizado Dr. Guillermo Rawson (HPDDGR) de la Provincia de San Juan fue del 29,59 ‰, que superaba a la tasa global VIHDA (9,94‰) para el mismo periodo y procedimiento vigilado. En el año 2012 se diseñó un nuevo protocolo de profilaxis bucal (PB) que incorporó clorhexidina (CHX) 0,12% tópica como parte de las medidas de bioseguridad y prevención de NAVM en pacientes de UTIP del HPDDGR Objetivo: Conocer los efectos de CHX 0,12% aplicada en forma tópica cada 24 horas en PB sobre la TI de NAVM en pacientes de la UTIP del HPDDGR.

Fil:Hogert, Elsa Noemí. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.