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Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016.

Las pérdidas en cultivos ocasionadas por virus dependen mayormente de la severidad de los síntomas producidos. La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la producción de síntomas es de importancia para el desarrollo de estrategias que permitan reducir las pérdidas ocasionadas por fitovirus. Mediante el uso de cepas de virus de los géneros Tobamovirus y Potyvirus, el presente trabajo analizó la relación entre la severidad de sus síntomas en Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana con su capacidad para alterar diferencialmente parámetros morfológicos, fisiológicos y transcriptómicos relevantes para los procesos de desarrollo y respuestas a estrés, hormonas y defensa. Los resultados indicaron que a tiempos tempranos de la infección en tejidos sistémicos, cuando aún no son visibles los síntomas característicos de la infección, se producen cambios moleculares importantes. Éstos incluyen alteraciones en la acumulación de metabolitos vinculados con procesos de señalización y defensa, así como cambios transcriptómicos en genes clave en redes de senescencia, defensa y respuesta a hormonas. La respuesta de microRNAs con importantes roles en el desarrollo ante tratamientos con hormonas y virus exhibió un componente transcripcional y muchos de estos genes reguladores evidenciaron un patrón bifásico de cambios, sugiriendo que los procesos que conducen a su alteración en etapas tempranas de la infección difieren de los que condicionan la misma a etapas avanzadas. En Arabidopsis, gran parte de las diferencias en alteraciones fisiológicas y de síntomas inducidas por distintas cepas de un Potyvirus se perdieron en plantas mutantes para la vía del ácido salicílico. A la luz de estos hallazgos, se propone un mecanismo por el cual la retroalimentación entre ácido salicílico y especies reactivas de oxígeno determina la activación de genes clave en los procesos de desarrollo y senescencia.

La llegada de distintos tipos de señales a la superficie de las células altera la expresión génica mediante la activación de distintos caminos de transducción de señales. En este trabajo, nos enfocamos en el estudio de estímulos proliferativos y en como estos alteran la expresión del gen de respuesta inmediata, c-fos, factor de transcripción considerado como un proto-oncogén. Si bien tanto mensajero como la proteína Fos están ausentes en la mayor parte del ciclo celular, ambos aparecen y desaparecen rápidamente luego del estímulo. Nos hemos propuesto investigar la regulación de la estabilidad del ARN mensajero de c-fos dada por MAPKs. Una de las proteínas reguladoras de la estabilidad de los ARNm en la que centramos nuestro estudio es HuR, la cual se une al mensajero de c-fos en su región ARE o rica en adeninas y uracilos presente en la parte 3´UTR. Encontramos que p38 SAPK regula la asociación de HuR promoviendo su liberación del ARNm y llevándolo a degradación. Además p38 SAPK inhibe la fosforilación de HuR, sugiriendo la posible acción de alguna fosfatasa p38 dependiente. Encontramos también que KSRP se uniría al ARE de c-fos en los mismos sitios que HuR y su asociación puede revertir la estabilización dada por HuR o por la inhibición de p38, sugiriendo un rol positivo en la degradación del ARNm de c-fos.

En este trabajo de Tesis se realizó el estudio estructural de los carragenanos de gametofitos femeninos del alga roja Gigartina skottsbergii y se profundizaron los conocimientos de la estructura fina de este tipo de polisacáridos relacionándola con sus propiedades físicas. En este mismo sentido, se estudió la reaccción de ciclación de las unidades de α-galactosa 6-sulfato y 2,6-disulfato en medio alcalino que mejora el poder gelificante de dichos productos. En la Primera Parte se trataron los siguientes temas: 1.- Se cubrieron ciertos aspectos generales que incluyen: a) Presentación de los tipos de estructuras caracteristicas de los galactanos sulfatados de algas rojas; b) descripción del ciclo de vida de estas algas; c) historia reciente del estudio estructural de los carragenanos a partir del descubrimiento que los polisacáridos producidos por gametofitos y tetraesporofitos de las algas pertenecientes a la familia Gigartinaceae son diferentes; d) teorias acerca de la biosíntesis de los carragenanos; e) estudios previos realizados sobre los carragenanos de Gigartina skottsbergii y f) teorias sobre el modo en que actúan los polisacáridos polianiónicos como agentes antivirales. 2.- Una reseña de los estudios realizados sobre el comportamiento de estos polisacáridos en solución, en particular, sobre el proceso de gelificación. 3.- La espectroscopia de resonancia magnética nuclear es una herramienta fundamental en el estudio estructural de los polisacáridos de algas rojas. La resonancia magnética nuclear de ¹³C se utiliza desde hace muchos años, sin embargo, en los últimos tiempos se han aislado nuevas estructuras cuyos espectros han sido asignados. Sólo recientemente se comenzó a usar la espectroscopia de resonancia magnética nuclear protónica en el estudio estructural de galactanos sulfatados de algas rojas y todavia sus aplicaciones son limitadas; se describieron los avances logrados hasta el momento. 4.- Una de las formas de realizar el estudio de la estructura fina de los polisacáridos de algas rojas es degradarlos parcialmente y luego analizar los fragmentos obtenidos. Se realizó una revisión de las aplicaciones de la reacción de autohidrólisis al estudio estructural de polisacáridos, asi como de los conocimientos con que se contaba acerca de la selectividad de la misma, comparándola con las reacciones de hidrólisis ácida producida por un ácido externo. 5.- La reacción de ciclación de las unidades de α-galactosa 6-sulfato y 2,6-disulfato de los carragenanos para dar 3,6-anhidrogalactosa y 3,6-anhidrogalactosa 2-sulfato es de fundamental importancia para aumentar el poder gelificante de estos polisacáridos. Sin embargo, esta reacción no habia sido estudiada hasta el momento. Se describieron los conocimientos existentes acerca de este tipo de reacciones, fundamentalmentesobre derivados de glicósidos tosilados en distintas posiciones. En la Segunda Parte se realizó la descripción y discusión de los resultados que comprende los siguientes puntos: 1.- Aislamiento, purificación de los carragenanos y fraccionamiento con cloruro de potasio del producto obtenido en la primera extracción (rend. 49,1% del peso seco del alga). Se obtuvieron tres fracciones que se analizaron (1c1, rend. 42,6%, rango de precipitación 0,30-0,31 M KC1; 1C2, 3,5% 0,40-0,42 M KCl y 1C3 53,9%, soluble en KCl 2,00 M). El estudio estructural por metilación y espectroscopia de r.m.n.-¹³C y -¹H mostró que 1C1 y 1C2 son carragenanos kappa/iota, aunque ambos presentan pequeños porcentajes de unidades de α-galactosa 6-sulfato y 2,6-disulfato y cierto número de unidades inusuales; 1C3 es un carragenano mu/nu parcialmente ciclado. Los resultados obtenidos evidencian la relación biosintética entre los carragenanos gelificantes y solubles: Las unidades de 3,6-anhidrogalactosa 2-sulfato presentes en 1C1 y 1C2 se forman a partir de los residuos de α-galactosa 2,6-disulfato de 1c3. Por otra parte, las unidades de 3,6-anhidrogalactosa que se encuentran en 1C3 se formarían selectivamente a partir de un hipotético precusor común mu/nu. Además, la secuencia biosintética 1C3-->1C1 involucraría un paso de despolimerización. 2.- La reacción de ciclación de las unidades de α-D-galactosa 6-sulfato y 2,6-disulfato para dar 3,6-anhidro-α-D-galactosa y 3,6-anhidro-α-D-galactosa 2-sulfato, respectivamente es muy importante tanto desde el punto de vista académico como industrial. Se trata de una reacción de pseudo primer orden que depende de la concentración de álcali, la temperatura y la fuerza iónica del medio. A partir de la variación de esta constante de velocidad en función de la concentración de hidróxido de sodio a 60°C fue posible calcular la verdadera constante de segundo orden para la reacción (k2 = 5,2 x 10ˉ4 1 molˉ¹ sˉ¹). Por otra parte, la reacción es mucho más rápida para los carragenanos mu/nu que para los lambda. Este hecho tiene significado desde el punto de vista industrial, ya que son los primeros los que dan lugar a productos gelificantes por medio del tratamiento alcalino. Luego, en mezclas naturales obtenidas de arribazones bastaría con continuar la reacción sólo hasta obtener ciclación de las unidades de α-galactosa 6-sulfato y 2,6-disulfato de los carragenanos de la familia kappa, aún cuando estas unidades en los carragenanos de la familia lambda no se hayan ciclado. Mayor tiempo de reacción no mejora las propiedades de los carragenanos, sino que puede llevar a degradación del producto con la concomitante disminución del poder de gelificación. Algunos autores llevan a cabo la extracción de los carragenanos en medio alcalino; hay que tener en cuenta que los productos aislados en estas condiciones pueden ser diferentes de los que se encuentran originariamente en la planta, principalmente, si se busca extraer conclusiones acerca de la biosintesis de estos productos. Se realizó el tratamiento alcalino preparativo de los carragenanos 1C1, 1C2 y 1C3 y posterior subfraccionamiento con cloruro de potasio de los derivados mayoritarios (1C1T y 1C3T). Tanto los productos modificados como las fracciones obtenidas se analizaron. Un nuevo fraccionamiento de 1C3T mostró que este método no era tan reproducible como se pensaba anteriormente, a pesar de haber cuidado las condiciones en que se llevó a cabo. Sin embargo, el patrón general de precipitación se mantuvo: además de las fracciones que precipitaban a bajas concentraciones de cloruro de potasio, se obtuvieron pequeñas cantidades de polisacáridos que gelificaban a concentraciones intermedias, asi como una fracción que permanecía soluble. El estudio estructural de las fracciones insolubles indicó una estructura kappa/iota; el caracter iota aumentaba con el incremento de la solubilidad. Para las fracciones intermedias se encontró una estructura kappa/iota (1C3T5 0,80-0,90 M KCl) y iota "pura" (IF4, 1,10-1,20 M KCl) a pesar de su alta solubilidad en soluciones de cloruro de potasio. Se descartó que este comportamiento se deba a un peso molecular bajo, ya que por r.m.n.-¹³C no se detectaron las señales correspondientes a los extremos reductores. La fracción soluble en cloruro de potasio 2,00 M presenta una estructura diferente a la de las otras fracciones. Se trata de un galactano sulfatado que contiene D- y L-galactosa e importantes cantidades de cadenas laterales de unidades de galactosa y xilosa. 3.- Se realizó la autohidrólisis de 1C1. El estudio de la selectividad de dicha reacción indicó que, ademásde la ruptura de las uniones 3,6-anhidrogalactosidicas (que habia sido determinada anteriormente), también se producía la hidrólisis de las uniones α-galactosidicas cuando las mismas llevaban sulfato en las posiciones 2 y 6; en cambio ésto no sucedía cuando dicha unidad se hallaba sulfatada sólo en la posición 6. Por otra parte, el grupo sulfato en C-2 no era completamente estable en las condiciones en que se realizaba la reacción. Se efectuaron ensayos preliminares de separación de los oligosacáridos obtenidos. La degradación parcial por autohidrólisis resultó una herramienta alternativa para el estudio estructural de carragenanos, ya que los productos obtenidos dan soluciones acuosas concentradas de baja viscosidad, adecuadas para realizar espectros de r.m.n.-¹³C con equipos de baja resolución y a temperatura ambiente. Asi, a partir del conocimiento de la selectividad de la reacción, se puede deducir la estructura del polisacárido de partida. 4.- Se determinó la actividad antiviral de los carragenanos 1C1, 1C2 y 1C3, así como de sus derivados tratados con álcali. Todos resultaron activos hacia el virus Herpes simplex tipo 1. Sin embargo, los productos de menor peso molecular no fueron activos en las mismas condiciones. En la Tercera Parte se describieron los materiales y métodos utilizados.

En el presente trabajo se estudian algunos métodos de purificación de la fosfoglicerato mutasa. Se desarrollan métodos para preparar 2,3-PGA radiactivo de alta radiactividad especifica y libre de monofosfoglicerato y Glc-1,6-P2. Para este fin se estudian sistemas de solventes en electroforesis de alto voltaje. Se reinvestigan las conclusiones de Pizer (1960) acerca de la formación de una fosfo-enzima con la fosfoglicerato mutasa y se demuestra que mínimas contaminaciones de fosfoglucomutasa del orden 1/200 están presentes en las preparaciones cristalinas de fosfoglicerato mutasa. En las condiciones de trabajo de Pizer las preparaciones de 2,3-PGA no están libres de Glc-1,6-P2. La fosfoproteína que se marcaría en estas condiciones es fosfoglucomutasa y no fosfoglicerato mutasa como dicho autor sugiere. La fosfoglicerato mutasa puede aislarse, sin embargo, como una fosfo-proteína. Este complejo se forma entre la enzima y el cofactor y resulta inestable, en particular, en medio ácido. Se sugiere que el cofactor conserva su estructura original en el complejo pero que se descompone con mucha facilidad para dar ácido monofosfoglicérico y Pi cuando es sometido a electroforesis a varios valores de pH. La proporción en que aparecen dichos compuestos depende del pH. Se establece la relación molar del complejo que resulta igual a la unidad. En solución a pH neutro el complejo resulta inestable y su vida media fué calculada en un valor del orden de las 4 horas. El producto de la descomposición del complejo es Pi y constituye parte de la actividad fosfatásica de la enzima. Se busca estabilizar el complejo por desnaturalización de la enzima. Los resultados obtenidos permitirían establecer las condiciones en que dicha estabilización tendría lugar. Todos estos resultados se discuten en función de los posibles mecanismos de actividad de la fosfoglicerato mutasa. Se estudian comparativamente las secuencias de aminoácidos alrededor de las serinas activas de las fosfatasas alcalinas de Serratia marscescons y Escherichia coli. Se demuestra la existencia de al menos, un pentapéptido común a ambas enzimas. También se observan diferencias en la composición de aminoácidos en una zona cercana al pentapéptido referido.

En base a los análisis del European Centre for Medium Range Weather Forecast, en esta tesis se encara el estudio de la formación y desarrollo de los sistemas ciclónicos explosivos a través de dos situaciones particulares. Una de ellas es un ciclón marítimo, debido a que estos son los más frecuentes y la segunda situación es un ciclón terrestre ya que son los que provocan mayores perjuicios económicos. En la misma se analizan los procesos responsables de la génesis y la estructura de estos sistemas a través de la evaluación de las ecuaciones del sistema hidrodinámico que rige el movimiento atmosférico. En el caso continental se incluye además, un análisis de las componentes ageostróficas. Finalmente, como no hay una climatología de este fenómeno en la región, se identifican los casos ocurridos en el período 1979 - 1993 y se analiza su ubicación espacial y temporal. La definición elegida para este estudio es la propuesta por Sanders y Gyakum. En 1980 estos autores definieron los ciclones explosivos o bombas como aquellos sistemas donde la caída de presión a nivel del mar es de un bergeron (24 hPa en 24 horas). Como el descenso de presión no tiene el mismo impacto en cualquier latitud, estos autores modularon a este valor multiplicándolo por un factor que combina la latitud media donde se desarrolla explosivamente el ciclón y los 60º. Aunque los ciclones que sufren un período de rápido desarrollo parecen tener características comunes, no hay acuerdo si existe un único factor detonante de tal desarrollo y cual es ese factor. lncluso hay trabajos que señalan que en distintas regiones geográficas difieren las causa dinámicas que las producen. Por otro lado, el estudio de casos particulares muestra que hay distintos procesos que las pueden producir. A pesar de que este tipo de evento ha sido ampliamente estudiado en el hemisferio norte, en la región sudamericana la situación no es la misma. Debido a la escasez de trabajos que estudian las ciclogénesis explosivas en el hemisferio sur, surge el poco conocimiento que se tiene de los distintos mecanismos que puedan favorecer la generación y el desarrollo de este fenómeno en la región sur de Sudamérica. Como señalan Gan y Rao (1996), es necesario realizar investigaciones sobre casos particulares para delinear los procesos intervinientes. Las dos situaciones estudiadas tienen características comunes. Ambos sistemas comienzan como un ciclón baroclínico, con advección de vorticidad ciclónica y divergencia en altura actuando sobre una zona baroclínica en capas bajas. Los ciclones explosivos estudiados presentan fuerte divergencia en niveles altos combinada con una masa de aire cálido y húmedo capas bajas. Esta masa de aire asociada con las velocidades verticales ascendentes muy intensas producen gran liberación de calor por condensación. Esto trae como consecuencia que ambos ciclones tengan un centro caliente. En las situaciones estudiadas este calor liberado aparece como el principal responsable del desarrollo explosivo. Las componentes ageostróficas presentan valores del mismo orden de magnitud que el viento mismo. Esto indica que en estos casos actuaron procesos de escala subsinóptica. En el caso continental cuando se divide a las componentes ageostróficas según sus efectos físicos se encuentra que en la divergencia en niveles altos actúan todas las fuentes de ageostrofismo. En cambio, niveles bajos la convergencia se debe principalmente a las variaciones temporales del viento. La componente de advección vertical del viento interviene en la verticalización del sistema y colabora en su desplazamiento. En la serie de los 15 años de reanálisis de Centro Europeo se encontraron 200 ciclones explosivos al sudeste de Sudamérica, de los cuales solo el 3 % se desarrolló sobre el continente. Son más frecuentes en invierno y su posición migra con las estaciones durante el año.

La ingesta de alimento es una función vital para el reino animal ya que proporciona las necesidades nutricionales y energéticas. Existen, al menos, dos circuitos neuronales complementarios que la regulan: un circuito relacionado a los aspectos homeostáticos, dependiente de las reservas energéticas; y otro que regula aspectos hedónicos, relacionado con la recompensa que generan alimentos específicos. La ingesta de alimento, además, está fuertemente regulada por señales periféricas, como metabolitos y hormonas, que contribuyen a la regulación precisa de los circuitos neuronales que controlan el apetito. Entre las hormonas que regulan el apetito se destaca la ghrelina, la cual se produce en el tracto digestivo y es la única hormona peptídica conocida capaz de estimular la ingesta de alimento, lo cual ocurriría mediante su acción sobre ambos tipos de mecanismos de regulación. El control de la ingesta de alimento puede sufrir alteraciones que derivan en diversas situaciones patológicas. Una de ellas es el llamado atracón alimentario (binge eating), el cual se observa con alta frecuencia y se define como un evento de hiperfagia en el que se consume una gran cantidad de alimento, en un período corto de tiempo y con la sensación de una pérdida de control de lo que se está consumiendo. Episodios de atracón alimentario se pueden observar en una gran variedad de situaciones patológicas como la bulimia, los desórdenes asociados al atracón alimentario (binge eating disorders) y algunas variantes de anorexia nerviosa, así como también pueden ocurrir en personas con sobrepeso u obesidad, e incluso en la población general. La etiología de los episodios de atracón es actualmente desconocida y, lamentablemente, no existe ningún tratamiento farmacológico para mitigarlos.Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo de Tesis Doctoral fue estudiar en modelos murinos los circuitos neuronales activados por uno o varios eventos de ingesta de dieta rica en grasa y evaluar el potencial rol modulador de ghrelina sobre ellos.

La importancia del estudio de los complejos cianurados de cobre (II) es evidente ya que no se han identificado compuestos cianurados de los metales de transición con la configuración electrónica d^9. Todos los intentos realizados hasta ahora para el estudio de este sistema fueron parciales y llevaron en algunos casos a resultados incorrectos como hemos demostrado, esto es explicable si se tiene en cuenta la dificultad experimental que este estudio involucra. La alta inestabilidad del complejo violeta, sobre el cual centramos nuestro estudio, involucra una transferencia completa de un electrón de los grupos cianuros al cobre (II), esto se puede comprender si tenemos en cuenta que los orbitales 3d del cobre tienen, probablemente, una energía menor que la de los orbitales π ligantes del cianuro. Por lo tanto el único modo en que se pudo estudiar el sistema fué a temperaturas lo suficientemente bajas para que la velocidad de descomposición sea lenta. Obtuvimos e interpretamos el espectro de resonancia paramagnética del complejo violeta al estado vitreo y en solución líquida. Los espectros fueron tomados en metanol, D.M.F. y agua, el valor de los parámetros medidos es similar a el de otros complejos de cobre planares. Hemos obtenido los espectros ópticos, los cuales consisten en bandas muy anchas, común en las sales cúpricas, lo cual no permite la asignación de energías a las transiciones d-d. Intentamos efectuar esto en base a un modelo de campo ligante semicuantitativo junto con la ayuda de los valores medidos de los parámetros - del Hamiltoniano de spin, pero la incerteza de este procedimiento nos hizo desistir del mismo. Utilizando los resultados de las mediciones paramagnéticas y los espectros ópticos, concluimos que el complejo violeta es (CN)4Cu^-- para esto hemos seguido un procedimiento original donde se ratifica la importancia de la técnica de resonancia paramagnética para la elucidación de un problema estructural. Calculamos las expresiones de los parámetros del Hamiltoniano de spin utilizando el modelo de orbitales moleculares y seguimos un procedimiento aproximado que difiere del comúnmente usado para obtener α.- El error en nuestras estimaciones en el cálculo de α, probablemente, no es mayor que el introducido al tomar K0 como constante; la forma más directa de calcular α hubiera sido utilizar cianuro marcado con ^13C, del cual no disponíamos, a partir de la estructura extrahiperfina. El valor calculado de α está dentro de lo esperado por la naturaleza del complejo. En este trabajo observamos un hecho muy interesante el cual, según nuestro conocimiento, no tiene precedentes, esto es la ocurrencia del espectro "anómalo". Hemos discutido el mismo pero la aclaración definitiva de este problema está fuera de los límites de este trabajo, por lo tanto señalamos el camino a seguir en su estudio. Otro camino abierto al estudio es el de los sólidos azul y "marrón" los cuales no estuvieron dentro de nuestro interés directo.

Fil:Rinaldi, Diego Santiago. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El trabajo realizado comprende dos partes, en la primera de ellas se hace el estudio químico de los corticoides en embarazos normales y patológicos; en la segunda parte se realiza el estudio cromatográfico de los corticoides en iguales casos que los estudiados anteriormente, además se trata de comparar cuantitativamente ambas apreciaciones. El estudio químico comprende: a) valoraciones de corticoides considerados como termolábiles (Corcoran, 1948); b) valoraciones de corticoides considerados como termoestables (Tompsett, 1953) y c) sustancias consideradas como 17 hidroxicorticoides (Glenn y Nelson, 1952). Los datos obtenidos en los casos considerados permiten deducir un aumento de la excreción urinaria en razón del doble para los termolábiles, del triple para los termoestables y un poco más del triple para las sustancias consideradas como 17 hidroxicorticoides, hacia el sexto mes del embarazo; algunos casos patológicos estudiados en el período de máxima excreción no muestran mayores desviaciones con respecto a los valores obtenidos en las gestaciones normales. Las curvas de comparación en las valoraciones se hicieron: para corticoides termolábiles con ll Dehidro-corticosterona (Kendall A), para corticoides termoestables con acetato de desoxicorticosterona (Reichstein Q), y para 17 hidroxicorticoides con 17 hidroxi - ll dehidrocorticosterona (Kendall F). En la cromatografía en papel se siguió la técnica propuesta por Zaffaroni (1951), se hicieron valoraciones con los testigos correspondientes a seis hormonas puras de acción fisiológica conocida que corresponden a las siguientes sustancias: ll-Dehidrocorticosterona (Kendall A) Corticosterona (Kendall B) 17 hidroxicorticosterona (Kendall E) 17 hidroxi-ll dehidrocorticosterona (Kendall F) Desoxicorticosterona (Reichstein Q) 17 hidroxi-desoxicorticosterona (Reichstein S) Se obtuvieron los valores del índice Rf (cuya tabla figura en el trabajo), siendo los valores hallados poco distintos a los obtenidos por el autor citado. Se cromatografiaron los extractos urinarios, en diferentes tiempos mostrando que la eliminación corresponde casi exclusivamenta a la zona de los compuestos 17 hidroxicorticosterona y 17 hidroxi-ll dehidrocorticosterona. Apreciaciones aproximadas en los revelados utilizando trifeniltetrazolimm (TPTZ) y comparada con las hormonas puras permiten deducir valores comprendidos entre un décimo y un cuarenteavo del valor químico correspondiente.