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Las subpoblaciones de linfocitos Th17 y T regulatorios (Treg) han sido relacionados con la progresión a enfermedad en el contexto de la infección por HIV-1. Sin embargo, su relación con la respuesta adaptativa T CD8+ antiviral durante la infección aguda/temprana por HIV (PHI, primary HIV infection) no ha sido aún estudiada. En este contexto, el primer objetivo general de este trabajo de tesis consistió en analizar las subpoblaciones Th17 y Treg y su relación con la respuesta celular T CD8+ específica frente a HIV y parámetros de seguimiento de la infección durante la infección aguda/temprana y hasta un año postinfección (p.i). Para ello se utilizaron muestras de sangre de 14 dadores sanos (DSs), 40 PHI, 17 Crónicos y 13 controladores elite (ECs, Elite Controllers). Los porcentajes de células Th17 y Treg se encontraban severamente alterados en individuos Crónicos, mientras que todos los pacientes infectados con HIV evidenciaron un desbalance Th17/Treg comparados con DSs (incluso ECs), en concordancia con sus mayores proporciones de células T CD8+ activadas (HLA-DR+/CD38+). Un mejor estatus clínico (evidenciado por mayores recuentos de células T CD4+ y menores cargas virales y activación inmune) se asoció con mayores niveles de Th17 y menores niveles de Treg. Notablemente, se encontraron correlaciones positivas entre los niveles basales de Th17 y la funcionalidad de la respuesta T CD8+ específica frente a HIV: la capacidad de suprimir la replicación viral (VIA, viral inhibitory activity) y la proporción de células polifuncionales (IFN-γ+/CD107A/B +) tanto a tiempos tempranos como tardíos p.i, resaltando el valor pronóstico de la subpoblación Th17 en la preservación de una inmunidad celular antiviral más eficiente. La relación Th17/Treg y la intensidad media de fluorescencia relativa (IMFr) de IL-17 también se correlacionaron positivamente con VIA. Debido a la importancia del tratamiento antirretroviral (TARV) en la reconstitución inmune de individuos infectados, a continuación se decidió caracterizar las subpoblaciones Th17, Treg y su balance en sangre periférica y mucosa cervical y su implicancia en la inmunopatogénesis de HIV-1 en ausencia o presencia de TARV. Para ello se utilizaron muestras de 19 individuos TARV+ (más de 2 años con supresión efectiva de la CV), 22 pacientes crónicamente infectados naïve de tratamiento (TARV-) y 20 DSs. Tras el tratamiento, tanto la frecuencia de Th17 como la relación Th17/Treg en periferia alcanzaron valores similares a los observados en DSs, en contraste a lo observado en células Treg cuyos niveles se mantuvieron altos. Asimismo, en individuos TARV+ se observó una disminución de los niveles de activación inmune a pesar de lo cual no se alcanzaron valores normales, hallándose correlaciones negativas entre los niveles de activación celular y el balance Th17/Treg. Por otro lado, mayores niveles de la citoquina proinflamatoria IL-1β en exocervix se correlacionaron positivamente con los niveles de activación celular periféricos, sugiriendo que existiría una relación entre los niveles de inflamación sistémicos y lo observado en sitios de mucosas. Es importante destacar que el tratamiento no indujo un incremento de los recuentos de células T CD4+ CD161+ (subpoblación de células precursoras de Th17 que migran a intestino) los cuales resultaron significativamente menores a los observados en DSs. Asimismo, al estudiar el patrón de secreción de citoquinas por parte de células mononucleares de cérvix (CMCs) estimuladas, se observó que las CMCs provenientes de individuos TARV+ secretan menores niveles de IL-17A e IL-10 en relación a las de DSs. En conjunto, los resultados de la presente tesis sugieren, por un lado, la existencia de una potencial relación entre la subpoblación Th17 y el balance Th17/Treg con respuestas T CD8+ HIV-específicas que juegan un rol clave en la contención de la infección. Por otro lado, aunque el tratamiento antirretroviral parece tener un impacto positivo sobre la restauración de las funciones inmunes a nivel sistémico, tanto los niveles de precursores de células Th17 que migran a intestino como la secreción de IL-17A e IL-10 por CMCs no alcanzaron valores normales, sugiriendo que en sitios de mucosas la restauración inmune es incompleta.

El proceso de agriculturización, dado en la Argentina en los años 80 del spp, se caracterizó por el predominio del monocultivo de soja, bajo labranza convencional, en reemplazo de otros cultivos, lo cual derivó en la progresiva degradación del recurso suelo. En la Prov. del Chaco, principalmente al oeste, este proceso se intensificó en los últimos años, a expensas del reemplazo del bosque nativo por el monocultivo de soja (Glycine max (L.) Merr.), bajo siembra directa (SD). El clima chaqueño, con régimen de precipitaciones muy variable y alta evapotranspiración, influye marcadamente en el desarrollo de los cultivos. El cambio de uso del suelo, sumado a la baja producción de materia seca del cultivo de soja, generaron alteraciones en los atributos edáficos, siendo prioritario su conocimiento y cuantificación, a través de indicadores que permitan evaluar los diferentes estados y tendencias. Los objetivos de este trabajo fueron evaluar variables físicas, químicas y productivas de diferentes suelos, recientemente desmontados, que permitieran generar información sobre el impacto del monocultivo de soja sobre éstos, y crear un modelo de simulación para optimizar la toma de decisiones en la expansión de la frontera agropecuaria, teniendo en cuenta la sustentabilidad del recurso suelo. Para cumplir con los objetivos, se establecieron doce tratamientos integrando cuatro Series de suelos, representativas del sector sur del departamento Almirante Brown (Chaco), con tres condiciones de uso: bosques, un año y seis años de cultivo de soja. La evaluación del estado actual de los suelos, se determinó mediante la densidad aparente (DA) en los espesores 0 - 5, 5 - 10 y 10 - 20 cm y, en los espesores 0 - 10 y 10 - 20 cm se evaluaron los indicadores: resistencia mecánica a la penetración (RMP), carbono orgánico total (COT), nitrógeno total (N), fósforo asimilable (P), potencial hidrógeno (pH), conductividad eléctrica (CE), infiltración básica (INF) y estabilidad estructural de los agregados (EEA). Las variables productivas, se definieron a través de los rendimientos del cultivo de soja, relevados en las encuestas realizadas a los productores agropecuarios, de la campaña 2012/2013. El análisis de los datos de las variables estudiadas se realizó a través de Análisis de la Varianza y multivariado. El modelo de simulación para la evaluación de tierras, se efectuó aplicando la metodología de FAO, mediante el uso del software ALES, confrontando las características de las tierras con uno y seis años de cultivo, expresadas como cualidades, frente a los requerimientos del cultivo de soja bajo SD y en cuatro situaciones de abastecimiento hídrico. xiv DA y RMP se incrementaron cuando los suelos se destinaron a la producción de soja, siendo luego de seis años donde se detectaron los valores más altos, sin embargo, estas variables fueron diferentes entre tratamientos. Las concentraciones de COT y N, disminuyeron con el cambio de uso y el monocultivo en ambos espesores. Sin embargo, en el espesor subsuperficial, luego de un año de producción, los contenidos de N aumentaron, lo cual estaría vinculado a la mineralización de la materia orgánica. Por otra parte, todos los suelos estudiados estuvieron muy bien provistos de P, siendo las concentraciones significativamente mayores luego de un año de cultivo, disminuyendo éstas, después de seis años de monocultivo. El cambio de uso, además de un aumento del pH, de levemente ácido a neutro, produjo un aumento de la CE, atribuido posiblemente, al igual que el aumento de P, a la presencia de cenizas provenientes de la quema de la vegetación remanente posterior al aprovechamiento de la madera. Después de seis años de monocultivo, la CE disminuyó a valores próximos a los encontrados en tratamientos con bosques, posiblemente debido al lavado de las sales solubles. No obstante, en todos los casos, los suelos son clasificados por su CE como no salinos. Las mediciones de INF realizadas, no permitieron determinar diferencias significativas entre condiciones de uso, sin embargo, se observaron discrepancias importantes entre tratamientos que incidirían en la disponibilidad de agua para los cultivos. La EEA, mostró una marcada disminución al año de cultivo, debido probablemente, al gran disturbio ocasionado en el suelo, por las tareas de habilitación. Asimismo, luego de 6 años de cultivo, hubo diferencias entre tratamientos que podrían asociarse, en parte, a las concentraciones originales de COT. Los rendimientos, en el período analizado, estuvieron por debajo de la media zonal, debido principalmente a las escasas precipitaciones, no existiendo diferencias significativas entre los tratamientos. Al analizar, las relaciones entre los indicadores edáficos y su evolución en el tiempo, se corroboró que los suelos poseen diferente susceptibilidad a la degradación, fundamentalmente por cambios en los atributos que acentúan la manifestación de impedancias mecánicas en los espesores estudiados. Sin embargo, los rendimientos de los cultivos, respondieron principalmente a las condiciones meteorológicas prevalecientes en la campaña evaluada, que a las diferencias edáficas encontradas. Por otra parte, se obtuvo un modelo de simulación de evaluación de tierras, que permite predecir la aptitud de uso y los rendimientos del cultivo de soja, en base a los indicadores estudiados, en distintos escenarios climáticos. Los resultados obtenidos, marcaron la importancia de considerar las Series de suelo y sus características morfológicas, en la evaluación de indicadores de suelo y, antes de tomar decisiones sobre el cambio de uso de este recurso.

Tesis para obtener el grado de Magíster en Manejo y Conservación de Recursos Naturales, de la Universidad Nacional de Rosario, en 2019

La agricultura cumple un rol fundamental en la economía mundial, ya que permite aplacar problemáticas tales como la desnutrición y el desempleo, pero ésta depende principalmente de la gestión que se tenga sobre el recurso hídrico disponible. En la zona central de Chile se ubica la V región de Valparaíso, la cual se destaca a nivel nacional en la actividad agrícola por la exportación de paltas. Esta región se ha visto afectada por distintos eventos agroeconómicos (sequía, asentamientos urbanos, crisis económicas mundiales, etc.) desafiando la eficiencia del sistema productivo de esta especie frutícola. Esta tesis pretende analizar el escenario productivo de la palta, el efecto de la escasez de agua, la variabilidad en la precipitación (nieve-lluvia) y la temperatura sobre la productividad, así como evaluar la capacidad adaptativa de los productores mediante cambios en la redistribución espacial de establecimientos productivos y cambios en la tecnología y la gestión del riego. Mediante el uso de imágenes satelitales Landsat se relevó la cobertura superficial de nieve, observando relaciones entre la temperatura, el caudal de verano y la disponibilidad de agua para riego en los meses más críticos en la producción del palto. La superficie de nieve en 28 años mostró un comportamiento variable y las temperaturas mínimas y máximas en invierno no presentaron una tendencia clara, mientras que las temperaturas máximas tienden a aumentar, según lo registrado en algunas estaciones, para el mes de enero. Desde un enfoque descriptivo los resultados sugieren que la cuenca del río Aconcagua está atravesando por un periodo de escasez hídrica desde el año 2007, aunque este evento es periódico. El impacto negativo provocado por la disminución de este recurso sobre el sistema productivo del palto se ha visto reflejado en los costos asociados para el productor, invirtiendo en tecnología para un riego eficiente, relocalizando las plantaciones en laderas para evitar la pérdida del fruto por las heladas y aumentando la densidad de paltos por hectáreas en detrimento de la superficie plantada. Finalmente, se discuten sobre futuras líneas de investigación y la necesidad de implementar herramientas de análisis de serie temporal, entre otras.

Esta tesis pretende analizar el escenario productivo de la palta, el efecto de la escasez de agua, la variabilidad en la precipitación (nieve-lluvia) y la temperatura sobre la productividad, así como evaluar la capacidad adaptativa de los productores mediante cambios en la redistribución espacial de establecimientos productivos y cambios en la tecnología y la gestión del riego. Mediante el uso de imágenes satelitales Landsat se relevó la cobertura superficial de nieve, observando relaciones entre la temperatura, el caudal de verano y la disponibilidad de agua para riego en los meses más críticos en la producción del palto.

La modificación de los enlaces disulfuro en las proteínas (escisión, formación e isomerización) es asistida por una creciente familia de proteínas denominadas protein disulfuro oxidoreductasas (PDOR). El mecanismo de acción de estas enzimas se basa en la rápida velocidad con la cual los residuos cisteína de su sitio activo (-Cys-X-Y-Cys-) llevan a cabo los intercambios tiol-disulfuro con los grupos sulfhidrilo o enlaces disulfuro de las proteínas sustrato. En el presente trabajo se desarrolló un novedoso procedimiento para determinar la actividad de las PDORs (Capítulo 1) y se purificó a homogeneidad y se caracterizó tanto estructural, como cinéticamente, la Protein Disulfuro Isomerasa (PDI) de colza (Brassica napus) (Capítulo 2). El método desarrollado para la medición continua de la actividad de las PDORs se basa en la escisión de los enlaces disulfuro de la insulina derivatizada en sus extremos amino terminales con una sonda fluorescente (fluoresceína). La velocidad del incremento en la fluorescencia de la "di Insulina-fluoresceintiocarbamilada" (di Ins-FTC) es lo suficientemente sensible para estimar concentraciones de Tiorredoxina (Trx) de E. coli desde 5 nM hasta 500 nM. Además, el ensayo permite estudiar, empleando reductores no-fisiolólogicos (DTT), el efecto del pH sobre la actividad de estas enzimas sin la interferencia de enzimas accesorias (e.g. NADP-Trx-reductasa). Utilizando este ensayo, se purificó por primera vez, una PDI de semillas de una planta dicotiledónea. Los estudios estructurales revelaron que la PDI de colza es una glicoproteína homodimérica (57 kDa la subunidad) sustituida con un solo oligosacárido del tipo alta manosa. La PDI es estable a la desnaturalización térmica, y la presencia del oligosacárido no alteraría su estabilidad. Sin embargo, la remoción del oligosacárido disminuyó un 60% la actividad reductasa de la PDI. La PDI cataliza tanto la formación, la escisión como la isomerización de los enlaces disulfuro en varias proteínas sustrato. Dos factores son fundamentales en estas reacciones de intercambio tiol-disulfuro: a) el pH y b) el potencial redox del medio. El empleo de la di Ins-FTC como sustrato para medir la actividad reductasa de la PDI y de la Trx, permitió determinar que a pesar de compartir un sitio activo característico y una similitud estructural, ambas enzimas poseen pH óptimos distintos. La Trx cataliza esta reacción a pH neutro o ligeramente alcalino, mientras que la PDI lo hace más eficientemente a pH levemente ácido. Sin embargo, cuando se analizó la efectividad de la PDI en la catálisis de la formación y de la isomerización de las cistinas, la mayor eficiencia se obtuvo a pH levemente alcalinos. Por otra parte, a potenciales redox equivalentes a los que existirían dentro del retículo endoplásmico, la PDI acelera tanto la formación como la isomerización de los enlaces disulfuro. Pero a potenciales más reductores, estas actividades disminuyen y aumenta la capacidad para escindir estos enlaces. Estos estudios sugieren que tanto el pH intracelular, como los niveles de GSH reducido y oxidado (potencial redox) pueden modular la tendencia a la formación o a la escisión de los enlaces disulfuros cuando la PDI es el catalizador. Finalmente, la PDI de colza fue efectiva en la reducción de los enlaces disulfuro de una proteína de reserva presente en la semilla de colza: la napina. Estos resultados en conjunto, sugieren que la PDI podría proveer una vía alternativa para la reducción de varias proteínas presentes en la semilla, además de la ya propuesta para la Trx-h, en los eventos tempranos de la germinación.

The dynamic of capillary imbibition of various polymers in porous silicon and anodic alumina matrices was studied using interferometric techniques. The analysis of the filling dynamics allows one to investigate the polymer viscosity under confinement. The applicability of the technique was validated with unentangled polymers, having relatively low viscosities. To the date, there are no reports on a technique providing the advantages here presented: high temporal-spatial resolution, precise information on the dynamics of imbibition even at the first instants of the process and simplicity of the experimental set-up with capability of adaptation to vacuum systems. The interplay between optics, fluid dynamics and material science fundamentals, allowed the development of a new technique, also based on interferometry, but with greater application capabilities. This allowed the study of polymers under confinement as a function of temperature, expanding the applicability to very high viscosity polymers. In addition, the same fundamentals boosted the invention and development of a microfabrication technique termed "Capillary Imbibition Laser Lithography". The method allows the manufacturing of porous microchannels through the selective imbibition of hot-melt materials in porous membranes, promoted by a localized heating of the material. The common requirement of high specific surface for the micro-devices, typical of porous materials, added to other advantages like avoiding bonding steps, makes this development attractive to the microfluidic technology market, which today beats 2000 million dolars, with a sustained growth predicted until 2025.

Lippia alba (Miller) N.E. Brown es un arbusto aromático ampliamente utilizado en medicina tradicional. Esta planta presenta diversos quimiotipos (variantes químicas intraespecíficas dentro de una misma especie botánica) distribuidos a lo largo del continente americano que explican, en parte, la variedad de efectos biológicos que se le han asociado. Los aceites esenciales (AEs) extraídos de esta planta contienen una gran cantidad y variedad de monoterpenos, muchos de los cuales presentan actividad antiproliferativa en células tumorales tanto in vitro como in vivo. Este evento, así como el potencial efecto hipolipemiante, se asocia a las múltiples acciones que los monoterpenos presentan sobre la vía del mevalonato (VM), una ruta muy compleja en la cual se generan metabolitos que desempeñan funciones esenciales en el crecimiento, la proliferación y el mantenimiento de la homeostasis celular. En esta vía se generan diversos productos finales como el dolicol, ubiquinona y el colesterol, siendo este último el mayoritario. Adicionalmente, la VM provee intermediarios fundamentales para la prenilación de proteínas, como las pertenecientes a la superfamilia Ras, con funciones reguladoras de la proliferación y supervivencia celular. Con el objetivo de analizar la utilidad de AEs de L. alba en el tratamiento de la hipercolesterolemia y prevención y tratamiento del cáncer, en este trabajo se evaluó la capacidad antiproliferativa, anticolesterogénica y los efectos sobre el metabolismo lipídico de cuatro quimiotipos –carvona (AELca), citral (AELci), piperitona (AELpi), tagetenona (AELta)- utilizando células HepG2 (procedentes de un hepatocarcinoma humano) como modelo de célula hepática y A549 (provenientes de adenocarcinoma de pulmón humano) como tipo celular extra-hepático.

La osteoporosis se caracteriza por pérdida de masa ósea con alteraciones en la microarquitectura ósea resultando en un aumento en el riesgo de fractura. Es conocido que el ácido zoledrónico (Z) disminuye la resorción ósea, mientras que el monofluorofosfato de sodio (MFP) aumenta la formación ósea. Se ha planteado la hipótesis que el efecto del MFP sería más efectivo sobre un hueso expuesto a alto estado de remodelación, debido a los factores de crecimiento liberados de la matriz ósea. Sobre esta hipótesis se evaluó el efecto de un tratamiento secuencial con MFP y ácido zoledrónico en ratas ovariectomizadas (OVX) con modificaciones simultáneas de la remodelación ósea empleando dietas con diferente contenido de calcio. Se utilizaron ratas Sprague Dawley de 7 semanas (n=7/grupo). Las ratas fueron ovariectomizadas, alimentadas con dieta hipocálcica por 30 días, tratadas con MFP y dieta hipercálcica por 60 días y finalmente con ácido zoledrónico y dieta hipercálcica (OVX.G3) hasta finalizar el tratamiento (150 días). Se realizaron controles: Sham: cirugía simulada, OVX: OVX sin tratamiento, OVX.G1: OVX con tratamiento secuencial con MFP y ácido zoledrónico pero con dieta normocálcica, OVX.G2: OVX con dieta hipo e hipercálcica sin tratamiento. Se realizaron mediciones bioquímicas de marcadoras de metabolismo óseo tanto plasmáticas como urinarias a 30, 90 y 150 días. Luego del sacrificio se extrajeron las tibias, en las cuales se realizó histomorfometría estática en tibia derecha y se analizó la morfometría y la densidad mineral ósea en tibia izquierda, y los fémures donde se realizaron determinaciones biomecánicas. A 30 días se halló una disminución del volumen óseo trabecular, un aumento de la fuerza de fractura cortical con disminución de la fuerza máxima trabecular en el grupo OVX alimentado con dieta normocálcica. El grupo OVX tratado con dieta hipocálcica demostró a 30 días un aumento del remodelado óseo, un incremento en el porcentaje de superficie erodada, mayor número de osteoclastos y menor fuerza de fractura trabecular. A 90 días no se hallaron diferencias en los parámetros istomorfométricos ni en las variables biomecánicas entre los diferentes grupos. A 150 días el grupo que recibió dieta hipo e hipercálcica y tratamiento con MFP y ácido zoledrónico presentó disminución del remodelado óseo, aumento de la densidad mineral ósea y aumento del volumen óseo trabecular a expensas de un aumento del número de trabéculas. Estos resultados se reflejaron en un aumento de la fuerza de fractura a la compresión y un aumento de la rigidez del hueso trabecular. A nivel cortical se observó un aumento en la fuerza de fractura. Las modificaciones en los parámetros mencionados no fueron observadas en los grupos controles. Se concluye que el tratamiento secuencial con MFP y ácido zoledrónico es más efectivo con la combinación de dietas hipo e hipercálcica que el tratamiento secuencial con MFP y ácido zoledrónico sobre un hueso sin remodelado óseo aumentado.

Las propiedades quimioterapéuticas e hipolipemiantes de los compuestos de origen vegetal han recibido gran atención con el objetivo de encontrar sustancias que puedan ser usadas como alternativas a las drogas convencionales. Los monoterpenos -presentes en aceites esenciales de frutas cítricas y plantas aromáticas- están siendo activamente muy estudiados debido a su bajo costo, buena biodisponibilidad y escasa toxicidad. Se demostró que muchos de ellos ejercen múltiples efectos sobre la vía del mevalonato (VM) en células de mamíferos que podrían causar los efectos terapéuticos deseados. La VM produce isoprenoides que son incorporados en diversos productos finales como colesterol, dolicol y ubiquinona o grupos prenilo utilizados por preniltransferasas para las modificaciones postraduccionales de ciertas proteínas de la superfamilia Ras y Rho, GTPasas pequeñas que regulan importantes procesos celulares, como proliferación celular, diferenciación, apoptosis y organización del citoesqueleto. Mutaciones en los genes que codifican estas proteínas forman oncogenes encontrados en una amplia variedad de tumores; por ejemplo, en un 90% de las neoplasias de páncreas, 50% de las tumoraciones de colon y tiroides y, aproximadamente, en un 30% de las leucemias mieloides y en el cáncer de pulmón. La etapa limitante de la velocidad de la VM es catalizada por la 3-hidroxi-3-metil glutaril coenzima A reductasa (HMGCR), enzima que se encuentra regulada -a nivel transcripcional, traduccional y postraduccional- a través del propio colesterol y de algunos intermediarios de la vía. La VM está presente en células de todos los tejidos estudiados y es particularmente activa en el hígado, órgano que cumple un rol central en el mantenimiento de la homeostasis del colesterol corporal. La familia de las estatinas está constituida por drogas naturales (de origen fúngico), semisintéticas (obtenidas por modificaciones de las anteriores) y sintéticas. Estos compuestos son estructuralmente similares a la mevalonolactona, característica que les posibilita actuar como inhibidores competitivos de la HMGCR. Uno de los posibles efectos de las estatinas es la modulación del crecimiento celular. Las estatinas se utilizan con éxito en el tratamiento de la hipercolesterolemia, ya que ocasionan una disminución del contenido de colesterol celular que se traduce, vía SREBPs, en un incremento del número de receptores para LDL con el concomitante aumento de la captación de LDL-colesterol del plasma. La dosis recomendada en terapias hipocolesterolemiantes en humanos es menor a 1mg/Kg/día. Pero, aún a dosis terapéuticas, las estatinas causan en ocasiones disfunción hepática, progresión de las cataratas, disfunción eréctil, miopatías, sensibilidad al tacto o debilidad con niveles elevados de creatina quinasa. Hipótesis de Trabajo - Debido a sus múltiples efectos sobre la vía del mevalonato, los monoterpenos tendrían “in vivo” efectos hipocolesterolemiantes y antitumorales - El hecho de que la inhibición de la HMGCR por los monoterpenos se produzca a través de un mecanismo diferente del empleado por las estatinas y que además afecten a la vía del mevalonato a otros niveles, sugiere la posibilidad de que el uso combinado de estatinas con monoterpenos naturales permita disminuir la dosis efectiva de estatinas en el tratamiento de hipercolesterolemias e incrementar la eficacia de ambos compuestos. Objetivos - Evaluar in vivo la actividad hipocolesterolemiante e hipolipemiante del geraniol (G) y avanzar en el conocimiento de los mecanismos de acción de este monoterpeno en el metabolismo del colesterol y los triglicéridos mediante el estudio de la expresión de genes claves como el de HMGCR, el receptor de LDL y de SREBP. De este modo, se avanzará en el conocimiento de los beneficios que aporta G en la prevención / tratamiento de enfermedades cardiovasculares. - Estudiar el efecto antitumoral de G y de las estatinas in vivo, utilizando un modelo de adenocarcinoma de pulmón humano, en células A549 implantadas en ratones atímicos, con el fin de aportar conocimientos sobre los mecanismos por los cuales podrían ejercer actividad antitumoral, como así también determinar la relación existente entre la VM y el control del crecimiento celular. - Estudiar el efecto y mecanismo de acción de la combinación de estatinas (simvastatina) con monoterpenos (G) sobre el metabolismo lipídico, la síntesis de colesterol y el crecimiento tumoral. Metodología Ensayos con Geraniol: Para los estudios in vivo se utilizaron ratones NIH nu/nu. Los animales de aproximadamente 6 semanas de edad, provistos por el Centro Atómico Ezeiza, fueron criados en nuestro bioterio en ambiente climatizado, con ciclos de luz (6 a.m. a 6 p.m.) y oscuridad (6 p.m. a 6 a.m.) controlados en forma automática. Estos fueron alimentados “ad libitum” con una dieta standard de laboratorio para roedores esterilizada con radiación gamma, permitiéndoseles libre acceso al consumo de agua esterilizada en autoclave. Los ratones se dividieron en dos grupos: animales no portadores y animales portadores de tumor, los cuales fueron implantados subcutáneamente con la línea tumoral A549. Cada grupo fue subdividido en lotes experimentales que recibieron una dieta suplementada con cantidades crecientes de geraniol (0; 25; 50; 75 mmol de geraniol/Kg dieta) durante 21 días. Durante el tratamiento el tumor fue medido dos veces por semana. Se cuantificó trigliceridemia y colesterolemia utilizando un kit enzimático, síntesis lipídica en hígado por incorporación de [14C]acetato y contenido hepático de colesterol (libre y esterificado) y de ácidos grasos por métodos bioquímicos. Se determinó HMGCR por western blot y se midió su actividad enzimática en microsomas de hígado aislados. Se establecieron los niveles de ARNm de HMGCR, del receptor de LDL y del factor de transcripción SREBP-2 por RT-PCR a partir de ARN hepático aislado. Se determinaron los niveles de apoptosis tumoral por el método de TUNEL y midiendo la actividad de caspasa-3 y se cuantificó Ras en homogenado y en membrana del tumor. Ensayos con Simvastatina: Se utilizaron ratones NIH hembras portadoras del genotipo nu/nu. Los animales de aproximadamente 6 semanas de edad, provistos por el Centro Atómico Ezeiza, fueron criados en nuestro bioterio como se detalla anteriormente. Luego de ser implantados subcutáneamente con la línea tumoral A549 se dividieron en dos grupos, control y experimental, al que se le suplementó la dieta con Simvastatina (0.5mM) en el agua de bebida. El tratamiento se prolongó por 3 semanas. Dos veces por semana se midió el crecimiento relativo del tumor, en los diferentes lotes de animales, utilizando un calibre. Luego de finalizado el tratamiento los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron los tumores y los hígados de los mismos. Se determinó el porcentaje de células apoptóticas en los tumores obtenidos al momento del sacrificio de los animales y se cuantificó la proteína Ras en homogenado y en membrana plasmática del tumor. Aquí también se determinó síntesis lipídica hepática y contenido de colesterol (libre y esterificado) y de ácidos grasos en hígado. Ensayos con Geraniol y Simvastatina: animales portadores de tumor subcutáneo de células A549, se separaron en cuatro grupos: un grupo control y tres grupos experimentales; un grupo tratado con G (50 mmol / Kg de dieta) adicionado al alimento, otro con S (50 mg / Kg peso / día) suministrada en el agua de bebida y un grupo con la combinación de ambos compuestos a las concentraciones previamente mencionadas (G + S). El tratamiento se realizó durante tres semanas, en las cuales se monitoreó el crecimiento de los tumores y se controló asimismo el peso, el consumo de alimento y de agua de los animales. A las 3 semanas de tratamiento los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y se obtuvieron muestras de suero, hígado y tumor. Se midió apoptosis tumoral y los niveles de Ras total y Ras anclada a membrana plasmática de las células tumorales. Se determinó colesterol plasmático, hepático y tumoral, incorporación en hígado y en tumor de [14C]acetato en lípidos totales, lípidos insaponificables y ácidos grasos. Resultados y Conclusiones - Hemos demostrado que el geraniol tiene efectos hipolipemiantes y antitumorales “in vivo” en ratones nude con dosis que no presentan toxicidad. - Se avanzó en el conocimiento de los mecanismos de acción de este monoterpeno sobre la vía del mevalonato debido a que hemos demostrado: - Inhibición de la HMGCR a nivel postranscripcional, con una disminución de la cantidad y actividad de la enzima. Como consecuencia de ello disminuye la colesterogénesis en hígado y en tumor y aumenta la expresión del receptor de LDL hepático como mecanismo compensatorio al descenso del colesterol intracelular. - Inhibición de la cantidad de proteína Ras unida a membranas sin modificación de los niveles totales de la misma. Estos resultados sugieren una disminución de la prenilación por limitación en la disponibilidad de precursores o bien por inhibición directa de las preniltranferasas. - Se demostró una disminución de la síntesis de ácidos grasos que sugiere un posible mecanismo responsable del efecto hipolipemiante ejercido por el geraniol. - Se demostró un efecto proapoptótico y antiproliferativo del geraniol. A partir de nuestros resultados se sugiere que estos efectos se deberían a la limitación en la disponibilidad de lípidos esenciales para el crecimiento tumoral. - La administración combinada de geraniol y simvastatina inhibió significativamente el crecimiento e indujo la apostosis tumoral, y demostró tener un efecto sinérgico sobre la inhibición de la síntesis de lípidos tanto hepáticos como tumorales. Esto reforzaría la hipótesis de la acción inhibitoria del geraniol en distintos puntos de vías del metabolismo lipídico. Consideramos que la labor desarrollada en el presente trabajo colabora con una mejor comprensión de la acción de un componente muy frecuente en los aceites esenciales sobre una compleja vía metabólica, con el objetivo de mejorar el diseño de estrategias terapéuticas que incluyan el uso de compuestos naturales de manera individual o en combinación con drogas sintéticas para la lucha contra el cáncer y enfermedades asociadas a dislipemias.