Catálogo de publicaciones

El uso de compuestos moduladores de las respuesta inmune (MRI) frente a infecciones intramamarias (IIM) en bovinos, constituye una alternativa a los tratamientos tradicionales con antibióticos durante la involución mamaria. El objetivo general fue estudiar los efectos de un extracto de Panax ginseng (PG) como MRI y esclarecer su mecanismo de acción in vitro en cultivos de células bovinas. Asimismo, se evaluó la eficacia del compuesto, en combinación con cefalexina, para eliminar y prevenir nuevas IIM durante el periodo de involución mamaria y su efecto sobre la producción de leche en la lactancia siguiente. En células epiteliales mamarias bovinas (MAC-T), PG estimuló la expresión génica y proteica de interleuquina (IL)-6 a las 12 y 24 hs post tratamiento (pt) y de IL-4 a las 24 hs pt. En macrófagos bovinos, PG estimuló la expresión génica del receptor tipo toll (TLR)4 y el factor de transcripción nuclear-kappa B (NF-B) a las 12 y 24 hs pt. Se detectó un efecto significativo del tratamiento con PG y del tiempo de exposición sobre IL-8, factor de necrosis tumoral (TNF)-α e IL-1β, observándose los mayores niveles de expresión a las 12 y 24 hs pt. En MAC-T, PG redujo en forma significativa la internalización de dos cepas de Staphylococcus aureus. En macrófagos, la capacidad fagocítica y los niveles de especies reactivas de oxígeno y óxido nítrico, no se vieron influenciados por PG. Las pruebas de campo demostraron que la eficacia de PG + cefalexina como terapia de secado fue similar a la terapia con cefalexina, no observándose efectos adversos aparentes con la combinación del MRI y el antimicrobiano. Las tasas de nuevas IIM al pos parto de los animales tratados con PG + cefalexina fueron similares a las detectadas con cefalexina, demostrándose un efecto preventivo similar. El tratamiento intramamario con PG + cefalexina no tuvo efectos negativos sobre la producción de leche y el recuento de células somáticas. Este trabajo aporta nuevos conocimientos acerca de los efectos de PG como potencial MRI en glándula mamaria bovina, aunque son necesarias pruebas de eficacia a mayor escala a los fines de promover el desarrollo de nuevos productos y su transferencia tecnológica al sector lácteo.

Fil:Pastori, Ricardo Luis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Paveto, María Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El objetivo general de esta tesis es contribuir al estudio del mecanismo de activación de las proteinas quinasas dependientes de cAMP (PK A). Algunos de los grandes problemas a dilucidar en este tema son: si la enzima necesita disociarse en sus subunidades catalltica y regulatoria para activarse por cAMP , si el cAMP es el único agente necesario para la activación de la enzima y cómo se adquiere la selectividad de sustratos. Para este trabajo se han utilizado como modelos dos eucariontes inferiores. 1) PKA parcialmente purificada del hongo dimórflco Mucor rouxii, y ensayos in vitro. 2) Mutantes de subunidad regulatoria (bcy1) de la PKA de la levadura Saccharomyces cerevisiae con un abordaje genético-bioquímico-molecular. Utilizando el primer modelo y trabajando a concentraciones de holoenzima del orden de nM hemos llegado a las siguientes conclusiones (Mechanism of activation of cAMP-dependent protein kinase. In Mucor rouxii the apparont specific activity of the CAMP activated holoenzyme is different to that of its free catalytic subunit”. V.Zaremberg, A.Donnella-Deana and S.Moreno. Enviado a Archives in Biochemistry and Biophysics). - en este rango de concentración la actividad enzimática utilizando péptidos sintéticos como sustratos no es lineal con la concentración de enzima. Con la proteina protamina, utilizada como referencia, la actividad es casi lineal en el mismo rango de concentración. - la dependencia de la actividad fosforilante de cada péptido, con el cAMP, el grado de inhibición por un péptido inhibidor especifico y la modulación por policationes dependen del péptido utilizado. - en todos los ensayos arriba mencionados la relación de las actividades fosforilantes de la enzima con los distintos péptidos, comparados entre si o con la protamina, es diferente a la misma relación estimada a partir de las actividades medidas con la subunidad catalitica libre. Estos resultados se explican con dos modelos posibles: a) la subunidad catalitica libre es la entidad que fosforila los sustratos y el nivel de producción de subunidad C depende del cAMP y del sustrato; b) a altas concentraciones de holoenzima, existe holoenzima sin disociar con cAMP unido; esta especie es cataliticamente activa y la selectividad de esta especie por los sustratos es diferente a la de la subunidad catalitica libre. En el segundo modelo se han utilizado mutantes espontáneas, cedidas por el Dr. Kelly Tatchell, en el gen que codifica para la subunidad regulatoria (bcy1) de la PKA. En un primer trabajo (Analysis of the mechanism of activation of cAMPdependent protein kinase through the study of mutants of the yeast regulatory subunit. ” V.Zaremberg and S.Moreno, Eur.J.Biochem. 237: 136-142, 1996) trabajando con las cepas mutantes se obtuvieron los siguientes resultados: - los niveles de las subunidades regulatoria ( R) y catalltica (C ) en las cepas mutadas son similares a los de la cepa salvaje. - Una medida aproximada de la afinidad de las subunidades R mutadas por el CAMP, indicó que se encuentra disminuida. - Midiendoactividad de PKA en células penneadas en ausencia y presencia de cAMP, se encontró que las mutantes demuestran actividad dependiente de cAMP,aunque tienen una actividad basal elevada. - Los fenotipos se hicieron más severos si el fondo genético de las levaduras era RAS2; y permanecieron iguales por sobreexpresión del gen para PDE2. En la tercera parte de la tesis, y utilizando el mismo modelo de S.cerevisiae se encaró la sobreexpresión de algunas de las mutantes bcy1: construcción de los vectores correspondientes, estudio de la sobreexpresión y análisis de los fenotipos resultantes. El conjunto de estos resultados (manuscrito en preparación) confirma la conclusión que obtuviéramos en la primera parte: las holoenzimas mutadas tienen actividad enzimática. Del conjunto de los resultados genético-bioquímicos obtenidos hasta ahora en el sistema de las mutantes de levadura hemos concluido, que las holoenzimas mutadas tienen actividad fosforilante de proteinas sin necesidad de disociarse en sus subunidades, que la capacidad fosforilante de proteinas es diferente para cada mutante (diferentes fenotipos) y proponemos que los cambios conformacionales producidos por las mutaciones pueden ser similares a los introducidos por el cAMP al interactuar con la holoenzima.

Una serie de sólidos Mn-Ce-O de diferente composición ha sido preparada por coprecipitación en NaOH e KOH con el objetivo de analizar el efecto del metal alcalino, luego los sólidos fueron lavados, secados y calcinados. Algunos de los que se obtuvieron a partir de NaOH fueron impregnados con una sal de Cu2+ previamente a la calcinación. De esta manera se obtuvieron tres series de catalizadores denominadas: Mn-Ce (Na), Mn-Ce (K) y Mn-Ce (Na) Cu, entre paréntesis se hace referencia al agente coprecipitante y a la derecha de este se indica el elemento que ha sido impregnado. La caracterización de los mismos se llevó a cabo por varias técnicas: DRX, FTIR, XPS, SEM, BET, TPR y adsorción de Fenol en fase acuosa. El estudio de actividad catalítica se realizó mediante la oxidación de Fenol en medio acuoso, en un reactor de vidrio operando en modo batch a la temperatura de ebullición normal del Agua. La conversión se cuantificó mediante HPLC y espectroscopia UV-VIS y los catalizadores se analizaron después de la reacción por espectroscopía DRIFT, con la finalidad de estudiar las especies adsorbidas sobre los catalizadores y proponer un posible mecanismo de adsorción-oxidación de Fenol sobre los sólidos preparados. Finalmente, mediante el estudio DRIFTS y aplicando la teoría DFT se ha propuesto un mecanismo de adsorción-oxidación de Fenol sobre los catalizadores Mn-Ce-O.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

Las hemoproteínas son un conjunto ubicuo y extenso de proteínas, con una enorme diversidad funcional relacionada con la versátil reactividad del ion de hierro del grupo hemo. La gran mayoría de sus funciones biológicas involucran la unión de ligandos pequeños al metal, regulada por la identidad y dinámica de los aminoácidos de su entorno. La presente tesis tiene como objetivo aportar información microscópica acerca de los mecanismos de reacción de distintas hemoproteínas con moléculas pequeñas de relevancia biológica, como ser O2, H2 O2, NH2OH e hidropersulfuros, utilizando una combinación de técnicas de simulación computacional y experimentales, que incluyen, por un lado, dinámica molecular clásica (que abarca técnicas de muestreo demúltiples réplicas) e híbridas cuántico-clásicas (para el estudio de fenómenos reactivos), y por otro espectroscopía UV-visible, cinética de reacción utilizando un equipo flujo detenido y un electrodo sensible a HNO, recientemente desarrollado por el grupo donde fue realizada la presente tesis, para el seguimiento de su producción. En primer lugar fue estudiada —por técnicas de simulación—la unión de sustrato y el mecanismo de reacción de dos dioxigenasas hémicas, la indolamino 2,3-dioxigenasa y triptófano 2,3-dioxigenasa, mostrando cómo la dinámica de un loop flexible modula la actividad enzimática al regular la entrada/salida de sustrato. En segundo lugar, se estudió la producción de HNO debido a la peroxidación de hidroxilamina catalizada por mioglobina. Se utilizaron técnicas experimentales para caracterizar la cinética de reacción, y luego se analizó el mecanismo de reacción a través de métodos computacionales. Por último, se estudió experimentalmente la reacción de hidropersulfuros con mioglobina,mostrando la capacidad de los mismos de regular la reactividad del grupo hemo.

Los antibióticos β-lactámicos son la clase de antibiótico más utilizada. Sin embargo, el uso indiscriminado de antibióticos propulsó la generación de mecanismos de resistencia bacterianos. La diseminación global de esas estrategias entre bacterias de diferentes especies hace que los antibióticos conocidos se tornen ineficientes. Para restablecer la efectividad de los compuestos conocidos, se propone incorporar a los tratamientos inhibidores de los mecanismos de resistencia. El mecanismo más potente y mayormente empleado por las bacterias para hacer frente a la acción de antibióticos β-lactámicos es la producción de β-lactamasas. Estas enzimas hidrolizan el anillo β-lactama, dejando al compuesto inefectivo. Dentro de estas enzimas se encuentran las metalo-β-lactamasas (MβLs), que son enzimas dependientes de Zn(II), cuya relevancia clínica se debe a su capacidad para hidrolizar eficientemente los antibióticos β-lactámicos utilizados como último recurso, los carbapenemes. Al momento, no se cuenta con inhibidores de uso clínico para estas enzimas. Dentro de las MβLs, las enzimas de subclase B1 son las de mayor relevancia clínica. La enzima B1 New Dheli Metallo-β-Lactamase-1 (NDM-1), es una de MβLs de mayor relevancia clínica debido a su rápida diseminación y eficiente actividad carbapenemasa. Esta enzima posee dos iones metálicos en su sitio activo, ocupando los sitios conocidos como sitios 3H o 1 y DCH o 2. En el presente trabajo se propuso estudiar las características bioquímicas y biofísicas de esta enzima, el mecanismo por el cual cataliza la hidrólisis de carbapenemes y la relación entre la estructura su mecanismo catalítico.Se logró purificar a NDM-1 en forma soluble con buen rendimiento y contenido metálico. Esta enzima mostró ser eficiente al hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. La capacidad de unir Zn(II) fue medida por ensayos de competencia frente al quelante colorimétrico PAR. Estos ensayos mostraron que la incorporación de metal ocurre de manera secuencial, siendo mayor la afinidad por el primer ion metálico que por el segundo. Luego de la remoción del metal nativo, la enzima pudo incorporar Co(II) y Cd(II) en ambos sitios metálicos. Ambas proteínas metalo-sustituídas fueron activas, demostrando que estos metales pueden utilizarse como sondas espectroscópicas funcionales en esta enzima. El espectro de absorbancia de la proteína bi-Co(II)-NDM-1 mostró un patrón de 5 bandas de campo ligando (bandas d-d), propias de la coordinación de los iones metálicos en el sitio 3H, y una banda de transferencia de carga metal-ligando, producto de la interacción del Co(II) en el sitio DCH con la cisteína. La incorporación de Cd(II) a NDM-1 fue examinada por RMN de 113Cd(II). En el espectro se visualizaron dos bandas principales y cada una fue asignada a un sitio metálico. Estas señales fueron alteradas al incubar la enzima con el inhibidor de MβLs diseñado por el grupo, L-CS319, denotando que el compuesto interacciona con ambos metales al momento de su unión. Por lo tanto, estas enzimas pueden ser empleadas para estudiar cambios en la coordinación de los metales en el sitio activo durante procesos catalíticos o de unión de ligandos. En una segunda etapa, se estudió el mecanismo de hidrolisis de carbapenemes por NDM-1, utilizando técnicas de cinética rápida y diversas espectroscopias. Los datos obtenidos al estudiar el proceso de hidrólisis catalizado por bi-Zn(II)-NDM- y bi-Co(II)-NDM-1, revelaron que ambas enzimas emplean el mismo mecanismo de reacción. Este mecanismo es ramificado e incluye dos intermediarios de reacción productivos (EI1 y EI2). Sólo EI2 puede dar origen a un complejo EP estable. La formación de este complejo fue estudiada por titulación con sustrato hidrolizado en la enzima sustituida con Co(II). Los productos generados durante la hidrólisis de imipenem se estudiaron por RMN de 1H. En estos ensayos, se evidenció que la protonación era estereoselectiva y se concluyó que cada intermediario de reacción tendría que dar lugar a productos diferentes. La identidad de estas especies fue estudiada por cálculos computacionales. Por esta técnica, se comprobó que podría producirse la acumulación de especies intermediarias con carga negativa, cuya estabilidad dependería de la deslocalización de la carga y de interacciones con los iones metálicos. El pasaje de un intermediario a otro estaría marcado por la pérdida del agua coordinada a puente. Estudios recientes de nuestro grupo con las MβLs B2 Sfh-I y B3 GOB-18 (en su forma mono-metalada), revelaron que la hidrólisis de carbapenemes por estas enzimas cursa por medio del mismo mecanismo de reacción y que durante el proceso se acumulan intermediarios con características espectroscópicas similares a los observados en NDM-1. Estos resultados establecen al mecanismo catalítico como un punto de partida para el diseño racional de inhibidores activos frente a las tres subclases.El sitio activo de las MβLs B1 se encuentra rodeado por dos bucles, nombrados L3 y L10. Se ha reportado que el L3 tendría un papel fundamental en la primera interacción de la enzima con los sustratos y que ayudaría al posicionamiento de los mismos por medio de interacciones hidrofóbicas. Para evaluar la función de esta estructura en NDM-1, se generaron dos variantes en las que se intercambió el bucle nativo por el de enzimas de relevancia clínica de la misma subclase VIM-2 e IMP-1 (nombradas L3VIM y L3IMP), y una tercera variante en la que se insertó un residuo de prolina en la base del bucle (L3Pro). Las propiedades de estas variantes fueron evaluadas in bacteria e in vitro. Las variantes mostraron una disminución en su estabilidad y alteraciones en su afinidad por metal, siendo la variante L3VIM la que más se diferenció de la enzima salvaje. A diferencia de lo esperado, no se observaron grandes cambios en el perfil de sustrato de las variantes, pero si se evidenció una alteración en la acumulación de intermediarios de reacción durante la hidrólisis de nitrocefina y carbapenemes, indicando cambios en el mecanismo de reacción de las variantes. La vida media de los intermediarios fue mayor en L3IMP y menor en L3VIM y L3Pro. Fue posible resolver las estructuras de las enzimas L3IMP y L3Pro por cristalografía de rayos X. La mayor diferencia entre estas variantes fue la posición del L3 que, con respecto a la estructura de NDM-1, se encontraba más cerca del sitio activo en L3IMP y más alejado en L3Pro. Se encontró una correlación directa entre en tamaño del surco catalítico (modulado por la posición del bucle L3) y la acumulación de intermediarios de reacción: mientras más alejado del sitio activo se encontraba el L3, menor era la acumulación de los intermediarios. Este resultado indica que la secuencia de aminoácidos del L3 puede modular la vida media de los intermediarios, afectando el proceso de catálisis enzimática y estableciendo una correlación entre la estructura y la función en NDM-1.

Las benzodiacepinas se usan en la clínica como anticonvulsivantes, sedativos/hipnóticos, ansiolíticos y relajantes musculares; también producen amnesia anterógrada y son empleadas para facilitar la anestesia. El efecto terapéutico de las benzodiacepinas está mediado por la unión a un sitio específico en el receptor GABAA. Dado que en lugar de activar directamente al receptor las benzodiacepinas actúan estimulando las acciones del GABA endógeno, exhiben un gran índice terapéutico y baja toxicidad. Sin embargo, el consumo prolongado de benzodiacepinas induce tolerancia a la mayoría de sus efectos farmacológicos. El objetivo del presente trabajo fue analizar el mecanismo molecular de tolerancia a las benzodiacepinas, realizando estudios conductuales en combinación con análisis bioquímicos. Se estudió el efecto de administraciones diarias (1 inyección subcutánea por día) con vehículo o diacepam (15 mg/kg) en ratas durante 1 (tratamiento agudo), 7 o 14 días. Los estudios conductuales se llevaron a cabo 2 horas luego de la última inyección pues es el momento donde se alcanza la máxima concentración de diacepam en el plasma y el cerebro. El efecto ansiolítico de la benzodiacepina se determinó en el test del laberinto en cruz elevado, estimándolo como un aumento en el número de entradas y en el tiempo de permanencia en los brazos abiertos en relación al grupo de ratas administradas con vehículo. El efecto ansiolítico persistió luego del tratamiento con diacepam por 7 días pero fue abolido luego de la administración de 14 días. De este modo, la tolerancia a los efectos ansiolíticos del diacepam se detectó solamente luego del tratamiento más prolongado. El efecto sedativo del diacepam, estimado como una reducción en la actividad locomotora en el test del campo abierto comparado con animales tratados con vehículo, se observó luego del tratamiento agudo pero no se detectó luego de los tratamientos crónicos de 7 o 14 días. Por consiguiente, la tolerancia a los efectos sedativos se detectó luego de los dos tratamientos crónicos con diacepam. Estos resultados están de acuerdo con las evidencias previas que indican que la tolerancia a las benzodiacepinas se desarrolla con diferentes cursos temporales dependiendo del efecto farmacológico. Nuestros resultados mostraron que la concentración de diacepam en la corteza cerebral de las ratas no disminuyó luego de los dos tratamientos crónicos con la benzodiacepina con respecto al grupo de animales que recibió el tratamiento agudo, indicando que el proceso de tolerancia no está mediado por cambios en factores farmacocinéticos.

El presente trabajo de tesis tiene por objetivo desarrollar una estrategia de control de la enfermedad psorosis de los cítricos mediante el uso de cítricos transgénicos resistentes a Citrus psorosis virus (CPsV), agente causal de la enfermedad. Para ello se trabajó con plantas de Citrus sinensis que expresaban un fragmento del gen que codifica para la proteína de cubierta de CPsV en una estructura de tipo hairpin (horquilla), inductora del silenciamiento génico. Este mecanismo otorgó a estas plantas transgénicas resistencia al virus, y en el contexto de esta tesis, se estudió la estabilidad de esta resistencia mediada por silenciamiento a lo largo del tiempo y de sus propagaciones vegetativas por injerto sobre un pie de Citrus jambhiri Lush. Se analizó además la transmisión del silenciamiento a través del injerto y el movimiento de sus señales a larga distancia. Finalmente se desafió a los injertos con CPsV para evaluar el impacto de la transmisión del silenciamiento sobre la resistencia al virus.