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La adquisición de independencia hormonal en carcinomas mamarios con expresión de receptores para hormonas esteroides es un fenómeno frecuente con gran relevancia clínica. En este trabajo, abordamos el estudio de un posible mecanismo de activación ligando independiente del receptor de estrógenos alfa (REα). Nuestra hipótesis se desprende de observaciones anteriores del laboratorio en las cuales observamos que el factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2), podía activar al receptor de progesterona (RP) a través del receptor para dicho factor (FGFR-2) en el modelo experimental murino C4 y en células de cáncer de mama humano T47D. Por otro lado, habíamos comprobado que el REα era necesario para que el RP fuera transcripcionalmente activo. Con estas evidencias decidimos investigar si existía un interacción entre la vía de FGF2 y el REα. Se eligieron para este trabajo las líneas celulares de cáncer de mama humano MCF-7, por ser la línea más frecuentemente utilizada para evaluar la funcionalidad del REα, y la T47D, más utilizada para evaluar la función del RP, aunque también se estimulan con estrógenos. Al tratar ambas líneas celulares con FGF2, encontramos un aumento en su proliferación, que fue revertido tanto con inhibidores de FGFRs, como con el antiestrógeno puro ICI 182780 (ICI). Dicho incremento estaba acompañado por un aumento de la fosforilación de las serinas 118 y 167 del REα en correlación con un aumento de la activación de las quinasas responsables de fosforilar a estas serinas, MAPK y Akt respectivamente. Más aún, experimentos de silenciamiento del REα confirmaron que el mismo estaba involucrado en el efecto estimulatorio de la proliferación celular del FGF2. Con estos resultados, exploramos posteriormente la funcionalidad del REα en respuesta a FGF2, demostrando que el REα era capaz de inducir la expresión de un gen reportero luego del tratamiento con FGF2 y que no sólo era capaz de interactuar con su secuencia consenso en una construcción de ADN recombinante, sino que también se unía a esta secuencia en el ADN endógeno, induciendo la expresión de c-MYC y pS2. En particular la expresión de este último gen es considerado un indicador confiable de la activación del REα. Luego de evaluar la interacción de las vías de FGF2 y REα en células MCF-7 y T47D, desarrollamos un modelo con activación constitutiva del FGFR-2 al que denominamos MCF-7 R2CA (R2CA). Estas células fueron seleccionadas hasta obtener una transfección estable, y la línea resultante presentó una morfología similar a las células control. La línea R2CA expresó mayores niveles de MAPKs fosforiladas y al evaluar la fosfoserina 118 del REα, si bien se vio un aumento de su proporción con respecto al control de carga, al relativizarlo con los niveles de REα totales no se evidenció un aumento específico ya que las células R2CA expresaron mayores niveles de REα total. Sin embargo, el efecto final resultó en una mayor activación de esta vía corroborada además, no sólo por la inducción del RP en condiciones basales, sino por un aumento en la expresión del gen pS2, marcador de actividad transcripcional del REα. Curiosamente, no se observaron modificaciones en pAkt lo que sugiere que otros FGFR estarían más asociados a la activación de Akt por FGF2, mientras que FGFR-2 involucraría a Erk. Evaluamos también el crecimiento in vivo del modelo R2CA en comparación con el control que no crece sin el aporte hormonal exógeno. Demostramos que la activación constitutiva del FGFR-2 le confiere una ventaja proliferativa sobre las células control ya que se pudieron establecer como xenoinjertos aunque su crecimiento fue mayor con el tratamiento con estrógenos, resultados que se condicen con los estudios in vitro en los cuales se observó que se activa la vía de Erk pero no la de Akt. Posteriormente, se evaluó la relación entre las vías de REα y FGF2 en un modelo murino de cáncer de mama. En nuestro laboratorio se desarrolló un modelo de tumores por administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en hembras vírgenes de ratones BALB/c. Se establecieron líneas que necesitan la administración de MPA para crecer, denominadas hormono-dependientes, entre ellas la C4-HD, variantes que no necesitan la hormona para crecer (hormono-independientes) como la variante C4-HI y variantes independientes de hormonas y resistentes a antiprogestágenos (hormono-independientes resistentes) como la C4-HIR. Lo interesante de este modelo es que mientras en el tumor C4-HD el tratamiento con progestágeno activa al REα y es completamente sensible al tratamiento con antiestrógenos, la variante C4-HI muestra una activación basal del REα medida por fosforilación en las serinas 118 y 167, y es moderadamente sensible al tratamiento con el antiestrógeno Fulvestrant. En concordancia, cuando tratamos a los tumores con los inhibidores específicos de los FGFRs los tumores son parcialmente sensibles y los tumores tratados muestran una disminución en la fosforilación de las dos serinas mencionadas del REα, indicando una interacción cruzada de estas vías en el modelo. Otra área de interés en el laboratorio es la regulación epigenética en relación con la adquisición de hormono independencia en cáncer de mama. En trabajos previos de nuestro grupo se estudió el rol de la metilación en los mecanismos de resistencia a antiprogestágenos. En este trabajo de tesis decidimos estudiar el papel de los miRNAs (miRNAs) en la progresión hacia la resistencia endócrina. Se analizó la expresión de más de 300 miRNAs en un microarray, para las tres variantes mencionadas de la familia C4. Como contábamos con la información del transcriptoma de C4-HD y C4-HI, decidimos cruzar los datos con los obtenidos del array de miRNAs. Analizamos todos los genes potencialmente regulados por algún miRNA sobre o sub expresado en cada comparación, y evaluamos cómo era su expresión en el transcriptoma conocido. De los genes obtenidos, se destacaban tanto FGFR-2 como STAT5. En particular STAT5 es un gen que codifica para una proteína que ya habíamos estudiado en el modelo experimental y podría formar parte de un complejo con FGFR-2 y mediar efectos transcripcionales a través de RP. Encontramos también como candidato interesante a PTEN, una fosfatasa involucrada en la vía de señalización de Akt, que tiene relevancia en la activación de REα ligando independiente. Nos centramos en 5 miRNAs, de los cuales el miR-1 se destaca por ser el único sobre expresado en C4-HIR al compararlo con C4-HI, aunque no se pudo validar; los miRNAs 335 y 222, para los cuales no observamos diferencias significativas entre los tres tipos de tumores; y los miRNAs 31 y 155, los cuales aumentaban su expresión en las distintas variantes tumorales con estadios más avanzados de progresión tumoral: C4-HI mostró mayores niveles que C4-HD y C4-HIR que C4-HI (p<0.001). Ambos miRNAs se encuentran involucrados en la vía de señalización de FGF2 sugiriendo su participación en la progresión hacia la resistencia hormonal en este modelo, a través de la regulación de esta vía. Estos resultados también sugieren que la expresión de estos miRNAs podría ser utilizada como marcador de progresión tumoral. En conclusión FGF2 es capaz de activar tanto a REα como a RP en forma ligando independiente y la activación de esta vía de señalización participaría en la progresión del cáncer de mama.

La luz provee a las plantas la energía necesaria para la fotosíntesis e información sobre el ambiente. Las señales lumínicas son percibidas por fotorreceptores específicos. En Arabidopsix thaliana se identificaron y clonaron tres grupos de fotorreceptores: los fitocromos que son fotorreceptores de de luz roja (R) y roja lejana (RL), que son codificados por cinco genes (PHYA,PHYB,PHYC,PHYD,PHYE); los criptocromos que son fotorreceptores de luz azul, codificados por dos genes (CRY1 y CRY2) y las fototropinas. Los fitocromos y criptocromos tienen funciones independientes y coordinadas que regulan el desarrollo de las plantas durante todo el ciclo de vida. El objetivo de esta tesis es estudiar la interacción entre fitocromos (específicamente phyA y phyB ) y criptocromos (cryl y cry2) en distintas respuestas durante el desarrollo de Arabidopsis thalíana. Para cumplir este objetivo hemos obtenido los dobles, triples y cuádruple mutantes a partir de los simples mutantes de phyA, phyB, cry1 y cry2 para analizar el efecto de un fotorreceptor en ausencia/presencia de los demás fotorreceptores. El uso de los simples, dobles, triples, y cuadruple mutantes permitió revelar nuevas interacciones entre los fotorreceptores e identificar funciones no conocidas de los mismos. En plántulas etioladas expuestas a luz R, el phyA mostró un efecto dual. Cuando el phyA fue activado con bajos flujos de luz R produjo por un lado la inhibición del alargamiento del hipocotílo, y por otro lado, redujo la inhibición del alargamiento del hipocotílo mediado por el phyB, es decir que el phyA interactuó antogonísticamente con el phyB. En nuestras condiciones, el phyA retrasó la transición del estado vegetativo al reproductivo, sólo en determinados contextos genéticos: cry1, cry2 y cry1 cry2, poniendo en evidencia un nuevo rol del phyA en el control de la floración. El phyB y el cry1 fueron redundantes en la represión del alargamiento del entrenudo, y la ausencia de ambos permitió demostrar que el alargamiento del tallo no está obligadamente acoplado al desarrollo reproductivo. La redundancia entre phyB y cry1, sin embargo, fue condicional a la temperatura. En la inhibición del alargamiento del hipocotílo, el phyB y el cry1 interactuaron sinergísticamente. La interacción del phyB y el cry1 en ésta respuesta fue condicional al ambiente lumínico. En la mayoría de las respuestas el cry2 fue redundante con el cry1. La interacción del cry2 con phyA y phyB en las distintas respuestas durante el desarrollo puede dividirse en dos patrones, en el primero la actividad del cry2 requirió la presencia de phyA y phyB (efecto sinérgico), y en el segundo requirió la ausencia de phyA y phyB (efecto redundante). El análisis del comportamiento del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 mostró que la deficiencia en la percepción de luz durante el desarrollo no está restringida sólo a la des-etiolación sino que continúa incluso hasta al estadío adulto. Basados en los datos de esta tesis y de la literatura presentamos un modelo de los patrones de interacción para dos procesos: des-etiolación y floración. Las interacciones observadas en condiciones de radiación natural entre los fotorreceptores reflejan aquellas observadas en condiciones controladas. La compleja red de interacciones entre fitocromos y criptocromos en condiciones de radiación natural generó homeostasis en la des-etiolación contra los cambios en irradiancia y fotoperíodo que no forman parte de la señales relacionadas con la posición del vástago por debajo o por encima de la superficie del suelo. El phyA, phyB, cry1 y cry2, se acoplan con diferentes jerarquías durante el desarrollo de Arabidopsis. La dependencia o redundancia entre las vías es afectada por las condiciones ambientales, el estado ontogénico y el contexto genético. La redundancia entre los fotorreceptores en el control de los procesos del desarrollo genera estabilidad del fenotipo que evita caer en patrones aberrantes, mientras que las jerarquías entre los fotorreceptores permite un patrón específico de crecimiento y desarrollo bajo señales lumínicas particulares.

Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesos fisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedad de comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calcio intracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a través de receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de los mecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirse por lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura de otros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida por calcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulos sobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, las señales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse en ondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esas señales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un gran interés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista de la actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señales de calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos, el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentración de Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modos dependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrando que son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta de la dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~ nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de onda visible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transporte y propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar los artefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados en cúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señales propagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimental ventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución de los RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de las señales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricas para evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina con alguno de los otros aspectos que in uyen sobre la distribución de calcio libre para determinar las características de las señales. El primer aporte fue introducir un método que permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenes realizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relación señal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cada arreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintas condiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular, analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo las distintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observados y la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observables del experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. El estudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienen de cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar en más detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos, se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distinta cinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusión previa sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de buffers lentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberaciones de Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen el acoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal, aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribución espacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3s en el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitando así la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostrado también resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas, cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distinta de RIP3s.

El desenlace de la infección por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es el resultado de una compleja serie de interacciones donde los mismos mecanismos que se ponen en marcha para contener al parásito son también capaces de inducir daño tisular. En función de ello es evidente que el desarrollo de la respuesta anti-infecciosa estará acompañado de una respuesta reguladora inmuno- endócrina orientada a reducir las consecuencias patológicas de esta tripanosomiasis. En este proceso de auto-control podrían tener un papel particular las células T reguladoras (Tregs) y los glucocorticoides (GCs). Los linfocitos Tregs CD4+FoxP3+ constituyen una población inmunosupresora que puede actuar sobre poblaciones efectoras por contacto directo o mediante la secreción de citocinas inmunoreguladoras. Por otra parte, las citocinas pro-inflamatorias producidas durante un proceso inflamatorio o infeccioso, activan el eje hipotálamo pituitario adrenal (HPA) con la consiguiente liberación de GCs, los que ejercen efectos inmunosupresores sobre la respuesta inmune. A su vez Los GCs podrían favorecer el desarrollo de las Tregs durante procesos nflamatorios, sin embargo esta posibilidad no se ha investigado en profundidad en procesos infecciosos. En nuestro laboratorio se han caracterizado dos modelos de infección experimental murina con T. cruzi que muestran una diferente resolución de la enfermedad aguda. Mientras que los animales C57BL/6 presentan un 100% de mortalidad como consecuencia de una respuesta inflamatoria exacerbada, la cepa BALB/c es parcialmente resistente a la infección y exhibe una respuesta defensiva más balanceada. El objetivo de este trabajo fue evaluar el papel que las Tregs podrían desempeñar en el patrón de susceptibilidad/resistencia previamente observado y en las alteraciones inmunológicas que tienen lugar a nivel tímico durante la infección con T. cruzi. Los estudios también apuntaron a analizar la relación que se establece entre las células Tregs y los GCs, como así también a la manipulación de la población Treg como potencial estrategia inmuno-moduladora en la infección chagásica. Los resultados obtenidos indican que el perfil de resistencia observado en los animales BALB/c se asocia a mayores niveles basales de Tregs en la periferia y a una expansión más eficiente de esta población, lo cual se refleja en un mejor balance homestático entre células Treg y células T efectoras (Tef). Por el contrario, en los animales C57BL/6, la mayor susceptibilidad se asocia a un cierto grado de parálisis de la población de células Tregs, lo cual sugiere que los mecanismos supresores serían largamente superados por la respuesta efectora. Además, y en relación a esto último, mostramos que los GCs endógenos serían necesarios para mantener el balance Tef/Treg durante el curso de la infección. Por último, revelamos que la administración de Dex+IL-2 puede modular positivamente el balance Tef/Treg e influenciar de forma diferencial el curso de la infección. Estudios futuros que recurran a esta estrategia permitirían optimizar terapias que expanden específicamente a las Tregs en otros contextos inflamatorios.

Fil:McAllister, Claudia Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), enfermedad caracterizada por anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal aguda, está asociado a infecciones enterohemorrágicas con Escherichia coli productores de toxina Shiga (Stx) (STEC). Si bien el daño endotelial, generado por Stx, ha sido reconocido como el principal evento que conduce al estado protrombótico en el SUH, existen otros mecanismos que todavía no han sido completamente identificados. La interacción entre la respuesta trombótica e inflamatoria ha sido recientemente reportada en diversas patologías y dada la importancia de ambas en el SUH, hipotetizamos que podría tener un rol destacable en su desarrollo. En efecto, nuestro objetivo fue evaluar los mecanismos de activación de la respuesta trombótica y su interacción con la respuesta inflamatoria en el SUH. Utilizando un modelo murino de SUH, detectamos que Stx2 indujo directa o indirectamente una marcada activación plaquetaria que contribuyó con la respuesta inflamatoria a través de la activación del sistema de complemento y la formación de complejos entre Plaquetas y leucocitos polimorfonucleares (PMN). Por otro lado, en un sistema in vitro, se vió que Stx2 indujo un daño endotelial que derivó en la activación y adhesión plaquetaria. Por último, en ambos modelos, se observó la capacidad del antioxidante N-acetil-L-Cisteína (NAC) de prevenir los efectos protrombóticos de Stx2. En conclusión, en esta tesis hemos descripto como Stx2, mediante el daño endotelial, activa la respuesta trombótica y como el estrés oxidativo contribuye a este proceso. Asimismo hemos probado la participación de las plaquetas en la activación de la respuesta inflamatoria. Finalmente, dados los efectos preventivos de la NAC proponemos su uso en la etapa prodrómica de la diarrea.

Existe numerosa evidencia que indica que los progestágenos están involucrados en el control de la tumorigénesis mamaria. A pesar de ello, los mecanismos por los cuales las hormonas esteroideas estimulan el crecimiento de células de cáncer de mama no han sido todavía descifrados completamente. Uno de los mecanismos propuestos ha sido la regulación de la expresión de factores de crecimiento que actuarían como mitógenos de las células tumorales. En particular, se ha demostrado previamente en el laboratorio que Heregulina (HRG), ligando de receptores con actividad de tirosina quinasa (RTK) tipo I, estimula el crecimiento de células epiteliales provenientes de cultivos primarios del tumor mamario progestágeno-dependiente C4HD y potencia los efectos mitogénicos del acetato de medroxiprogesterona (MPA) (Balañá et al., 1999; 2001). La primera parte del presente trabajo se centró en el estudio de interacciones entre los caminos de señalización activados por progestágenos y por RTKS tipo I y II en el modelo de carcinogénesis mamaria inducida por acetato de medroxiprogesterona en ratones Balb/c (Molinolo et al., 1987; Lanari et al., 1989). El tratamiento de las células C4HD con MPA indujo tanto el aumento de los niveles proteicos de ErbB-2 como el aumento de su fosforilación. Habíamos demostrado anteriormente que el receptor tipo I del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) y el ErbB-2 están involucrados en la proliferación de estas células mediada por MPA. Al estudiar el bloqueo simultáneo de ErbB-2 y IGF-IR sobre la proliferación inducida por MPA, no se observaron efectos aditivos ni sinérgicos. Efectos aditivos hubieran sido esperados si IGF-IR y ErbB-2 activaran vías de señalización independientes. Una interacción sinérgica hubiera existido si el camino de transducción de señales activado por uno de los receptores potenciara el del otro receptor. Por lo tanto tan sólo un mecanismo que involucrara una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2, en el cual uno de ellos es esencial para la activación de del otro, podía explicar nuestros resultados. En efecto, al suprimir la expresión del IGF-IR, la fosforilación del ErbB-2 inducida por MPA se vio totalmente inhibida. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de ErbB-2 no afectó la fosforilación del IGF-IR. Estos resultados muestran la existencia de una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2; por medio de la cual IGF—IR dirige la activación de ErbB-2. Se demostró, por primera vez, que esta interacción involucra la asociación física de ambos receptores en un complejo heteromérico. Es más, experimentos de microscopía confocal laser mostraron que el MPA fue capaz de inducir la co-localización de ErbB-2 y IGF-IR. El propósito de la segunda parte del trabajo fue el de investigar la capacidad de HRG de activar al receptor de progesterona (RP) utilizando el mismo modelo experimental que en la primera parte. Es así que pudimos observar que HRG fue capaz de regular las características bioquímicas del RP en forma similar a la efectuada por la activación del receptor luego de la unión a un progestágeno. Se encontró que HRG fue capaz de inducir una disminución de los niveles proteicos de ambas isoformas, A y B, del RP y de disminuir la cantidad de sitios específicos de unión a progestágenos. Además, el tratamiento con HRG produjo un aumento de la proporción de RP con localización nuclear. Estudios posteriores nos permitieron saber que el tratamiento con HRG podía también inducir la unión del RP a su elemento respondedor en el ADN(PRE) y aumentar la transcripción de un gen reportero que contenía dos PRE en su promotor. Un antiprogestágeno como el RU486 provocó la inhibición de la activación transcripcional del RP mediada por HRG. Al profundizar en los mecanismos moleculares que estaban involucrados en los efectos de la HRG sobre el RP, pudimos observar que era necesaria la presencia de ErbB-2 funcional así como de proteínas quinasas activadas por mítógenos (MAPK) en su estado activo. Es más, MAPKs activadas por HRG tuvieron la capacidad de fosforilar al RP en ensayos de fosforilación in vitro. Los mismos estudios se realizaron en la línea de carcinoma mamario humano T47D obteniéndose resultados similares. Nuestros resultados mostraron que, en ausencia de progestágenos, HRG activa al RP tanto murino como humano mediante un mecanismo que requiere la presencia de ErbB-2 funcional así como la activación de MAPKs.

Uno de los desafíos de la biología tumoral consiste en la búsqueda de mecanismos que vinculen fenómenos de hipoxia y angiogénesis. En función del papel crítico de galectina- 1 (Gal1) en la progresión tumoral investigamos su relevancia en fenómenos de neovascularización. El análisis funcional del perfil de glicosilación de células endoteliales reveló una amplificación preferencial del repertorio de glicanos críticos para la unión de Gal1 en células endoteliales expuestas a estímulos tolerogénicos, proliferatívos e hipóxicos típicos de microambientes tumorales. De acuerdo a estos hallazgos, observamos que Gal1 interacciona con células endoteliales principalmente en N-glicanos promoviendo proliferación, migración/invasión y tubulogénesis a través de mecanismos dependientes de las vías de señalización de VEGFR2, PI3K-Akt y Erk1/2, mimetizando de este modo el efecto biológico del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Por otro lado, verificamos que Gal1 se encuentra asociada a Nglicanos presentes en VEGFR2 e induce su activación y segregación en estructuras tipo "lattices". En tal sentido, los fenómenos de migración y tubulogénesis inducidos por Gal1 fueron bloqueados al utilizar anticuerpos anti-VEGFR2 o al inhibir la disponibilidad de N-glicanos complejos en células endoteliales. A los fines de evaluar la regulación de la expresión de Gal1 en células tumorales se incubaron células de Sarcoma de Kaposi (KS) en condiciones de hipoxia (1% O2), observándose un incremento marcado en la expresión de esta lectina a través de mecanismos dependientes de la activación del factor de transcripción NF-κB y especies reactivas del oxígeno (ROS) e independientes del factor inducible por hipoxia (HIF)-1α. Dicha expresión fue crítica para el crecimiento y la neovascularización de tumores humanos KS y murinos B16 in vivo. La relevancia fisiopatológica de estos hallazgos fue determinada a través de la inhibición de la expresión de Gal1 utilizando estrategias de silenciamiento (shRNA). El bloqueo de la expresión génica de Gal1 logró inhibir la capacidad pro-angiogénica de tumores KS in vivo e in vitro. El análisis por inmunohistoquímica de diversas patologías vasculares humanas reveló que Gal1 se expresa selectivamente en patologías malignas, confirmando el impacto clínico de nuestros hallazgos. Finalmente, y con el objetivo de validar una estrategia terapéutica basada en el bloqueo de Gal1 en el microambiente tumoral, desarrollamos un panel de anticuerpos monoclonales anti-Gal1 bloqueantes los cuales lograron neutralizar los efectos pro-angiogénicos e inmunosupresores de esta lectina in vitro e in vivo. En forma notable, el bloqueo de Gal1 en tumores B16 logró remodelar la vasculatura tumoral e inducir un marcado incremento en el infiltrado inflamatorio, el cual fue capaz de montar respuestas antitumorales dependientes de células Th1 y Th17. Este efecto fue asociado no sólo al bloqueo de la capacidad inmunosupresora de Gal1 sino también a un efecto ‘normalizador’ sobre el endotelio permitiendo la maduración de pericitos y el influjo de células T al parénquima tumoral. En conjunto, los resultados del presente trabajo de tesis demuestran que Gal1 participaría activamente en la generación de un microambiente tumoral pro-angiogénico e inmunosupresor, en el cual la hipoxia, a través de la expresión de esta lectina y sus glicanos, modularía compartimientos inmunológicos y vasculares, favoreciendo fenómenos de angiogénesis y crecimiento tumoral. De este modo, el presente estudio permite vincular, a partir del reconocimiento de lectinas y sus ligandos específicos fenómenos de hipoxia con programas inmunológicos y de neovascularización. A su vez sugiere nuevos enfoques en el diagnóstico y tratamiento de tumores, dando luz a la primera herramienta terapéutica capaz de modular en forma específica la interacción entre Gal1 y sus glicanos interrumpiendo simultáneamente fenómenos de angiogénesis y escape tumoral.

Ya que nuestro conocimiento de los sistemas naturales se basa, en buena medida, en las propiedades de las membranas artificiales, comenzamos por analizar las características polimórficas, la estructura y la dinámica de organizaciones lipídicas. La complejidad crece en cada caso al mezclar lípidos con cabezas polares químicamente distintas, longitudes de cadena y grados de insaturación variables. Naturalmente, surgen las atracciones y repulsiones de las moléculas de fosfolípidos entre sí y con el colesterol, conduciendo a separaciones laterales de fases en el plano de la membrana. Las proteínas interrumpen la organización lamelar, modificando las propiedades físicas de los lípidos y presentando ellas mismas cambios en su conformación, generados por las moléculas del entorno. Si avanzamos un poco más, vemos que hasta la funcionalidad de la molécula proteica depende de su interacción con los demás componentes de la membrana: la actividad enzimática está modulada por la interacción lípido-proteína. Estas interacciones son estudiadas, generalmente, con proteínas purificadas en sistemas reconstituidos. Es cierto que este procedimiento permite el desarrollo de experimentos en condiciones controladas, así como la evaluación independiente de la relación causa-efecto para las distintas variables del sistema. Pero también es cierto que el método de purificación-re constitución destruye la compleja riqueza de la regulación en la membrana nativa. Las membranas naturales aparecen como estructuras dinámicas y altamente heterogéneas en el plano lateral y transversal, donde conviven estructuras lamelares con no-lamelares, gradientes de fluidez con "ánulus" inmovilizados, creando todos ellos el medio propicio, para la expresión de la actividad catalítica de las enzimas de membrana. Y es en una membrana natural donde se llevaron a cabo los experimentos para conocer las relaciones que vinculan la composición lipídica, la estructura dinámica y la cinética de enzimas de membrana, que se detallan en el presente trabajo.

En este trabajo se estudian los sistemas nebulares (gas ionizado) localizados en las regiones más externas de potentes radiogalaxias y conocidos como Regiones Extendidas con Emisión de Líneas (EELR). Fueron descubiertos en forma sistemática mediante observaciones con el Telescopio Espacial Hubble (HST). Las propiedades que las definen desde su propio nombre son las grandes distancias hasta las cuales es posible localizarlas, superando el alcance de la componente estelar en las mismas imágenes del HST, y el tipo de líneas de emisión que componen su espectro. El estudio consta de la determinación del proceso de ionización dominante en la zona, mediante la comparación de los dos principales mecanismos posibles: la ionización de las nebulosas por parte del campo de radiación emitido por la fuente central, y la ionización por ondas de choque radiativas, desencadenadas por la interacción de la radiofuente, en particular, sus jets, con el medio que atraviesa (sólo en un objeto los procesos de choque estarían desencadenados por otro mecanismo). Los análisis requieren de la evaluación de las propiedades físicas del sistema gaseoso, ya sea la profundidad óptica, la distancia que las separa de la fuente puntual, el comportamiento espacial de la emisión o sus características cinemáticas, para poder estudiarlas bajo las hipótesis de cada modelo. El rol que desempeñe el núcleo activo nunca será despreciable, sin embargo, el interés por el estudio sistemático de la interacción entre los jets y el material interestelar radica en que este mecanismo podría explicar el estado de ionización de las EELR de la mano de su estado cinemático. La técnica empleada fue la espectroscopía óptica de ranura larga (long-slit). Todos los espectros nebulares se tomaron especialmente para el desarrollo de esta Tesis con el instrumento GMOS del Telescopio Gemini Norte (TGN). La excelente calidad de los datos obtenidos permitió completar las tres líneas principales de la investigación: el análisis espectroscópico, el comportamiento espacial de la emisión y la cinemática de la región. El objetivo principal fue obtener una explicación tan global como fuera posible sobre las características multibanda de la emisión, con especial énfasis en la relación espacial que pudiera haber entre la emisión y la cinemática en las distintas bandas del espectro, y en la relación de alineamiento entre las estructuras en óptico y en radio. Los modelos se analizaron según sus predicciones sobre las estructuras de ionización y con la información contenida en los cocientes de líneas (diagramas de diagóstico). En general, la estructura de ionización no puede resolverse espacialmente en ninguno de los dos escenarios, pero la información contenida en el comportamiento espacial de las líneas de emisión fue determinante para evaluar el dominio de una región sobre otra y, consecuentemente, de un mecanismo de ionización sobre el otro. Se encontraron fuentes donde se puede asegurar el dominio de un mecanismo concreto, y fuentes donde se necesita la contribución de ambos para poder explicar tanto las características espectrales, como la intensidad de la radiación observada. En la mayoría de los objetos analizados (cinco de siete) la EELR está alineada con los radio-jets. Sin embargo, los resultados son compatibles no con la dirección de alineación radio-óptico sino con la información contenida en los campos de velocidades. En los casos donde se puede asegurar que la ionización ocurre predominantemente como consecuencia de procesos de choque, el campo de velocidades siempre muestra importantes indicios de movimientos de perturbación con velocidades altas. En los casos donde domina la fotoionización del campo central, las perturbaciones cinemáticas nunca son significativas.