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La nutrición moderna busca el equilibrio entre la calidad de los alimentos y la promoción de la salud. Este nuevo paradigma ha llevado a una creciente demanda de alimentos bioactivos, que aporten beneficios sobre la salud humana y animal más allá de la nutrición básica. En este contexto se desarrolló el presente trabajo de tesis, donde se aborda el estudio de los fructo-oligosacáridos (FOS), es decir, azúcares cuya capacidad de estimulación selectiva de la microbiota intestinal (efecto prebiótico) ha sido ampliamente estudiada. Sin embargo, su capacidad protectora durante procesos de deshidratación de bacterias ácido lácticas ha sido escasamente explorada. En su conjunto los resultados obtenidos en este trabajo buscan expandir el uso de los FOS en alimentos deshidratados como aporte de fibra prebiótica y como protectores de bacterias ácido lácticas en dichas matrices, propiciando así el desarrollo de nuevos alimentos funcionales que incorporen prebióticos y probióticos. El trabajo se compone de una introducción general, que contiene las definiciones básicas de los conceptos de bacterias lácticas, probióticos, prebióticos, y la importancia de éstos a nivel tecnológico y de la salud. También se describen aspectos relacionados con la incorporación de probióticos y prebióticos en matrices alimenticias, haciendo foco en la preservación de bacterias lácticas en alimentos deshidratados. Además, se abordan los mecanismos involucrados en la preservación de microorganismos mediada por azúcares, destacando el empleo de azúcares prebióticos. En el capítulo 1 se presenta el estudio de la síntesis enzimática de FOS a partir de sacarosa, analizando el efecto del sustrato sobre la composición de los oligosacáridos obtenidos. Adicionalmente, se muestra la puesta a punto del monitoreo de la síntesis mediante espectroscopia de infrarrojo por transformadas de Fourier (FTIR) como alternativa al monitoreo clásico por cromatografía líquida de alta performance (HPLC). En el capítulo 2 se estudia la capacidad protectora de mezclas de FOS de diferente composición con el objetivo de comprender los mecanismos de protección de estos azúcares durante la liofilización de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CIDCA333, una cepa especialmente sensible a todo tipo de estrés. En el capítulo 3 se describen los resultados del empleo de FOS durante la deshidratación de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CIDCA333 mediante vacío asistido por microondas a escala piloto. En la primera parte del capítulo 4 se presenta el desarrollo de películas comestibles de metilcelulosa como vehículo para la incorporación FOS y la cepa L. plantarum CIDCA 83114 (cepa elegida por sus características tecnológicas y potencial probiótico) en alimentos deshidratados. El abordaje incluye el análisis del efecto de la incorporación de FOS y microorganismos en las películas, así como la estabilidad del sistema tanto desde el punto de vista fisicoquímico como microbiológico. En la segunda parte, se aplican los conocimientos desarrollados en la tesis para la funcionalización de un snack deshidratado de manzana con FOS y L. plantarum CIDCA 83114 inmovilizado en las películas de metilcelulosa previamente desarrolladas. Se estudian los snacks de desde el punto de vista tecnológico (propiedades físicas, características sensoriales, etc.) y microbiológico (viabilidad bacteriana durante el almacenamiento y la digestión gástrica simulada). Finalmente se realiza una Discusión General acerca de las evidencias científicas aportadas en este trabajo de tesis y las inquietudes para futuras investigaciones en el campo de los prebióticos y su aplicación en alimentos funcionales.

La tesis se enfocó en el desarrollo de matrices vegetales fortificadas en calcio y ácido ascórbico, con bajo contenido de agua. Para tal fin se estudiaron diferentes métodos de fortificación y preservación de dos frutas de la provincia de Misiones: ananá y mora. Las frutas de ananá, seccionadas en láminas 6 mm de espesor, fueron impregnadas con calcio y ácido ascórbico y posteriormente secadas por diferentes métodos: secado con aire caliente, deshidratación osmótica y secado con pulsos de energía de microondas. A partir de la fruta de mora, se ensayó la elaboración y posterior secado de una lámina en base a pulpa de mora. Se analizaron las características de los productos deshidratados a través de propiedades físicas y nutricionales, durante el procesamiento y su posterior almacenamiento.El secado con aire caliente es un método tradicionalmente empleado para la deshidratación de alimentos de origen vegetal. La aplicación de pulsos de microondas al proceso de secado convectivo favoreció la velocidad de secado de rodajas de ananá. Se evaluaron los efectos de las condiciones de proceso sobre características físico-químicas, nutricionales y organolépticas de las frutas. Una vez analizados los resultados, se procedió a la selección delas condiciones de proceso que permitieran mantener en gran proporción las características de interés.En ananá se evaluó la eficiencia de la impregnación con lactato de calcio (Ca) y ácido ascórbico (AA) en medio isotónico (~12°Brix) e hipertónico (50°Brix), en función del incremento del contenido de estos nutrientes en la matriz vegetal y de los cambios en propiedades físicas(textura, color, microestructura) de la fruta. La aplicación de los métodos combinados de secado  resultó satisfactoria en la fruta de ananá. Sin embargo, en moras, la aplicación del proceso de deshidratación osmótica y el secado con energía de microondas no tuvo resultados positivos. Además, si bien con secado convectivo es posible la deshidratación de moras, el producto obtenido no cubre las expectativas sensoriales buscadas; por este motivo se elaboró láminas deshidratadas a partir de moras trituradas, adicionando los nutrientes en cuestión (AA y Ca), azúcares,pectina y ácido cítrico, en distintas proporciones. Finalmente, se seleccionó una formulación a partir de las características sensoriales y aptitud para la formación de una lámina en el posterior proceso de secado. El producto final es una lámina de fruta con bajo contenido de agua, flexible, color y sabor agradable.La estabilidad de los productos fortificados durante su almacenamiento fue evaluada teniendo en cuenta el nutriente más sensible a su degradación, el AA. Se modeló la pérdida de ácido ascórbico por medio de una cinética de primer orden con coeficiente variable con la humedad del producto.

El primer paso y limitante, en la síntesis de novo de triacilglicéridos y glicerofosfolípidos está catalizado por la actividad de la glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) y consiste en la acilación del glicerol-3-fosfato con un acil-CoA de cadena larga para dar ácido lisofosfatídico (LPA). Hasta el momento se han descripto 4 isoformas en mamíferos para las GPATs (GPAT1-4) [EC 2.3.1.1]. Estas isoenzimas se diferencian por su ubicación subcelular (dos en la mitocondria (GPAT1 y 2) y dos en el retículo endoplásmico (GPAT3 y 4)) y tisular, su sensibilidad a sustancias reactivas a grupos –SH como la N-etilmaleimida (NEM) y por su preferencia de sustrato. Mientras que Gpat1, 3 y 4 se expresan en altos niveles en tejidos principalmente caracterizados por una alta tasa de síntesis y/o metabolismo de lípidos, como lo son el tejido adiposo, hígado y algunos tipos musculares, Gpat2 se expresa prácticamente de manera exclusiva en testículo. Además, la trascripción de este gen no se altera por el estado nutricional del animal ni tampoco aumenta en modelos de diferenciación celular de fibroblastos a adipocitos en cultivo. Recientemente, se ha descubierto que GPAT2 es de crucial importancia en la biogénesis de piRNAs y que esto es independiente de su actividad como aciltransferasa ya que esta función se mantiene aun cuando se muta el motivo que define dicha actividad. Los piRNAs son ARNs pequeños que se expresan predominantemente en células de la línea germinal, que son fundamentalmente conocidos por su papel en la protección del genoma, al silenciar elementos transponibles que se activan durante la desmetilación del ADN en las células germinales primordiales y cuyo nombre deriva de su asociación directa con proteínas PIWI (MILI, MIWI y MIWI2 en ratón). Patológicamente, GPAT2 se expresa además en ciertos tipos tumorales humanos. Por su patrón de expresión tisular, se había propuesto que Gpat2 forme parte de un grupo de genes llamados Antígenos Cáncer-Testículo (CTA), que refiere a genes o proteínas humanos y murinos que se expresan específicamente en tumores de distintos orígenes histológicos y en ningún otro tejido normal a excepción de las células germinales masculinas. Para muchos de ellos además, se sabe que cumplen funciones de importancia tanto en la espermatogénesis como en el desarrollo del fenotipo tumoral. A partir de estos hallazgos sumados al particular patrón de expresión tisular de GPAT2, se puede proponer que esta proteína fisiológicamente está cumpliendo otro rol de importancia, distinto al de aciltransferasa. Por lo tanto, para este trabajo de tesis doctoral nos planteamos como hipótesis que GPAT2 cumple un rol de importancia en la espermatogénesis y, como lo hacen otros CTA, influye en el desarrollo del fenotipo tumoral al sobreexpresarse ectópicamente en células cancerosas. Este patrón de expresión tisular específico está determinado principalmente por la regulación transcripcional del gen. Para corroborarla, nos planteamos los siguientes objetivos: 1. Estudiar la regulación transcripcional de Gpat2 de ratón, con el objetivo de determinar los principales mecanismos que influyen en su expresión en testículo. Se evaluaron la influencia de hormonas y de mecanismos epigenéticos. 2. Determinar la importancia de esta proteína en la espermatogénesis, para lo cual se silenció la expresión de Gpat2 en testículos de ratones prepúberes con la finalidad de disminuir la expresión de su producto y así determinar si GPAT2 es una proteína de importancia para el establecimiento de la capacidad reproductiva masculina. 3. Determinar si la presencia de GPAT2 influye en el desarrollo del fenotipo tumoral, para lo cual se emplearon líneas celulares humanas derivadas de tumores que expresan GPAT2 y cuyas características relacionadas con el fenotipo tumoral se evaluaron antes y después de silenciar la expresión de este gen. 4. Estudiar el patrón de expresión y regulación transcripcional de GPAT2 en líneas celulares humanas, para determinar cuáles son los mecanismos que influyen en la regulación transcripcional de este gen en humano para intentar explicar su expresión anómala en células tumorales y consolidar su pertenencia al grupo de los CTA. En base a los resultados obtenidos, podemos concluir que: 1. Gpat2 se expresa en espermatocitos en paquiteno y su perfil de expresión pre y posnatal en ratón coincide con el de Mili (una de las proteínas de la familia PIWI), lo que correlaciona y fortalece el hallazgo de que sea una proteína de importancia en la biogénesis de piRNAs. Este trabajo de tesis aportó información de importancia para validar la hipótesis de que GPAT2 cumple algún otro rol en el metabolismo celular que el de aciltransferasa, contribuyendo y enriqueciendo el descubrimiento de que esta isoforma sea importante en la biogénesis de los piRNAs. 2. La expresión de Gpat2 de ratón está regulada a nivel epigenético y por ácido retinoico. Tanto la presencia de RA, como la desacetilación de H y la desmetilación de su Isla CpG, aumentaron la expresión de Gpat2 in vitro e in vivo en el último caso. Varios trabajos han demostrado que estos mecanismos pueden actuar de forma coordinada para la regular la transcripción génica, por lo que se propone que Gpat2 esté regulado in vivo por la acción conjunta de estos procesos. 3. GPAT2 es una proteína de importancia en la espermatogénesis, ya que el silenciamiento de Gpat2 in vivo afecta al proceso espermatogénico. Una posible explicación para este hecho es que el silenciamiento de Gpat2 afecte la actividad conjunta con MILI, lo que alteraría la biogénesis de los piRNA de paquiteno. 4. La isoforma GPAT2 humana se expresa en altos niveles en líneas celulares humanas derivadas de tumor y en ciertos tipos de tumores humanos y su expresión influye en el desarrollo del fenotipo tumoral. Esto refuerza aún más la hipótesis de que esta proteína deba estar incluida dentro de la familia de CTA, ya que en general estos genes cumplen alguna función de importancia en el proceso de transformación tumoral. 5. Un mecanismo de importancia para explicar la expresión de GPAT2 en células tumorales es la hipometilación de la región circundante al primer exón. La principal causa de expresión ectópica de CTA en tejidos diferentes al testículo es el cambio en la metilación de las Islas CpG que se encuentren regulando la transcripción del gen. Por lo tanto, este hallazgo refuerza aún más la incorporación de GPAT2 al grupo de los CTAs y la vuelve una proteína interesante en clínica para el tratamiento inmunodirigido contra el cáncer.