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El gen de resistencia a múltiples drogas (MDR1) codifica para la Glicoproteína P (P-gp), que bombea diversos sustratos hacia el exterior de la célula, entre ellos los antirretrovirales: inhibidores de proteasa (PI). Además, el nivel de expresión de MDR1 está regulado por el receptor nuclear PXR. En el presente trabajo de Tesis Doctoral evaluamos la influencia de los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) de MDR1 (T-129C, C1236T y C3435T) y PXR (C63396T) en la infección pediátrica por HIV-1, la respuesta al tratamiento antirretroviral y la expresión de P-gp. Los SNPs C1236T y C3435T cumplirían un rol protector retrasando la progresión a SIDA pediátrico, pero no afectarían la transmisión vertical por HIV-1. Además, evaluamos el efecto de los SNPs en la respuesta antirretroviral al PI lopinavir, demostrando que el SNP C1236T se asocia con una menor concentración plasmática de la droga y una mayor carga viral. Por otra parte, analizamos si los niveles de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ se asocian con los SNPs de MDR1 o PXR, sin hallar diferencias entre los distintos genotipos. Sin embargo, observamos que el nivel de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ aumenta con la edad y la infección pediátrica por HIV-1. En conjunto, nuestros resultados sugieren que P-gp es un factor clave tanto en la modulación de la infección por HIV-1, independientemente de su función en el transporte de drogas, como en la respuesta a la terapia antirretroviral.

Este trabajo está compuesto por dos capítulos referidos a dos patologías reproductivas femeninas con alteraciones severas en la dinámica folicular, que se producen de forma iatrogénica. En primer lugar, se estudian implicancias del factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B) en la patogénesis del Síndrome de Hiperestimulación Ovárica (OHSS). En segundo lugar, se estudia el efecto protector del esfingolípido ceramida-1-fosfatp (C1P) sobre la foliculogénesis en la Falla Ovárica Prematura (FOP) ocasionada por gonadotoxicidad de drogas quimioterapéuticas. I)Síndrome de estimulación ovárica (OHSS) El OHSS es una complicación iatrogénica severa del crecimiento y maduración folicular ocasionada por la inducción de la ovulación con gonadotrofinas en tratamientos de fertilización. La prevalencia de OHSS se encuentra entre el 5-10% de las pacientes que se someten a estas técnicas y una de sus características principales es el aumento de la permeabilidad de la microvasculatura. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) está involucrado en la patogénesis de este síndrome, induciendo alta permeabilidad vascular, y por consiguiente, la presencia de ascitis en las pacientes. En nuestro laboratorio, hemos demostrado que la inhibición del VEGF disminuye la severidad del OHSS en un modelo desarrollado en rata. Pero además, para que exista una vasculatura madura y funcional, colaboran junto al VEGF otros sistemas angiogénicos, como la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y la familia de las esfingosina-1 fosfato. Sin embargo, hasta ahora ningún estudio ha mostrado la posible participación de estos sistemas en la patología mencionada. En base a estos antecedentes, se planteó la siguiente hipótesis: La desregulación de los sistemas de PDGF y S1P está involucrada en la patogenia de OHSS, afectando en parte a la angiogénesis ovárica y aumentando la permeabilidad vascular que conduce a la presencia de ascitis observada en este síndrome. Los objetivos específicos propuestos fueron: 1- Estudiar el efecto in vivo intraovárico que produce el agregado de PDGF-B sobre la permeabilidad vascular y la angiogénesis ovárica, y su relación con la dinámica folicular y luteal, y con la esteroidogénesis en un modelo de OHSS desarrollado en rata. 2-Estudiar el transporte de colesterol en fluidos foliculares humanos (FF) de pacientes sometidas a técnicas de reproducción asistida (ART) con alto riesgo de desarrollar OHSS y pacientes controles. 3-Evaluar el efecto in vitro que produce el agregado del esfingolípido S1P al FF proveniente de pacientes con alto riesgo de desarrollar OHSS sobre un cultivo primario de células vasculares de músculo liso. II) Falla prematura ovárica (FOP) La FOP es un desorden multicausal caracterizado por la desaparición o disfunción prematura de los folículos ováricos, que afecta al 1-2% de mujeres menores de 40 años. Estas pacientes presentan amenorrea, hiperestrogenismo y elevados niveles de gonadotrofinas. Las causas que provocan FOP pueden ser: genéticas, inmunes, infecciosas y/o iatrogénicas (quimioterapia, radioterapia). La mayoría de las drogas quimioterapéuticas,tales como ciclofosfamida y doxorubicina, poseen un fuerte efecto tóxico sobre el ovario, afectando tanto la reserva ovárica como la vasculatura. Hasta ahora, los tratamientos disponibles para FOP no son efectivos. Por otra parte, se ha demostrado que esfingolípidos como la ceramida, la esfingosina y sus formas fosforiladas, la ceramida-1-fosfato (C1P) y la esfingosina-1 fosfato (S1P), regulan procesos celulares escenciales, la apoptosis, la migración y la angiogénesis. Hasta ahora ningún trabajo ha evaluado la participación de C1P en ovario en condiciones patológicas, tal como la FOP inducida con quimioterapia. En base a estos antecedentes, se planteó la siguiente hipótesis: El C1P protege al ovario en la FOP inducida por quimioterapia a través de la modulación de la función ovárica, la mejora de la dinámica folicular y la angiogénesis. Los objetivos específicos fueron: 1- Analizar el efecto in vivo intraovárico del esfingolípido C1P en ovarios provenientes del modelo de FOP inducida por quimioterapia desarrollado en ratón hembra adulto sobre: el desarrollo folicular, la astresis, la apoptosis ovárica, los niveles de esteroides sexuales, el desarrollo y estabilidad vascular del ovario, los mecanismos de transducción de señales, la funcionalidad ovocitaria y la fertilidad de la hembra; 2- Evaluar el efecto in vitro que produce el C1P sobre la viabilidad y la funcionalidad celular en una línea celular de macrófagos expuestos a quimioterapia. En cuanto al modelo de OHSS, el tratamiento local con PDGF-B disminuyó el % de estructuras quísticas, los niveles de progesterona sérica, la expresión de las enzimas esteroidogénicas P450scc y 3β-HSD, la proliferación de células luteales y la permeabilidad vascular ovárica comparado a las ratas OHSS sin tratar. Por otra parte, aumentó el área peri-endotelial en cuerpos lúteos y quistes luteales, así como la deposición de colágeno IV en las membranas basales. Todos estos efectos indican una disminución en la permeabilidad vascular y presencia de ascitis, las cuales representan una de las mayores complicaciones causadas por el OHSS. Al estudiar los FF de pacientes con riesgo a desarrollar OHSS, se observaron alteraciones en los perfiles lipoporteicos y en proteínas relacionadas con el metabolismo del colesterol, así como también alteraciones en las células peri-endoteliales (claves para la estabilidad vascular) al ser tratadas con FF de pacientes con riesgo de OHSS, respecto de FF de pacientes control. Respecto al modelo de FOP inducida por quimioterapia en roedor, observamos que la ciclofosfamida tuvo fuertes efectos gonadotóxicos sobre el ovario (disminución de folículos pequeños y aumento de folículos atrésicos, aumento de la apoptosis, pérdida de la reserva ovárica, alteraciones vasculares, hormonales y disminución en la fertilidad). Todos estos efectos fueron prevenidos, al menos de manera parcial, por la co-administración local de C1P junto con la quimioterapia. Además, la ciclofosfamida causó modificaciones en la morfología uterina, que fueron prevenidas por el co-tratamiento con C1P. Por último, se estudiaron los efectos citotóxicos in vitro en macrófagos generados por ciclofosfamida, siendo estas las células inmunes más relevantes del ovario. C1P fue capaz de aumentar la viabilidad celular y la producción de citoquinas, y de deisminuir la apoptosis inducida por ciclofosfamida en este tipo celular. En conclusión, los resultados observados en el modelo de OHSS indican que el sistema de PDGF participaría activamente en el ovario, regulando la permeabilidad vascular y estableciendo una vasculatura funcional. En el futuro, en el ámbito clínico, este factor podría utilizarse como marcador predictivo y evitar el desarrollo del síndrome en las pacientes que comienzan un tratamiento de fertilización asistida. Por otra parte, los resultados obtenidos con el modelo de FOP inducida por quimioterapia sugieren que C1P es capaz de mejorar la dinámica folicular y de modular el desarrollo vascular en el ovario. Por lo tanto, C1P cumpliría un rol protector en el ovario, preservando la funcionalidad ovárica frente a la toxicidad causada por la quimioterapia. En el futuro, la administración de C1P podría implementarse como posible estrategia para proteger el ovario antes y/o durante el tratemiento antitumoral. De esta manera, aquellas pacientes que han padecido cáncer y están recuperadas tendrían mayor posibilidad de concebir un hijo.

El gen FMR1, responsable del Síndrome de Fragilidad del X (SFX), se localiza en el sitio FRAXA en el brazo largo del cromosoma X (Xq27.3), está compuesto por 17 exones, abarca aproximadamente 38 kilobases (kb) y su producto transcripcional es un ARN mensajero de 3,9 kb que puede sufrir splicing alternativo. En su región 5’ no codificante presenta una zona de tripletes CGG que puede variar en longitud. Según el tamaño de la expansión, los alelos se clasifican en normales (5- 44 repeticiones), intermedios (45-54 repeticiones), premutados (55- 200 repeticiones) o con mutación completa (>200 repeticiones). Mientras que la mutación completa es la causante del SFX, el estado de premutación se asocia a otros 2 desórdenes clínicos: Síndrome de temblor/ ataxia asociado a la Fragilidad del X (FXTAS), un desorden neurodegenerativo de inicio tardío y a la Insuficiencia Ovárica Primaria (IOP) asociada a la Fragilidad del X (FXPOI). La IOP se define como la presencia de amenorrea (de al menos 4 meses) antes de los 40 años, que se acompaña de un aumento en los niveles séricos de FSH (a niveles menopáusicos) y de bajos niveles de estradiol (hipoestrogenismo). Es un síndrome muy heterogéneo de patogénesis multicausal tales como alteraciones cromosómicas, enzimáticas, autoinmunidad, causas iatrogénicas e infecciosas. Tiene una incidencia del 1% en mujeres menores de 40 años y del 0,1% en menores de 30. FXPOI es la causa genética conocida más común de la IOP 46, XX y la premutación en FMR1 es responsable del 4- 6% de todos los casos de IOP 46, XX. Aproximadamente el 2% de las mujeres 46, XX con IOP aislada y el 14% de la mujeres 46, XX con IOP familiar son portadoras de la premutación en el gen FMR1. Asimismo, se ha descripto que alrededor del 20% de las mujeres portadoras de la premutación desarrollan IOP. A su vez, las mujeres portadoras se vuelven menopáusicas aproximadamente 5 años antes que las no portadoras. Si bien no todas las mujeres portadoras de la premutación experimentan una temprana pérdida de la fertilidad, todas ellas enfrentan el potencial adelantamiento en la aparición de condiciones asociadas con la deficiencia estrogénica (aumento en el riesgo de osteoporosis y de enfermedades cardiovasculares). Estudios genéticos epidemiológicos sugieren que el comienzo y la gravedad de la disfunción ovárica asociada a FXPOI son variables y podrían estar moduladas, potencialmente, por el largo de las repeticiones CGG y otros factores ambientales. El status de premutación per se pareciera estar influyendo en la expresión de la enfermedad. De hecho, no se ha descripto que mujeres que poseen expansión completa de tripletes (>200 repeticiones y con signos clínicos de Síndrome de Fragilidad del X) desarrollen IOP. Si bien no se conoce el mecanismo por el cual la premutación del gen FMR1 puede causar la disfunción ovárica y la insuficiencia ovárica primaria, se ha postulado que puede ocurrir una disminución inicial del número de folículos o una velocidad acelerada de la atresia. Es sabido que la proteína que codifica este gen, FMRP, se expresa en altas cantidades en células germinales del ovario fetal. Asimismo, se ha descripto que esta proteína actúa como inhibidor de la traducción de algunos ARN mensajeros formando parte de los procesos de silenciamiento génicos mediados por miRNAs. Teniendo en cuenta su función, se ha postulado como posible hipótesis de la patogenia, que un aumento de FMRP en estadios tempranos del desarrollo de los ovocitos podría conducir a una haploinsuficiencia de proteínas involucradas en este proceso, provocando una disminución del pool inicial de folículos. Sin embargo, y dado que en FXTAS se ha observado un aumento del ARN mensajero del gen como consecuencia de la premutación, se postula como mecanismos alternativo la existencia de un aumento del ARN mensajero en el ovario que ejerza un efecto tóxico en el tiempo, con el consecuente incremento de la atresia folicular. Ninguno de estos mecanismos han sido aún comprobados en el ovario, más aún la función fisiológica de la proteína en el mismo no está establecida. No se conoce además, si existe expresión diferencial a lo largo del desarrollo folicular. Considerando la escasa información que existe acerca de FMR1 y su expresión en ovario, nuestro trabajo consistió, en una primera fase, en el estudio de la expresión de la proteína FMRP y su mensajero a lo largo de la foliculogénesis, en un modelo de rata. Se utilizaron 3 grupos de ratas: ratas prepuberales de 18 días, ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con dietilestilbestrol (DES) para enriquecer a los ovarios en folículos antrales tempranos y ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con gonadotrofina coriónica equina (PMSG) para enriquecer los ovarios en folículos preovulatorios. En la primera parte del trabajo analizamos, por inmunohistoquímica, la expresión de FMRP en los distintos tipos celulares del folículo. Hallamos que la proteína se expresa en células de la granulosa, de la teca y en células estromales, con excepción de un grupo de células que rodea al folículo. La expresión se detectó en los folículos en los tres estadios del desarrollo estudiados: preantrales, antrales tempranos y preovulatorios. La expresión de la proteína FMRP fue estudiada también por Western blot en los tres tipos foliculares. Observamos una menor expresión en folículos preantrales y una mayor expresión en estadios más avanzados de la foliculogénesis. Por otra parte, se detectaron al menos 4 isoformas de la proteína cuyos patrones de expresión resultaron diferentes a los observados en testículo y cerebro. Teniendo en cuenta la función de la proteína como parte del complejo de silenciamiento post-transcripcional, estos resultados nos permitirían estimar que las diferencias observadas en los niveles de expresión de la proteína tendrían un rol en el correcto desarrollo del folículo. Asimismo, la presencia de isoformas distintivas en el ovario sugeriría una función específica para algunas de ellas en la gónada. La segunda parte del trabajo consistió en el estudio de la expresión del ARN mensajero de Fmr1 en los 3 estadios foliculares. Por PCR en tiempo real observamos que el patrón de expresión era opuesto al que se obtuvo para la proteína. En los folículos preovulatorios, el nivel del ARN fue menor respecto al de los estadios anteriores. Estos resultados sugerirían que la expresión del mensajero y su proteína en el ovario están regulados de manera diferente y posiblemente independiente. Por otro lado, identificamos por RT-PCR y posterior secuenciación, la existencia de varias isoformas del ARNm del gen, resultantes del splicing alternativo del mismo. Entre ellas, detectamos la isoforma que contiene al exón 12, la cual no ha sido previamente descripta en rata. El último aspecto que quisimos abordar en nuestro estudio fue el efecto biológico de la introducción de tripletes en el rango de la premutación sobre una línea celular de células de granulosa humana (KGN). Par tal fin se transfectaron las células con un plásmido conteniendo tripletes en el rango normal o de la premutación, río arriba de un gen reportero (GFP). Luego de 18 horas de transfección, los niveles de ARNm del gen reportero resultaron más elevados en las células que poseían los tripletes en el rango de la premutación, en concordancia con lo observado en diferentes experimentos y pacientes con FXTAS. Asimismo, detectamos una menor cantidad de células que expresan la proteína GFP, en presencia del plásmido con la premutación, en todos los tiempos de transfección estudiados. A nivel neuronal se ha relacionado al estado de premutación con posibles efectos apoptóticos en la célula. Si bien nuestros estudios aún no demuestran que el efecto de la introducción de tripletes en el rango de la premutación resulte en un aumento en la apoptosis de las células KGN, los resultados obtenidos en esta tesis abren la posibilidad de que este mecanismo sea analizado en un futuro. En conclusión, en esta tesis se describe por primera vez la expresión de la proteína FMRP y de su mensajero a lo largo del desarrollo folicular, y la presencia de algunas isoformas distintivas, producto del splicing alternativo del gen. Asimismo, se iniciaron los estudios tendientes a demostrar el efecto patogénico que posee la expresión de tripletes expandidos en células del ovario.

El uso de la odontología forense como método de identificación no es un método reciente sino que se utiliza desde tiempos remotos. Tal vez en sus principios no era una ciencia establecida sino más bien, un elemento más de identificación. En los últimos años las ciencias forenses se han desarrollado notablemente, dentro de ellas la odontología. Su empleo resulta de vital importancia en la identificación de personas, principalmente de cadáveres en los cuales no se pueden utilizar otros métodos identificatorios debido al gran deterioro del cuerpo, como es el caso de restos óseos, carbonizados, mutilados, o cadáveres en estado de descomposición avanzada. La importancia de la odontología forense radica en que no existen dos dentaduras idénticas. Aún en el caso de los gemelos univitelinos existen variaciones. La mayor información se obtiene de radiografías comparativas pre y post mortem. También se obtienen datos de gran interés de la historia clínica y ficha dental, estudios de modelos, fotografías, y a su vez existe la posibilidad de aislar ADN de la pulpa dental. Tanto la odontología forense como la dactiloscopia pueden acreditar identidad por sí solas. Asimismo, a través del estudio antropológico de los huesos maxilares y piezas dentarias se puede determinar la edad, la raza y el sexo. La creciente utilización de implantes para la rehabilitación oral, obliga al odontólogo a realizar una serie de estudios complementarios antes y después del tratamiento, tales como: radiografías seriadas y/o panorámicas, TAC, modelos de diagnóstico, etc. Todos ellos, pueden hacer un aporte significativo en el área de las ciencias forenses. Existen muchos tipos de implantes, de distintas marcas, formas y tamaños, para lo cual, a fines identificatorios, sería conveniente realizar un catálogo estándar. En la actualidad, aún no se ha considerado el valor de los implantes como elemento de identificación. Los trabajos publicados al respecto son escasos. Es por ello que el objetivo del presente estudio, es demostrar que a través del análisis comparativo de las radiografías pre y post obtenidas de un paciente con implantes, es posible llegar al reconocimiento e identificación positiva de la persona en cuestión.