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Tesis Doctor en Medicina y Cirugía -- Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas.

El citoesqueleto es una red auto-organizada y dinámica presente en las células eucariotas. Está compuesto por tres tipos de biopolímeros: filamentos de actina, filamentos intermedios y microtúbulos. Estos filamentos se constituyen a partir de la polimerización de proteínas más simples y forman estructuras con diámetros de ~6nm para los filamentos de actina y ~10nm para los filamentos intermedios. Los microtúbulos son los elementos más rígidos del citoesqueleto, con una estructura tubular de diámetro externo de ~25nm. Estos biopolímeros, en conjunto con proteínas motoras, componen un entramado con propiedades mecánicas que permite a las células generar y reaccionar ante la acción de fuerzas. El citoesqueleto está involucrado en numerosos procesos celulares tales como la migración, división, contracción y el transporte de organelas. Por este motivo es muy importante estudiar el comportamiento mecánico de los filamentos del citoesqueleto para lograr un mayor conocimiento de la organización y mecánica celular. La microscopía de fluorescencia ha revolucionado nuestro conocimiento del citoesqueleto, permitiendo su visualización en células vivas. El análisis del movimiento y de las fluctuaciones en las formas de los filamentos del citoesqueleto permite estudiar las propiedades mecánicas relevantes a su función biológica. Este tipo de análisis requiere la identificación de las posiciones de filamentos individuales con alta precisión. Sin embargo, el seguimiento de filamentos individuales a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia de células vivas es extremadamente complejo. Es por ello que en la primera parte de esta Tesis, desarrollamos un algoritmo de tracking de filamentos que permite obtener las coordenadas de microtúbulos fluorescentes con precisión subdifracción. Evaluamos el rendimiento de esta rutina mediante simulaciones numéricas de imágenes confocales y experimentos in vitro y obtuvimos una precisión de ~9nm para filamentos in vitro y ~20nm para filamentos en células fijadas. Utilizando este algoritmo, estudiamos las distribuciones de curvaturas de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis vivas. Mediante un análisis de Fourier de las formas de los filamentos hallamos que, en un entorno fuera del equilibrio como el citoplasma, las curvaturas se ajustaban a un comportamiento térmico, de acuerdo con resultados reportados anteriormente. Estos datos fueron utilizados para calcular la longitud de persistencia de los microtúbulos en distintas condiciones experimentales. La longitud de persistencia es un parámetro ampliamente utilizado para describir las propiedades mecánicas de filamentos, y se define como la razón entre la rigidez exural del filamento y las fuerzas térmicas actuando sobre el mismo. La longitud de persistencia efectiva calculada para microtúbulos en células vivas fue ~20 nm, valor significativamente menor que el medido in vitro. Este parámetro no se vio modificado en presencia de la proteína asociada a microtúbulos XTP o la depolimerización de actina. En contraste, la depolimerización de la red de filamentos intermedios disminuyó significativamente el valor de este parámetro. Por otra parte, exploramos si la inhibición de los eventos de polimerización y depolimerización de los microtúbulos podría afectar su rigidez exural efectiva. En este caso, la distribución de formas de los filamentos no se ajustó a un comportamiento térmico, como el observado en células control, indicando que el comportamiento mecánico de los microtúbulos depende de un delicado equilibrio de fuerzas activas dentro de la célula. Observamos que la depolimerización de filamentos de actina e intermedios aumenta significativamente las fluctuaciones laterales de los microtúbulos, sugiriendo que estos filamentos contribuyen a la organización global de dicha red. Por otra parte, verificamos que la producción de fuerzas no es homogénea dentro de las células ya que los microtúbulos presentaban un movimiento más lento, pero más direccionado en la región cortical en comparación con la región perinuclear. En la segunda parte de esta Tesis, estudiamos los aspectos dinámicos de los eventos de buckling de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis. Éstos son eventos transitorios y localizados observados frecuentemente en células, y se caracteriza por una rápida exión del filamento seguida de su relajación. Se ha propuesto que estos eventos de rápida deformación dependen de fuerzas localizadas espacio-temporalmente resultantes de la acción de motores moleculares. Para comprender este fenómeno, caracterizamos los eventos de buckling mediante el tracking de microtúbulos fluorescentes individuales en combinación con simulaciones numéricas, las cuales nos permitieron explorar distintos mecanismos que podrían producir la exión de filamentos. Los eventos simulados reprodujeron muchas de las características observadas en microtúbulos en células vivas, sugiriendo que el modelo mecánico implementado representaba los procesos esenciales del buckling de microtúbulos. Luego analizamos la interacción entre vesículas fluorescentes transportadas activamente y la red de microtúbulos pudiendo así observar eventos generados por fuerzas activas y correlacionarlos con el movimiento de las vesículas. Los resultados obtenidos de este análisis sugieren que los microtúbulos podrían afectar el transporte indirectamente, aparte de servir como vías para las organelas transportadas. Con el fin de extender nuestro análisis del citoesqueleto a otros sistemas biológicos, estudiamos células de cáncer de próstata, que muestran una expresión anormal de proteínas del citoesqueleto, resultando en una resistencia a la quimioterapia y capacidad de colonizar órganos lejanos. Desarrollamos técnicas computacionales para analizar imágenes de fluorescencia de citoesqueleto en estas células y, en particular, cuantificar la acción de una droga que induce la expresión de Hemo oxigenasa-1, una enzima implicada en la regulación de la morfología celular. Nuestros resultados mostraron que la células bajo la inducción de HO-1 presentaban menos migración y una proporción significativamente mayor de protrusiones tipo-filopodias que las células control, los que indicaría una mayor comunicación entre células vecinas. En síntesis, llevamos a cabo experimentos biológicos para observar el citoesqueleto y desarrollamos técnicas que nos permitieron estudiar estos filamentos en células vivas. De esta forma, pudimos analizar cuantitativamente la importancia del balance y dinámica de fuerzas activas en células para la organización de la red de microtúbulos. Estos conocimientos también fueron de utilidad para analizar los cambios en el citoesqueleto de células de cáncer de próstata.

Los glóbulos rojos (GRs) constituyen un interesante modelo para estudiar el envejecimiento celular debido a la facilidad de obtención de la muestra, su constante remoción y la carencia de núcleo y otras organelas subcelulares. El término “senescencia” se utiliza para los hematíes que muestran la mayor cantidad de cambios dependientes del tiempo y representan la población de eritrocitos que ha sido condenada a muerte. En un individuo con 5 litros de sangre, aproximadamente 10 hematíes son formados y removidos cada día. El eritrocito maduro se halla desprovisto de mecanismos de síntesis, iniciando desde el reticulocito, un proceso de envejecimiento progresivo que termina aproximadamente a los 115 días de su salida de médula ósea. Actualmente se ha propuesto que durante este proceso de senescencia, se producen modificaciones en algunas moléculas de la membrana que alteran sus funciones y las vuelven inmunogénicas. Estos antígenos de senescencia eritrocitaria son reconocidos por autoanticuerpos fisiológicos iniciando el proceso de remoción de los glóbulos rojos senescentes (GRSe) por las células del sistema mononuclear fagocítico (SMF). Sin embargo, la identidad molecular de estos neoantígenos y la naturaleza de los procesos que inducen a su expresión no han sido totalmente dilucidadas. La oxidación de las proteínas de membrana sería uno de los mecanismos más aceptados. Las modificaciones conformacionales o estructurales de la proteína Banda 3, podrían conducir a la formación o exposición de un sitio antigénico. Kay asignó el antígeno de senescencia eritrocitario (ASE) específicamente a la proteína Banda 3. Además, algunos autores han observado en GRSe, una pérdida de la asimétrica lipídica como resultado de la translocación de fosfatidilserina (FS) a la monocapa externa de la membrana plasmática. Los lípidos de la membrana eritrocitaria podrían ser considerados como el primer blanco oxidativo en el proceso de senescencia del hematíe. Experimentos in vitro, en los cuales se evaluaron el tiempo de almacenamiento de la sangre y la depleción metabólica del eritrocito, han demostrado un aumento en la fragilidad de la membrana del GRSe con la posterior liberación de microvesículas. Las vesículas son rápidamente removidas por células del SMF en un proceso mediado por receptores en los macrófagos que unen FS y probablemente también por autoanticuerpos específicos contra el ASE. Debido a que la membrana del eritrocito experimenta una fuerte interacción con el ambiente extracelular, las modificaciones en sus moléculas podrían ser responsables de la remoción selectiva de los hematíes. Actualmente se considera que los GRSe o dañados son removidos de la circulación in vivo por células fagocíticas en un proceso conocido como eritrofagocitosis. Algunos cambios en los GRs estarían involucrados en su eliminación por fagocitosis, aunque los detalles exactos de los procesos de señalización no son aún totalmente conocidos. Las modificaciones en la Banda 3 mayoritariamente debidas a procesos oxidativos aumentarían la afinidad por los anticuerpos naturales anti-Banda 3 que se encuentran normalmente en circulación. Estos anticuerpos autólogos junto con el depósito de fragmentos del Complemento principalmente C3, serían fácilmente reconocidos por receptores específicos de las células fagocíticas. Los eritrocitos son protegidos normalmente de la lisis mediada por complemento por proteínas de superficie reguladoras de la actividad del complemento. El factor acelerador de la degradación o DAF (CD55) inhibe la ruptura de C3 y C5 aumentando el decaimiento de la convertasa C3 y C5. El inhibidor de membrana de la lisis reactiva (CD59), impide la formación del complejo de ataque a la membrana mediante su unión a C8 y C9. La disminución de la expresión de las proteínas CD55 y CD59 en la superficie de los GRSe, conduciría a un aumento de la lisis mediada por el Sistema del Complemento. Por otro parte, el hematíe maduro en la circulación enfrenta un medio ambiente dinámico y es sometido a distintas fuerzas en sus pasajes por los vasos sanguíneos. Diferentes moléculas de adhesión participan en la regulación de esta interacción. En humanos, la glicoproteína CD47 está asociada con los antígenos Rhesus y ambos forman parte del complejo macromolecular Banda 3. CD47 inhibe la fagocitosis de los eritrocitos por los macrófagos del SFM a través de la unión a las proteínas regulatorias de las señales (SIRPα) en el macrófago. Un modelo experimental propone que durante el envejecimiento se induce un cambio conformacional en CD47, que le permite unirse a la trombospondina (TSP-1) creando un nuevo sitio de unión para SIRPa, que es capaz de reconocer a CD47 como una señal de fagocitosis en lugar de una señal inhibitoria de este mecanismo. La Hipótesis de este trabajo de Tesis es que durante el proceso de senescencia del hematíe, se producen cambios en algunas moléculas de la membrana plasmática, que actuarían como marcadores en la superficie celular activando la remoción selectiva de los GRSe. Por otra parte, considerando que las preguntas sobre los mediadores que determinan la captura de los GRs por las células del SMF y los procesos propios de la eritrofagocitosis siguen actualmente sin respuesta, el estudio propuesto en este trabajo de Tesis permitirá profundizar los conocimientos sobre los mecanismos biológicos involucrados en la senescencia celular y en la destrucción eritrocitaria. Como objetivos generales nos proponemos: investigar las modificaciones de moléculas de la membrana eritrocitaria durante el envejecimiento de los GRs y analizar la participación de estos cambios en la remoción selectiva de los GRSe. En una etapa inicial de este trabajo de Tesis, separamos las poblaciones de GRs de distintas edades por medio de gradientes de densidad. Debido a que la senescencia es un proceso continuo que no produce ningún cambio crítico que permita identificar con precisión las diferentes poblaciones eritrocitarias, evaluamos la separación por gradientes de densidad de Percoll, mediante el estudio de parámetros hematológicos (Volumen Corpuscular Medio (VCM) y % de Reticulocitos) y parámetros bioquímicos (concentración de creatina). En las poblaciones de GRJ obtenidas, los valores de VCM y el % de Reticulocitos, fueron significativamente mayores que los observados en las suspensiones de GRSe. Estos resultados verifican la eficacia en la obtención de fracciones eritrocitarias homogéneas, porque los hematíes envejecidos presentan menor tamaño. El aumento de la densidad de los hematíes en función del tiempo, se produce por una pérdida preferencial de los constituyentes más livianos de la solución citoplasmática, que conduce a una reducción del volumen. El mayor % de R en las suspensiones de GRJ, es un hallazgo esperable porque esta fracción representa los hematíes de menor edad. Los valores promedios de concentración de creatina en las poblaciones de GRSe, significativamente menores que los observados en los glóbulos rojos jóvenes (GRJ) se deben a una disminución en los intermediarios fosforilados del metabolismo energético que ocurre en el envejecimiento. También realizamos la cuantificación de las proteínas de membrana en las suspensiones de GRSe y GRJ, sin hallar diferencias significativas respecto a la edad del hematíe en la concentración de proteínas. En trabajos recientes se ha propuesto, que el proceso de oxidación de proteínas de membrana tendría un rol central en las modificaciones que se producen durante la senescencia eritrocitaria, debido a que los GRs son especialmente susceptibles a la injuria por oxidación al estar expuestos constantemente a altas concentraciones de O2. Por ello, estudiamos la formación de grupos carbonilos en las distintas poblaciones eritrocitarias, como marcadores de estrés oxidativo debido a su formación relativamente temprana y la estabilidad de las proteínas carboniladas. Los resultados obtenidos revelaron que el contenido de grupos carbonilos es significativamente mayor en los GRSe, confirmando un incremento del nivel de oxidación de las proteínas de membrana durante el envejecimiento. Por lo tanto, teniendo en cuenta que la senescencia eritrocitaria es un proceso multifactorial de enorme complejidad, que se caracteriza por alteraciones a nivel celular de aspectos fisicoquímicos y biológicos, estos resultados contribuyen a destacar la relevancia de los cambios oxidativos en las proteínas de la membrana involucrados en el proceso de reconocimiento y remoción selectiva de los GRSe de la circulación. Considerando que el parámetro fisiológico más importante del envejecimiento eritrocitario es la presencia de IgG autóloga, continuamos nuestra investigación determinando la concentración de IgG en GR intactos. Desarrollamos una técnica que mide el consumo de anti-IgG humana marcada con una enzima por células que contienen IgG unida a su superficie, realizando posteriormente la cuantificación de los anticuerpos anti-IgG no unidos. Los resultados obtenidos mostraron un aumento significativo en el contenido de IgG en las suspensiones de GRSe con respecto a los valores observados en los GRJ. Además, confirmamos el incremento de IgG autóloga sobre la membrana eritrocitaria en las poblaciones de GRSe mediante imágenes obtenidas por microscopía confocal, visualizando en forma directa la mayor cantidad de anticuerpos unidos a las células de mayor edad. El escaso número de IgG eritrocito específico encontrado bajo condiciones fisiológicas in vivo indica que la remoción de los GRSe es un proceso eficiente y muy bien regulado. Debido a que se ha propuesto que la acumulación de IgG provee un mecanismo directo para la remoción selectiva de los GRSe mediante la unión a receptores específicos sobre las células del SFM utilizamos un ensayo funcional de monocapa de monocitos (EMM) como parámetro evaluador de los fenómenos que ocurren in vivo. Los resultados obtenidos en esta prueba funcional confirman el incremento en la fagocitosis de GRSe que ha sido demostrada por otros autores utilizando técnicas más laboriosas y de mayor costo. Además evaluamos la pérdida de ácido siálico, utilizando el EMM con hematíes tratados con enzimas desialinizantes. Los resultados obtenidos indican que el tratamiento con neuraminidasa aumenta la interacción entre los eritrocitos y las células del SFM. En cambio, la actividad desialinizante de la tripsina no fue suficiente para producir variaciones en la fagocitosis. Estos hallazgos confirman que la pérdida de ácido siálico participa en la destrucción del hematíe, constituyendo una vía alternativa del principal proceso de fagocitosis selectiva de los GRSe que se produce por depósito de IgG autóloga en la superficie eritrocitaria . Considerando que en la obtención de células de diferentes edades por métodos separativos, la manipulación y la cantidad de muestra son limitaciones en estas investigaciones, estudiamos distintos marcadores de senescencia en sangre entera por Citometría de Flujo, por las ventajas que presenta esta metodología. Validamos el empleo de esta técnica analizando la presencia de IgG autóloga en poblaciones de GRs separadas por gradiente de densidad y en muestras de sangre entera sin separación física de las células. Posteriormente evaluamos la participación de proteínas reguladores de la actividad del Complemento (C3, CD55, CD59) y de la molécula de adhesión CD47. Las modificaciones en el nivel de expresión de las proteínas mayoritarias de los GRs: Banda 3 (CD233) y Glicoforína A (CD235a) en las diferentes poblaciones etáreas, podrían ser el resultado del proceso de microvesiculización y reducción del VCM. Los resultados obtenidos indicaron que estas poblaciones de GRs, pueden estudiarse sin realizar una separación física de las células de distintas edades. La evaluación directa de los GRSe por Citometría de Flujo, permite utilizar pequeñas cantidades de muestras y evita las manipulaciones de las técnicas separativas. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis desde un punto de vista general, serán útiles a la investigación básica y aplicada vinculada al envejecimiento celular y en particular, profundizarán el conocimiento sobre los mecanismos de la senescencia eritrocitaria. Los avances obtenidos permitirán establecer la participación de los componentes intracelulares en los diferentes cambios en la superficie eritrocitaria que determinan su reconocimiento específico y los mediadores inmunológicos que conducen a la remoción selectiva de los GRSe. Además, la correcta descripción del proceso de senescencia eritrocitaria contribuirá al conocimiento sobre la etiología y desarrollo de algunas eritropatías y a la realización de un diagnóstico más precoz y adecuado. También, teniendo en cuenta que se ha postulado que en los GRs almacenados en los bancos de sangre se producen modificaciones similares a las observadas durante el envejecimiento eritrocitario in vivo, que podrían contribuir a los efectos adversos de las transfusiones, la identificación de los cambios en los GR envejecidos aportará nuevos enfoques para optimizar el mantenimiento metabólico y la integridad celular de los eritrocitos transfundidos. La correcta descripción del proceso de envejecimiento eritrocitario permitirá mejorar la eficacia transfunsional y la conservación de las fracciones eritrocitarias en los bancos de sangre.

Tesis (Dra. en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

En este trabajo se estudiaron las anomalías inducidas por la diabetes materna en el embrión y en la decidua de rata en el período de organogénesis temprana, así como también el efecto de la administración de agonistas de receptores activados por proliferadores peroxisomales (PPARs) administrados en la dieta y/o de ácido fólico sobre dichas anomalías. Se encontró una disminución en el crecimiento embrionario y un incremento en las tasas de reabsorción y malformación embrionaria en las ratas diabéticas y se observaron disminuciones en los niveles de PPARδ tanto en los embriones como en las deciduas provenientes de ratas diabéticas. Además, se observaron en estos tejidos alteraciones en el metabolismo del ácido araquidónico, en la producción de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno y en la actividad y expresión de enzimas responsables de la remodelación tisular inducidas por la diabetes. Las dietas suplementadas con aceites ricos en agonistas de PPARs administradas a las ratas diabéticas gestantes revierten parcialmente las anomalías en el crecimiento embrionario y la tasa de malformación embrionaria. El mecanismo de acción involucra la regulación de la producción de prostaglandinas, la reducción del estrés oxidativo y nitrativo y la regulación de la actividad de las MMPs y TIMPs en el embrión y en la decidua diabética. El tratamiento consistente en la administración de ácido fólico junto a la dieta enriquecida en aceite de cártamo administrado a las ratas diabéticas logra una reversión total de las malformaciones embrionarias regulando el entorno pro-inflamatorio inducido por la diabetes y previniendo anomalías de enzimas involucradas en la remodelación de la matriz extracelular tanto en el embrión como en la decidua de rata diabética. Estos hallazgos nos permiten destacar a los tratamientos enriquecidos en aceites de oliva y cártamo (capaces de activar PPARs) y con folatos como eficaces reguladores del daño inducido por la diabetes materna, resultados de interés en la búsqueda de tratamientos plausibles de ser aplicados a la gestación humana.