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Los lípidos en el núcleo, al igual que en el resto de la célula, son moléculas muy versátiles que poseen un activo metabolismo e importantes funciones biológicas que abarcan roles estructurales, energéticos, y en la regulación celular, en procesos de señalización actuando como segundos mensajeros. Los lípidos nucleares se encuentran en dos localizaciones muy contrastantes, la envoltura nuclear, más fluida que el interior nuclear y compuesta de glicerofosfolípidos (GPL), esfingolípidos (SL) y colesterol (C); y dentro del núcleo, en las Gotas Lipídicas Nucleares (nLD), donde se encuentran concentrados todos los triacilglicéridos (TAG) y éster de colesterol (CE) nucleares, organizados en un core hidrofóbico rodeado de una monocapa de lípidos polares (LP), C y proteínas asociadas. El objetivo de este trabajo fue dilucidar el metabolismo y las funciones biológicas de los lípidos nucleares. Determinar la proteómica y la topología de los dominios lipídicos nucleares. Se utilizó como modelo experimental el cultivo primario de hepatocitos de rata y las células HepG2, y se evaluó a las nLD en forma comparativa con las Gotas Lipídicas Citosólicas (cLD) en una misma célula. Se aislaron nLD y cLD por sedimentación en gradiente de sacarosa. Se cuantificaron parámetros morfológicos de nLD y cLD a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia mediante el software Image-Pro plus. Se utilizó como estímulo externo del metabolismo lipídico y de las LD, al ácido oleico (AO) en distintos protocolos experimentales. La composición lipídica se determinó mediante análisis bioquímicos tradicionales. Se diseñó una importante herramienta metodológica para abordar el estudio de proteómica de las nLD mediante la técnica de GeLC-MS. La muestra de nLD debió ser previamente concetrada y fue necesario eliminar los interferentes presentes, ya que las nLD constituyen una muestra compleja con baja cantidad de proteínas, y están formadas por lípidos neutros, que son moléculas hidrofóbicas que dificultan su análisis. Algunas de las proteínas identificadas en el subproteoma de las nLD ya habían sido descriptas en asociación a las cLD, y otras fueron descriptas por primera vez en el núcleo celular. Dentro de las proteínas descriptas, algunas poseen funciones estructurales, enzimáticas, otras constituyen factores de transcripción y marcadores de cáncer. Se identificaron dos proteínas asociadas al metabolismo lipídico, Ces1d (Carboxilesterasa 1d) y ECHP (peroxisomal bifunctional enzyme), involucradas en los procesos de lipólisis y de β-oxidación lipídica, respectivamente, que no habían sido descriptas hasta el momento en el núcleo celular. Teniendo en cuenta que Ces1d aun no ha sido cristalizada, se realizó un estudio in silico, y se predijo su estructura 3-D utilizando como molde su ortólogo humano CES1. El 95% de los residuos de Ces1d fueron modelados con más de un 90% de confianza. Mediante el alineamiento de secuencias, fue posible predecir además, la posición de potenciales sitios de interés asociados a la función, localización y estructura de Ces1d. En este trabajo se demostró que las nLD constituyen un dominio nuclear dinámico cuyas características morfológicas y composición responden en forma reversible a estímulos externos, como el ácido oleico. Estos resultados implican que las nLD estarían participando activamente en procesos que se desarrollan dentro del núcleo. En particular, se demostró que las células frente al estímulo externo de AO responden activando las rutas anabólicas que determinan un aumento en el número y tamaño de las LD en las poblaciones de cLD y nLD, a través de mecanismos de incorporación de lípidos neutros sintetizados de novo y de fusión de gotas existentes de menor tamaño. El fenotipo anabólico desencadenado por el AO se revierte al eliminar el estímulo del medio y se activan entonces, los procesos catabólicos de la célula que involucran un mecanismo de fisión de gotas grandes en gotas de menor tamaño. Estos procesos catabólicos incluirían la lipólisis y posterior oxidación de los lípidos neutros (LN) de las LD que disminuirían de tamaño por reducción de sus componentes y se iniciarían con la translocación de la Ces1d desde el citosol y la matriz nuclear hacia las cLD y nLD, respectivamente. La Ces1d presente en las nLD y las cLD, posee un activo rol en este proceso, hidrolizando TAG y CE. Los ácidos grasos (FA) liberados de la hidrólisis de los lípidos de las nLD por acción de la Ces1d, se unirían a la L-FABP (liver fatty acid binding protein) en la matriz nuclear, y translocarían a sitios de β-oxidación nuclear y/o citosólicos, y finalmente serían oxidados. Así mismo, los FA liberados en la matriz nuclear podrían unirse como ligandos, a factores de transcripción nucleares y participar en la regulación de estos mismos procesos. Las nLD no serían estructuras inmóviles nucleares sino que podrían desplazarse utilizando actina y miosina, actuando así como un sistema de delivery y de recepción de lípidos y de proteínas dentro del núcleo. A partir de los resultados de este trabajo, las nLD deben ser consideradas como un importante dominio nuclear a tener en cuenta, ya que seguramente están participando en muchos de los eventos que se desarrollan en el núcleo, además de los directamente relacionados con la homeostasis lipídica, tanto en condiciones normales como patológicas.

Queda claro que los efectos de la insulina son tan complejos, inter-relacionados y diversos que es muy difícil explicar el cambio final observado en nuestros pacientes DM2 tras la administración de la hormona. Esto se agrava por la falta de estudios previos de este tipo de problemática desde una perspectiva mecanística. Por un lado la hormona podría ejercer efectos pro-aterogénicos, pero por otro sus actividades directa o indirectamente anti-aterogénicas se hacen prevalentes y el resultado final resulta ser protectivo. Esta conclusión debe ser necesariamente acompañada de una consideración especial sobre el nivel de hiperinsulinismo y resistencia periférica a la hormona que exhiba el paciente. La suplementación estaría indicada cuando el nivel de insulina circulante no es excesivo o en términos mas sencillos cuando los marcadores convencionales superen ciertos valores de referencia que aún no han sido investigados (por ejemplo Hb A1c ≥ 7%). De modo que se requieren estudios más exhaustivos y con un mayor n para decidir cual sería la línea de corte y la condición de hiper-insulinismo que desacosejarían su implementación. En general, podemos decir que la administración de insulina en combinación con hipoglucemiantes orales modifica significativamente y de manera beneficiosa a todos los biomarcadores de inflamación, y a la mayoría de los marcadores de riesgo aterogénico y disfunción endotelial. Estos efectos son independientes del tipo de insulina administrada, pero correlacionan con otras variables sustentando la idea de obtener un beneficio tras su administración. Existe una clara dependencia entre el deterioro evaluado por cualquiera de los marcadores y el tiempo de evolución clínica, y una compleja inter-relación entre ellos que se ve mejorada por efecto de la hormona siempre y cuando se considere exceptuar a los pacientes con muy significativa hiperinsulinemia. Los resultados apoyan la implementación de una terapia combinada de hipoglucemiantes orales e insulina como una mejor opción para disminuir las complicaciones de la DM2, siempre que se tomen los recaudos pertinentes para evitar el riesgo de hipoglucemia (sobre todo en pacientes susceptibles). Asimismo, podría favorecer una mayor expectativa funcional de las células beta que de este modo no se verían tempranamente agotadas para acometer con la demanda creciente de insulina a nivel periférico. Se justificaría ampliar este tipo de investigaciones longitudinales a grandes poblaciones de pacientes DM2 cuidadosamente seleccionadas a fin de rectificar o ratificar estos hallazgos como generadores de hipótesis de trabajo, las cuales conducirían finalmente a una descripción mecanística clara sobre los eventos sobre los cuales se sustentan. Tras la dilucidación de estas cuestiones podría ser posible entonces admitir su inclusión como un protocolo o una recomendación farmacológica sentada sobre bases mucho más convincentes.

En una amplia variedad de microorganismos, el reparto de la glucosa para producir oligo- y polisacáridos estructurales o de reserva es una etapa central del metabolismo, y la producción de compuestos con diferentes funciones celulares está determinada en relación a cómo la Glc-1P es utilizada por diferentes enzimas. La enzima UDP-GlcPPasa cumple una función relevante para la producción de distintos glicoconjugados en los microorganismos que son objeto de estudio en la presente Tesis (Streptococcus mutans, Entamoeba histolytica, Trypanosoma cruzi, y Trypanosoma brucei). En este trabajo de Tesis se presenta la caracterización de la UDP-GlcPPasa de los cuatro microorganismos, realizando de un análisis comparativo de las propiedades de la enzima con las de otras pirofosforilasas, para poder comprender cómo la Glc-1P es fraccionada metabólicamente y cómo este proceso es regulado en diferentes células. Así, se clonaron los genes que codifican para las distintas UDP-GlcPPasas. Las enzimas se expresaron en forma recombinante, pudiendo obtener a las proteínas de interés solubles, activas. Se realizó la caracterización cinética y estructural de cada una de ellas y se detectaron posibles mecanismos regulatorios de las actividades de estas enzimas. Parte de los resultados indican que en parásitos protozoarios existiría un mecanismo de regulación de la actividad de las UDP-GlcPPasas por modificación post-traduccional redox. Así, algunas de las especies químicas producidas por reducción incompleta del oxígeno, no sólo generarían condiciones de estrés oxidativo sino que actuarían como reguladores redox de la actividad de enzimas que, como las UDP-GlcPPasas, forman parte de otras rutas metabólicas en los parásitos.

Muchas bacterias son capaces de moverse en forma autopropulsada tanto en medio líquido como semisólido, siendo la natación o swimming uno de los tipos de movimiento más estudiados. Para este tipo de movimiento se requieren unos apéndices llamados flagelos, estructuras filamentosas que protruyen del cuerpo de la bacteria y se caracterizan por tener una longitud de varias veces la de la célula. Es mediante la rotación de estos filamentos que la bacteria puede nadar alcanzando velocidades de hasta 30 μm.seg−1. La rotación de estos flagelos es producida por un motor celular inserto en la membrana de la bacteria, que rota gracias a un flujo de protones desde el periplasma hacia el citoplasma. El flujo de protones en los motores celulares es posible gracias a una diferencia de potencial de protones en este sentido, al que llamaremos p. El potencial p se mantiene por la translocación de protones desde el interior de la bacteria hacia el exterior en la cadena de transporte de electrones (CTE). Este potencial es utilizado también para la síntesis de ATP, metabolito que interviene en múltiples reacciones bioquímicas, y es conocido como moneda de energía de la célula. Entonces, una bacteria que posee flagelos debe administrar p entre la síntesis de ATP y el movimiento de los flagelos. En este sentido construimos un modelo basado en la quimiosmótica y la termodinámica de no-equilibrio que relaciona el consumo de O2 en la CTE con la formación de ATP y el flujo de protones a través de los motores flagelares, para estudiar la contribución de p en uno u otro proceso. Como resultado, observamos que al incrementarse el número de flagelos manteniendo constante la tasa de consumo de ATP, se incrementa la tasa de consumo de O2, siendo estos procesos dependientes de la regulación de la relación NADH/NAD+. Bradyrhizobium diazoefficiens utiliza para nadar dos sistemas de flagelos: el flagelo subpolar y los flagelos laterales, ambos son activados por p. El primero es constitutivo y los segundos se inducen en ciertas fuentes de carbono (como L-arabinosa) y en otras no (como D-manitol). Para estudiar los parámetros energéticos de B. diazoefficiens con relación a la presencia de los flagelos laterales, realizamos cultivos en biorreactor de la cepa salvaje y de una mutante carente de flagelos laterales. Observamos que en la cepa salvaje la tasa de consumo de O2 era tres veces mayor con L-arabinosa que con D-manitol, en concordancia con la predicción del modelo matemático. Por su parte, el mutante no mostró diferencias entre los cultivos con L-arabinosa o D-manitol, corroborando que la diferencia en la tasa de consumo de O2 se debió a la actividad de los flagelos laterales. También realizamos una comparación del proteoma de cultivos de la cepa salvaje en L-arabinosa o D-manitol, de lo cual dedujimos que estos dos azúcares se oxidan por rutas muy diferentes. La L-arabinosa se oxida por la ruta L-KDA (similar a la de Entner-Doudoroff) seguida de la oxidación de oxalato, mientras que el D-manitol primero debe ser oxidado a D-fructuosa y luego pasa por la ruta de las pentosas-fosfato o el ciclo de Calvin-Benson-Bassham. Estas diferentes rutas podrían arrojar rendimientos energéticos distintos los cuales podrían explicar por qué en una fuente de carbono la bacteria puede mantener estructuras tan costosas como los flagelos laterales y en la otra no. Sin embargo, nuestras observaciones indicaron que el rendimiento energético de ambas rutas es similar, con lo cual la diferencia en la tasa de consumo de O2 parece ser más una consecuencia que la causa de la expresión diferencial de los flagelos laterales en L-arabinosa. Curiosamente, los cultivos en D-manitol expresaron diferencialmente la ribulosabisfosfato- carboxilasa-oxigenasa (RuBisCO) y la ribuloquinasa, indicando que en esas condiciones estaría activo el ciclo Calvin-Benson-Bassham. Para determinar en qué podría requerirse la actividad RuBisCO, obtuvimos un mutante delecional en cbbL, que codifica la subunidad catalítica de dicha enzima, y observamos que la mutación produjo defectos en el crecimiento y en la competitividad para nodular raices de soja.

Se estudió la suplementación energética contrastante en carbohidratos: grano de maíz (MZ; almidón) vs. cascarilla de soja (CS; hemicelulosa y celulosa), sobre la biohidrogenación ruminal (BH) de los ácidos grasos (AG) de cadena larga, el microbioma y la calidad de la leche de ovejas en un sistema de base pastoril. En el experimento I se evaluó el consumo (CMS), la digestibilidad (DMS) y la producción (PL), composición química y perfil de AG de leche de ovejas consumiendo raigrás (50:50 F:C). Se utilizaron diez ovejas lecheras (30 DEL; 65.8 ± 8.67 kg de PV) en un DCA con medidas repetidas, con dos tratamientos: CS o MZ (14 d de adaptación y 3 semanas de medición). Los resultados fueron analizados por ANVA con un procedimiento de modelos mixtos (animal como efecto aleatorio y el tratamiento, semana y la interacción como efectos fijos) y las medias comparadas por Tukey (α= 0,05). El CMS y de forraje y digestibilidad de FDA fue superior en CS, aunque la DMS fue mayor para MZ (P menor a 0.05). La PL fue un 24% superior en CS (aunque sin diferencias estadísticas), con mayores contenidos de omega-3 y PUFA (P menor a 0.05). En el experimento II, se evaluaron las variables de ambiente ruminal y perfil de AG en rumen. Se utilizaron seis ovejas lecheras con cánula ruminal (78,19 ± 13,53 kg de PV), en un diseño cross-over 2x3, bajo la misma dieta y tratamientos que en I. Sobre muestras de licor ruminal (08:00, 12:00, 16:00, 20:00, 00:00 y 04:00 hs) se determinó pH, nitrógeno amoniacal (N-NH4) y ácidos grasos volátiles (AGV). Los resultados fueron analizados igual que en I para un cross-over. La relación Ac:Prop, el N-NH4 y el pH ruminal fueron mayores en CS (P menor a 0.05). El trans-11 y el C18:1cis-9 fueron superiores en CS (P menor a 0.05) y el C18:2 y C18:2 cis-9, trans-11 CLA tendieron a ser mayores en MZ (mayor consumo de linoleico; P menor a 0.05). El C18:2 trans-10, cis-12 CLA tendió a ser superior en CS (0,14 vs. 0,09 g/100g AG) (P menor a 0.1). El análisis de microbioma ruminal se hizo a través de la secuenciación de la región V4 del gen 16S rRNA (bacterias y archaeas) de 18 muestras del Exp. II, utilizando plataforma Illumina MiSeq. Se identificaron 20 phylum bacterianos, lo más abundantes fueron Firmicutes y Bacteroidetes (RA; 54,86% y 34,81% en CS y 69% y 21,15% en MZ; P menor a 0.05) y 90 asignaciones taxonómicas (mayor RA: Clostridiales, Prevotella, Bacteroidales, Methanobrevibacter, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Butyrivibrio, Ruminococcus, Coprococcus, Treponema y Methanosphaera). Sólo 23 difirieron entre dietas y Ruminococcus, Butyrivibrio y Shuttleworthia fueron superiores en MZ (P < 0.05). Estos dos estuvieron correlacionados entre sí y con el cis-9, trans-11 CLA (P menor a 0.01; r=0.79) y con el trans-10, cis-12 CLA se correlacionó Blautia en CS (P menor a 0.01; r=0.84). La suplementación con CS resultó en mayor PL y % de grasa, con un perfil más saludable. La BH difirió entre suplementos, posiblemente por la composicion del microbioma. Las correlaciones entre AG y ciertos géneros entre sí podrían contribuir a dilucidar la composicion bacteriana de los llamados “grupos A y B” del proceso de BH.