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Una de las principales funciones del sistema nervioso es el mantenimiento de la homeostasis, detectando y reaccionado frente a señales que superan un determinado umbral. El cerebro es capaz de detectar eventos inmunes en la periferia ya sea a través de compuestos solubles o a través del nervio vago y de reaccionar mediante la activación del eje hipotálamo-pituitaria- adrenal, modulando la respuesta inmune. La progresión tumoral se caracteriza por una interacción con el sistema inmune y por poseer una alta tasa de mutaciones. El período comprendido entre el inicio y de un tumor, y la detección clínica, puede ser de entre 10 y 15 años. Durante este tiempo cada una de las mutaciones podría convertirse en una señal de alarma. En la actualidad ha sido demostrado que la presencia de un tumor en la periferia induce cambios en el metabolismo de neurotransmisores en el cerebro, sin embargo se desconoce si a su vez existen cambios a nivel transcripcional. En esta Tesis se demostró mediante la utilización de la tecnología de microarreglos en tres modelos tumorales, que la presencia de células tumorales en crecimiento en la periferia induce cambios en los niveles de expresión de determinados grupos de genes en el cerebro, pero no en un órgano periférico como el hígado. A su vez se demostró la existencia de cambios en niveles de expresión en el cerebro como consecuencia del desarrollo de artritis reumatoide. Estos cambios fueron específicos para cada tipo de tumor y para cada enfermedad. Estos resultados demuestran que señales periféricas derivadas del desarrollo de un tumor o de una enfermedad como artritis son capaces de inducir cambios en el perfil de expresión del cerebro.

El objetivo general de este estudio es avanzar en el esclarecimiento de mecanismos fisiopatológicos responsables del desarrollo de cambios en el metabolismo y la función esteroidogénica adrenal y ovárica como consecuencia de una modificación de la acción androgénica, ya sea por una hiperandrogenemia temprana como por un bloqueo de los receptores de andrógeno a edad neonatal. Está postulado que la androgenización pre-o neonatal en el sexo femenino interaccionaría con factores genéticos, el medio ambiente (dieta, etc.) o la combinación de ellos, afectándose la programación en la diferenciación de tejidos blanco para andrógenos y modificando la insulino-sensibilidad durante la edad reproductiva. Sin embargo, aún no existe consenso internacional sobre los mecanismos involucrados en las alteraciones inducidas por el temprano exceso androgénico, se infiere que las modificaciones estarían vinculadas a la producción adrenal/ovárica de andrógenos, y las modificaciones endócrinas adipocitarias que puedan afectar el estado metabólico del individuo. Estos estudios podrían aportar al esclarecimiento del desarrollo de insulino-resistencia y la contribución androgénica al desarrollo sexual de la rata hembra, dependientes de una temprana alteración de la actividad de los esteroides sexuales. (Párrafo extraído del texto a modo de resumen)

La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva producida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Mediante la metodología de “Differential Display” (DD) detectamos que la expresión del gen mitocondrial MTND4 está regulada negativamente en FQ. MTND4 es un gen que codifica para la subunidad ND4 del Complejo I mitocondrial (CIm). Esta subunidad es fundamental para la correcta actividad del CIm. Nuestro objetivo principal fue determinar si la reducción de la expresión de MTND4 en FQ induciría una falla en la actividad del CIm. Primero, validamos los resultados del DD mediante RT-PCR semi-cuantitativa en células FQ (CFDE) así como también en células donde la expresión del CFTR había sido corregida (CFDE/6RepCFTR) y en células CFDE/6RepCFTR tratadas con inhibidores de la actividad del CFTR (glibenclamida y CFTR(inh)- 172). A su vez, medimos la actividad del CIm mediante la técnica “Blue Native- PAGE”, en mitocondrias extraídas desde diferentes modelos de células FQ. Así, observamos una disminución significativa de la actividad del CIm en los distintos modelos FQ. También detectamos un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células FQ, mediante la sonda diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Finalmente, medimos el número de copias de ADN mitocondrial (ADNmt) mediante “Real-Time”-PCR para determinar si existía una disminución en el número de copias que pudiese explicar la reducción de la expresión de MTND4. Sin embargo, no encontramos diferencias significativas entre las células FQ y sus controles. Nuestros resultados sugieren que existe una relación causal entre la falla del CFTR y la disminución de la expresión de MTND4. Esta disminución en la expresión de MTND4 está acompañada de una reducción en la actividad del CIm y por un aumento en la producción de ROS, lo que podría tener un rol trascendental en los procesos inflamatorios y apoptóticos observados en FQ, para los cuales no se conocen los mecanismos ni las implicancias fisiopatológicas.

La regulación de los procesos inflamatorios ocupa un lugar central en el mantenimiento de la homeostasis, ya sea durante el proceso de eliminación del agente agresor, durante las etapas posteriores de reparación de tejidos, o durante los procesos inflamatorios crónicos. El evento más importante en un proceso inflamatorio agudo lo constituye el acúmulo de neutrófilos (PMN) en el tejido injuriado. Durante estos procesos diversos factores como citoquinas, quemoquinas, agentes quimiotácticos (C5a, C3a), productos generados de la destrucción de las bacterias y factores del sistema de coagulación generan en los PMN una serie de cambios fenotípicos y morfológicos que llevan a la activación de los mismos y a su migración hacia los focos inflamatorios: en un primer momento los PMN interaccionan con el endotelio capilar a través de moléculas de adhesión denominadas L-selectinas, que les permiten unirse a sus paredes; luego dicha interacción se hace más firme a través de otras moléculas de adhesión como son las β2-integrinas. Aunque este es proceso fisiológico que tiende a mantener la homeostasis, bajo ciertas circunstancias, la interacción del endotelio con los PMN, células con un alto potencial citotóxico, puede llevar al daño endotelial y tisular. Por otra parte, las integrinas no sólo son responsables del reclutamiento leucocitario sino que desencadenan también diversas señales intracelulares. El fibrinógeno (Fbg), componente central del sistema de coagulación y proteína de fase aguda, es uno de los ligandos fisiológicos de la Bgintegrina Mac-l, CR3 o CD11b/CD18, presente en la superficie de los PMN. El objetivo del trabajo fue analizar si la interacción del Fbg soluble (sFbg) con los PMN activados durante un proceso inflamatorio, es capaz de modular su funcionalidad y sobrevida. Los resultados obtenidos permiten concluir que cuando los PMN han recibido señales inflamatorias se modifica la conformación del CDllb/CD18, de tal forma que aumenta su avidez por el sFbg, presente en el plasma o que ha trans-sudado a sitios inflamatorios. Dicha interacción resulta en la activación funcional de los PMN y en la inhibición de su mecanismo apoptótico. Así los PMN presentan una mayor actividad fagocítica y citotóxica y una mayor capacidad para volcar el contenido de sus gránulos con enzimas microbicidas y liticas. Estos resultados implican una conexión entre la cascada de coagulación y la respuesta inflamatoria. Sin embargo, los productos de degradación del sFbg pierden su actividad reguladora, resguardando procesos que descontrolados pueden tomarse sumamente dañinos para el huésped. Esta modulación de la actividad biológica no es más que la expresión de señales intracelulares específicas que resultan del balance de los distintos estímulos recibidos por las células. Aqui también se demuestra que la modulación de los PMN por el sFbg está mediada por una secuencia ordenada de fosforilaciones en residuos de tirosina de distintas proteinas, fundamentalmente la "Focal Adhesion Kinase" o Quinasa de Adhesión Focal (FAK) y la "extracellular regulated kinase" ERKl/2, proteína perteneciente a la familia de las "mitogen activated protein kinases" o proteinas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). La activación de esta cascada juega un papel central en la inducción de degranulación, el aumento de la fagocitosis y el retardo de la apoptosis. Estos hallazgos aportan evidencias a favor de que la activación de la proteína ERKl/2 está asociada con un aumento en la actividad biológica y una disminución en los procesos de muerte celular en los PMN. El mecanismo apoptótico involucra además otras señales intracelulares, como la inducción de distintos factores nucleares y genes. Los factores de transcripción NF-kB son una familia de proteinas capaces de unirse a sitios reguladores del DNA modulando la expresión de diferentes genes entre ellos varios anti-apoptóticos. En esta tesis se demuestra que en los PMN el sFbg también activa el NF-kB, en forma secuencial a la activación de la ERKl/2 y que la translocación al núcleo del NF-kB, es responsable de la inhibición de la apoptosis. El conocimiento detallado de estos caminos intracelulares es de suma importancia para entender y, eventualmente, intervenir farrnacológicamente en enfermedades con un componente inflamatorio importante.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014

Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se asocian generalmente con estrés oxidativo celular, pero también tienen un importante rol como mensajeros celulares en la señalización redox, por ejemplo, modulando la actividad de los receptores de neurotransmisores y canales iónicos. Hasta el momento no se habían demostrado acciones directas de las ROS sobre los receptores GABAA. En este trabajo se estudiaron los efectos de las ROS sobre la función del receptor GABAAρ1. Se expresaron receptores homoméricos GABAAρ1 humanos en oocitos de Xenopus laevis y se registraron electrofisiológicamente las respuestas evocadas por GABA en presencia o ausencia de ROS. Las respuestas GABAAρ1 se potenciaron significativamente en presencia de H2O2, en forma reversible y dosis dependiente. Los efectos potenciadores se atenuaron en presencia de un scavenger de radicales libres, ácido lipoico, y un inhibidor de la reacción de Fenton, deferoxamina. Para identificar los residuos involucrados en las acciones de las ROS se realizaron ensayos de protección química de cisteínas con agentes selectivos de sulfhidrilos y mutagénesis sitio dirigida. Cada subunidad ρ1 contiene solo tres residuos de cisteína, dos extracelulares en el Cys-loop (C177 y C191) y una intracelular (C364) en el bucle TM3-TM4. La sustitución de la C364 por alanina o serina generó receptores mutantes completamente insensibles a la potenciación por ROS. Las cisteínas del Cys-loop no resultaron esenciales para la modulación por ROS. Nuestros resultados muestran que las ROS potencian la función de los receptores de GABAAρ1 y que la cisteína intracelular C364 es el sensor para las acciones de ROS. Por otro lado, varios subtipos de receptores GABAA son modulados alostéricamente por benzodiazepinas (BZD), drogas ampliamente usadas como ansiolíticos, hipnóticos sedantes y anticonvulsivos. Se identificó un sitio de unión a BDZs de alta afinidad y al menos tres sitios adicionales de baja afinidad en variantes heteroméricos y homomericos de receptores GABAA. Sin embargo, nunca se había reportado la modulación de receptores GABAAρ1 por BDZs y durante mucho tiempo se los asumió como completamente insensibles. En el presente estudio, se expresaron heterólogamente receptores GABAAρ1 en oocitos y se registraron las respuestas evocadas por GABA en presencia y ausencia de BDZs. El diazepam y 4'-Cl diazepam modularon las respuestas GABAAρ1 en el rango micromolar de forma reversible, dependiente de la concentración e independiente del voltaje. El diazepam potenció las corrientes de Cl- evocadas por GABA y el 4'- Cl diazepam produjo efectos bifásicos dependiendo de la concentración de GABA, mientras que Ro15-4513 y alprazolam actuaron como moduladores negativos. Las acciones de las BDZs resultaron insensibles a flumazenil. Otras BZDs no mostraron actividad significativa en condiciones experimentales equivalentes. Nuestros resultados sugieren que las BZDs pueden modular la función del receptor GABAAρ1 de forma selectiva y diferencial.

Los xenobióticos, son compuestos de naturaleza química muy variada, que se encuentran en el medio ambiente de forma natural o surgen como resultado de la actividad humana. Los organismos vivos se encuentran constantemente expuestos a una gran variedad de estos compuestos, que al ingresar al organismo, se distribuyen en los distintos compartimentos pudiendo ser metabolizados y/o acumulados (Kovacic y Somanathan, 2009; Bhattacharya y Keating, 2011; Lima y col., 2011). Estos compuestos son generalmente apolares y lipofílicos, característica que les permite atravesar con facilidad las membranas biológicas, imposibilitando su excreción por orina o heces y acumulándose en tejidos grasos. Por esto, suelen sufrir procesos de biotransformación, o metabolización, generando metabolitos más hidrosolubles, que facilitan su eliminación. La biotransformación es definida entonces como la suma de todas las reacciones químicas que alteran la estructura, solubilidad en agua y eventual distribución de endo- y xenobióticos. Los organismos biológicos poseen sistemas enzimáticos que catalizan estos procesos de biotransformación que procuran disminuir la toxicidad global de los xenobióticos, aunque en algunos casos se generan intermediarios aún más tóxicos o activos (Martinez-Cabot y col., 2005; Zhou y col., 2007). Las reacciones de biotransformación han sido clasificadas en: reacciones de fase I (como aquellas catalizadas por el sistema de citocromo P450 -CYP-); y reacciones de fase II (catalizadas por familias de enzimas denominadas: glutation- S-transferasas -GST- y uridín-difosfo-glucuronosiltransferasa -UGT-, entre otras). Por otra parte, la magnitud de acumulación de una droga y/o sus metabolitos, en un determinado tejido, es frecuentemente limitada no tanto por su habilidad para entrar a la célula sino como su tendencia a dejarla. Esto está relacionado con los mecanismos de eflujo presentes en la membrana celular que juegan un rol crítico en limitar la absorción y acumulación de sustancias potencialmente tóxicas o de uso terapéutico, y que pueden conferir resistencia a esos compuestos. Se define entonces la fase III del metabolismo o la eliminación de endo- o xenobióticos y/o sus metabolitos, que está representada por los procesos de transporte. Los transportadores involucrados en los mecanismos de excreción de la fase III, son miembros de la familia de transportadores ABC que comprenden aquéllas proteínas denominadas MDR (del inglés: “multidrug resistance protein”, como P-glicoproteína, P-gp) y MRP (del inglés: “multidrug resistance-associated protein”, como la proteína asociada a resistencia a múltiples drogas 2, Mrp2), entre otros. Estos proveen una importante barrera contra la penetración de drogas y/o un eficiente mecanismo de eliminación (Mottino y col., 2000; Ayrton y Morgan, 2001; Chan y col., 2004). Luego del hígado, la mucosa gastrointestinal y la corteza renal son los tejidos más activos en la biotransformación y eliminación de compuestos tanto endógenos como exógenos (Rowland y Walter, 1983; Chhabra y Eastin, 1984). Si bien los sistemas de biotransformación y transportadores ABC se expresan diferencialmente en distintos tipos celulares (macrófagos, epitelios absortivos o secretores, etc.), esta expresión no es estática ya que las células tienen una remarcable capacidad para regular la cantidad de estas proteínas tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. El tratamiento con determinados compuestos es capaz de alterar la expresión y actividad de los mismos en distintos tejidos y con ello modificar su farmacocinética y biodisponibilidad, como así también la de drogas co-administradas que son también sus sustratos (Ibrahim y col., 2001). Por otra parte, la enfermedad de Chagas es una enfermedad endémica en América Latina, que afecta a 15 millones de personas (OMS, 2007, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/es/). En la Argentina y otros países endémicos, la única droga disponible para el tratamiento de la fase aguda de esta enfermedad es el benznidazol (BZL). Sin embargo, sus efectos tóxicos pueden llevar a suspender el tratamiento, con la consiguiente progresión de la enfermedad a la fase crónica. Además, uno de los mayores obstáculos en el éxito del tratamiento de enfermedades neoplásicas e infecciones por microorganismos o parásitos es el desarrollo de resistencia a multidrogas. Entre los mecanismos propuestos caben destacar la sobre-expresión y mayor actividad de sistemas enzimáticos de biotransformación de dichas drogas así como de proteínas transportadoras capaces de facilitar su excreción (o de sus metabolitos) (Catania y col., 2004). La resistencia a drogas tiene también un alto impacto en la quimioterapia de la enfermedad de Chagas, limitando las opciones al tratamiento e incrementando el número de tratamientos fallidos. Como antecedentes de nuestro grupo de trabajo, observamos que BZL induce la expresión y actividad de CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2 de manera dependiente de la concentración, en células HepG2 utilizadas como modelo de célula hepática (Rigalli y col., 2012). Sin embargo, hasta el presente no existe información concerniente a la expresión y actividad de sistemas de biotransformación y transportadores en un modelo in vivo y sus potenciales consecuencias en la farmacocinética de BZL o de drogas co-administradas. Por todo esto, en este trabajo de Tesis nos propusimos evaluar el impacto del pretratamiento con BZL (25; 50 y 100 mg/kg/día i.p., por 3 días consecutivos) sobre la expresión y actividad de proteínas involucradas en el metabolismo de Fase I (CYP3A), de Fase II (UGT1A, GSTs), eliminación (P-gp y Mrp2) y sobre la biodisponibilidad del propio BZL (evaluando la farmacocinética de una dosis testigo de BZL: 5 mg/kg, intraduodenal, pos-tratamiento). Observamos que el tratamiento con BZL incrementa el flujo biliar, sin alterar la velocidad de excreción biliar de glutation total ni GSSG, determinantes mayoritarios del flujo biliar independiente de sales biliares; permitiéndonos sugerir que el incremento observado en el flujo biliar podría deberse a la excreción biliar de metabolitos de BZL vía Mrp2 y/o P-gp. Además, las ratas tratadas con BZL presentan un leve aumento en los niveles de GPT sin alteraciones en la excreción biliar de bilirrubina, ni de niveles séricos de otras enzimas utilizadas como marcadores de daño hepático (LDH, FA, GOT). Al presente, poco es conocido sobre los efectos de BZL sobre los sistemas de biotransformación. En nuestro trabajo, el tratamiento con BZL produjo un aumento en la expresión de la familia de CYP3A (responsable de la primera etapa de biotransformación en hígado del 50 % de las drogas de uso clínico, Köhle y Bock, 2009), con un concomitante aumento en la actividad de CYP3A4. Por otro lado, mientras que la expresión de UGT1A no se vio alterada por BZL en ninguno de los tejidos analizados, observamos inducción de la expresión de GSTμ en hígado y GSTα en intestino, y de la actividad global, pudiendo ser un mecanismo compensatorio pre-sistémico contra derivados electrofílicos resultantes del metabolismo de BZL. Además de los sistemas de biotransformación, el incremento en la depuración de endo- y xenobióticos puede asociarse frecuentemente a altos niveles de expresión de proteínas transportadoras de eflujo, como P-gp y/o MRPs (Greiner y col., 1999; Fromm y col., 2000). Al evaluar el efecto de BZL sobre la expresión y actividad de P-gp y Mrp2, en órganos involucrados en la absorción y excreción de distintos fármacos que pudieran administrarse simultáneamente con BZL, observamos que el tratamiento de ratas Wistar macho adultas con BZL indujo un aumento en los niveles de expresión y actividad de ambos transportadores en hígado y yeyuno, no así en íleon ni en riñón. Estos resultados nos sugieren que la inducción de P-gp y Mrp2 en hígado, podría alterar la capacidad de excreción biliar de diversos compuestos y llevar a interacciones droga-droga a nivel hepático. Además, el sustancial incremento en los niveles de expresión y actividad de P-gp y Mrp2 observados en el intestino proximal podría llevar a un incremento en la secreción de sustancias presentes en la sangre o a una reducción de la absorción de drogas que son administradas oralmente, como el propio BZL. Estos resultados sugieren que bajo tratamiento con BZL, podrían ser observadas interacciones droga-droga, especialmente en los niveles de excreción, alterando las vías de depuración de compuestos endógenos y exógenos. El hecho de que el pre-tratamiento con BZL no haya producido alteraciones en la expresión de CYP3A, GST, P-gp y Mrp2 en riñón es desconocido, poniéndose en evidencia un efecto órgano-específico, mediado posiblemente por el receptor de pregnanos X, un receptor nuclear que regula la expresión tanto de enzimas de biotransformación de Fase I y Fase II como así también de transportadores de xenobióticos (Kliewer y col., 2002; Klaassen y Aleksunes, 2010;) y cuya expresión en riñón es baja en comparación con los otros tejidos (Kliewer y col., 1998). Adicionalmente, nos propusimos estudiar si las alteraciones en las proteínas transportadoras observadas podrían tener algún efecto sobre la biodisponibilidad de una dosis testigo de BZL (5 mg/kg) en ratas. Los parámetros farmacocinéticos de la dosis testigo de BZL calculados mostraron un aumento en la velocidad de eliminación plasmática (k) y una menor AUC plasmática en el grupo pre-tratado con BZL en comparación al grupo control, indicando un aumento en la depuración plasmática. Además, la Cmáx de BZL en plasma fue menor en los animales pre-tratados con BZL, sugiriendo una menor absorción intestinal de BZL. Cuando evaluamos la cantidad de BZL excretada por la vía biliar observamos un aumento significativo en este parámetro en animales pre-tratados con BZL en comparación a los animales controles. La cantidad de BZL excretada en orina fue similar entre ambos grupos experimentales, por lo sugerimos que el aumento en la depuración plasmática podría deberse al menos en parte debido a la vía biliar. Al observar además una disminución en la Cmáx alcanzada durante la administración de la dosis testigo de BZL en animales pre-tratados con BZL en comparación al grupo control, decidimos evaluar si la capacidad de absorción intestinal podría estar afectada estudiando el transporte intestinal seroso-mucoso de BZL mediante el modelo de saquitos intestinales. Los resultados obtenidos confirmaron nuestra hipótesis, dado que la velocidad de transporte de BZL desde el lado mucoso al lado seroso fueron menores en el grupo pre-tratado con BZL, que en el grupo control, a lo largo de todo el experimento. Este efecto fue revertido por el co-tratamiento con PSC833 (inhibidor específico de P-gp, análogo no inmunosupresivo de la ciclosporina A), indicando que P-gp podría estar mediando dicho efecto. Antecedentes previos de nuestro grupo de investigación, confirmaron la participación de P-gp en el eflujo de BZL en células (Rigalli y col., 2012). La información obtenida durante esta tesis sugiere la posibilidad de una disminución progresiva en la absorción de BZL y/o incremento en la metabolización/eliminación después de su administración terapéutica. Desafortunadamente, no encontramos evidencia en la literatura de esta posibilidad, o una conexión con la disminución en la eficacia terapéutica. Al presente, también se desconoce si podría existir una inducción de sistemas de biotransformación y transportadores en pacientes tratados con BZL. En conclusión, el incremento de la expresión y actividad de P-gp y Mrp2 en hígado y yeyuno proximal junto con el aumento en la expresión y actividad de CYP3A4 en hígado, y GST hepática e intestinal, debidas al pretratamiento con BZL, podrían dar lugar a la aparición de interacciones droga-droga con otros fármacos que pudieran ser co-administrados durante el tratamiento, pudiendo implicar principalmente sistemas involucrados en la depuración de compuestos endógenos y exógenos; así como modificar la farmacocinética del propio BZL, en pacientes tratados con BZL.