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Los objetivos principales de este trabajo de tesis doctoral fueron: aportar datos sobre i) la diversidad de hongos Trichomycetes en la República Argentina, ii) la resistencia de estos hongos frente a diferentes condiciones, iii) la transmisión del inóculo entre los individuos, iv) la variación de la presencia de estos hongos a lo largo del año en distintos ambientes, y v) la relación existente entre los hongos y sus hospedadores. Los estudios realizados sobre la diversidad de Trichomycetes principalmente en larvas de mosquitos, simúlidos y quironómidos, permitieron describir dentro del orden Harpellales, 5 nuevas especies (Austrosmittium sp. 1, Austrosmittium sp. 2, Smittium sp. 1, Smittium sp. 2 y Legeriomyces sp.) y reportar 12 especies que previamente habían sido descritas. Además, se citaron 4 especies que podrían representar nuevas especies de Trichomycetes, sin embargo el material recolectado fue insuficiente para realizar una diagnosis completa. A su vez, se registró la presencia de Amoebidium parasiticum y Paramoebidium sp., ambos pertenecientes al Orden Amoebidiales. En el presente estudio se relevaron diversas regiones de Argentina, abarcando las provincias de Buenos Aires, Córdoba, La Rioja, Neuquén y San Luis. De las especies que habían sido descritas previamente, algunas resultaron el primer registro para la República Argentina, e incluso algunas representaron el primer registro para la región Neotropical. Se evaluó bajo condiciones de laboratorio la resistencia de las tricosporas del harpélido Smittium culisetae, frente a diferentes condiciones de temperatura, pH y salinidad. Las tricosporas lograron resistir temperaturas entre -4 y 37ºC, sin perder la capacidad de infectar larvas. La viabilidad de las tricosporas que fueron expuestas a valores de pH entre 3.6 y 10 no se vio modificada, por lo que lograron resistir e infectar larvas luego de haber sido mantenidas bajo estas condiciones por más de 30 días. Las suspensiones de tricosporas a las que se le agregaron concentraciones de hasta 35 ppm de NaCl lograron resistir por más de 30 días. A su vez, las tricosporas lograron resistir durante el mismo período cuando fueron almacenadas en diluciones de agua marina de hasta el 50%. Sin embargo, las tricosporas que fueron sometidas a desecación no lograron resistir este efecto. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos, permitieron concluir que las tricosporas mantuvieron su capacidad de infectar larvas aún cuando fueron expuestas por varios meses a un amplio rango de estas condiciones, por lo que podrían resistir en el ambiente incluso en ausencia de los hospedadores. Sin embargo, estas esporas no fueron capaces de sobrevivir luego de que fueron sometidas a condiciones de deshidratación. Poco se conoce sobre la transmisión de estos hongos por parte de los hospedadores adultos. En los culícidos, se desconoce el mecanismo de transmisión de estos hongos, y no es sabido como pueden colonizar nuevos ambientes acuáticos. A pesar de haber evaluado algunas posibles vías de transmisión en hospedadores culícidos en laboratorio, no se ha podido dilucidar aún como ocurre este mecanismo en estos hospedadores. Solo se observaron unas pocas tricosporas en el tubo digestivo de hembras adultas de Ae. aegypti. Se evaluó la variación en la prevalencia de los hongos Harpellales a lo largo del año en diferentes ambientes. Los resultados obtenidos en este estudio, como así también los resultados obtenidos de los estudios realizados en el laboratorio sobre la resistencia de las tricosporas, permitieron demostrar que las condiciones ambientales tendrían poca influencia sobre la presencia de estos hongos. La deshidratación del ambiente tiene un efecto negativo sobre la viabilidad de estos hongos, por lo que luego de que un ambiente sufre desecación, debe ser colonizado nuevamente. Se comparó el tamaño y la fecundidad de las hembras adultas del culícido Ae. aegypti que fueron criadas a partir de larvas infectadas con el hongo Sm. culisetae, con respecto a hembras adultas que habían sido criadas libres de Trichomycetes. A su vez, se evaluó si las hembras criadas a partir de bajos niveles de alimento se veían beneficiadas por la presencia de Sm. culisetae. No existieron diferencias significativas en la fecundidad de las hembras adultas criadas en presencia o ausencia fúngica. De esta manera, se podría inferir que el hongo no le aporta ningún beneficio a las hembras de mosquitos criadas con bajos niveles de alimento, ya que estas tuvieron un tamaño menor, y por ende una menor fecundidad que las hembras criadas con altos niveles de alimento.

Los Inhibidores de Proteasas (IPs) son moléculas que se utilizan para el control y la regulación de la actividad de las proteasas. Los IPs constituyen importantes herramientas de la naturaleza para el control de la actividad proteolítica de sus proteasas blanco, así como su bloqueo en casos de actividad exacerbada y descontrolada. Se presentan en múltiples formas, en numerosos tejidos de animales, plantas y microorganismos. Los IPs participan en la prevención de la proteólisis no deseada y, por tanto, están involucrados en la mayoría de los procesos fisiológicos normales, al igual que en los procesos patológicos, debido a su implicación en la regulación de la actividad proteolítica, la activación de coenzimas y la liberación de polipéptidos biológicamente activos. El objetivo general de esta Tesis consiste en la búsqueda de nuevos inhibidores peptídicos de proteasas de origen vegetal, su aislamiento, purificación y caracterización cinética, proteómica, molecular y bioquímica, haciendo hincapié en la búsqueda de nuevas actividades biológicas tales como actividad antimicrobiana, antioxidante y anticoagulante, recientemente descubiertas para este tipo de moléculas. Adicionalmente se evaluó la actividad protectora de estos nuevos inhibidores frente al factor crecimiento epidérmico (EGF, de sus siglas en inglés Epidermal Growth Factor), con la finalidad de generar una disminución en la degradación de dicha molécula provocada por las proteasas mayoritarias presentes en las úlceras de pie diabético. En el Capítulo 1 se presenta una introducción general de los inhibidores peptídicos de proteasas, su naturaleza, abundancia y aplicaciones en el ámbito de la biotecnología y de la biomedicina. También se describe el objetivo general y los objetivos específicos de la Tesis. El Capítulo 2 se divide en dos grandes partes que abarcan prácticamente la totalidad de la Tesis. En la primera parte del Capítulo 2 se presenta el aislamiento y caracterización de un nuevo inhibidor de carboxipeptidasa A; proveniente de una variedad de papa andina (Solanum tuberosum subsp. andigenum cv. Imilla morada), el primer inhibidor clonado en esta especie, el cual fue expresado de forma recombinante y ensayado frente al EGF, encontrando resultados interesantes de actividad protectora (resultados que se presentan en el Capítulo 4). En la segunda parte del Capítulo 2, se presenta un nuevo inhibidor de carboxipeptidasa A, proveniente de morrón amarillo (Capsicum annuum L.), purificado mediante cromatografía de afinidad y caracterizado bioquímicamente, encontrando también resultados promisorios para investigaciones futuras teniendo en cuenta que este inhibidor (YBPCI) presenta una marcada estabilidad a elevadas temperaturas, a pHs extremos y a altas fuerzas salinas, así como también notable estabilidad bioquímica frente a ensayos de simulación gástrica in vitro (Capítulo 2 – Parte 2). En el Capítulo 3 se describe la purificación y caracterización bioquímica del primer inhibidor de papaína proveniente de Moringa oleifera, observándose interesantes actividades biológicas con aplicaciones medicinales, principalmente actividad anticoagulante y actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas. En el Capítulo 4 se desarrolla el análisis bioinformático de la estructura del EGF, con el fin de diseñar una estrategia de mutagénesis sitio-dirigida que permita la producción de un EGF mutante con resistencia a la proteólisis. Este capítulo se encuentra en etapa de investigación, ya que al haber hallado actividad protectora con el inhibidor de carboxipeptidasa aislado de papas andinas en el Capítulo 2 – Parte 1 (rimaPCI), la investigación fue desviada a la búsqueda de nuevos inhibidores que presenten dicha actividad. En el último capítulo, Capítulo 5, se presentan las conclusiones más relevantes obtenidas a lo largo de la Tesis. Se describen además, las líneas de investigación que se originan a partir de este trabajo de tesis doctoral y en las que deberían orientarse las investigaciones futuras de nuestro grupo.

Los Inhibidores de Proteasas (IPs) son moléculas que se utilizan para el control y la regulación de la actividad de las proteasas. Los IPs constituyen importantes herramientas de la naturaleza para el control de la actividad proteolítica de sus proteasas blanco, así como su bloqueo en casos de actividad exacerbada y descontrolada. Se presentan en múltiples formas, en numerosos tejidos de animales, plantas y microorganismos. Los IPs participan en la prevención de la proteólisis no deseada y, por tanto, están involucrados en la mayoría de los procesos fisiológicos normales, al igual que en los procesos patológicos, debido a su implicación en la regulación de la actividad proteolítica, la activación de coenzimas y la liberación de polipéptidos biológicamente activos. El objetivo general de esta Tesis consiste en la búsqueda de nuevos inhibidores peptídicos de proteasas de origen vegetal, su aislamiento, purificación y caracterización cinética, proteómica, molecular y bioquímica, haciendo hincapié en la búsqueda de nuevas actividades biológicas tales como actividad antimicrobiana, antioxidante y anticoagulante, recientemente descubiertas para este tipo de moléculas. Adicionalmente se evaluó la actividad protectora de estos nuevos inhibidores frente al factor crecimiento epidérmico (EGF, de sus siglas en inglés Epidermal Growth Factor), con la finalidad de generar una disminución en la degradación de dicha molécula provocada por las proteasas mayoritarias presentes en las úlceras de pie diabético. En el Capítulo 1 se presenta una introducción general de los inhibidores peptídicos de proteasas, su naturaleza, abundancia y aplicaciones en el ámbito de la biotecnología y de la biomedicina. También se describe el objetivo general y los objetivos específicos de la Tesis. El Capítulo 2 se divide en dos grandes partes que abarcan prácticamente la totalidad de la Tesis. En la primera parte del Capítulo 2 se presenta el aislamiento y caracterización de un nuevo inhibidor de carboxipeptidasa A; proveniente de una variedad de papa andina (Solanum tuberosum subsp. andigenum cv. Imilla morada), el primer inhibidor clonado en esta especie, el cual fue expresado de forma recombinante y ensayado frente al EGF, encontrando resultados interesantes de actividad protectora (resultados que se presentan en el Capítulo 4). En la segunda parte del Capítulo 2, se presenta un nuevo inhibidor de carboxipeptidasa A, proveniente de morrón amarillo (Capsicum annuum L.), purificado mediante cromatografía de afinidad y caracterizado bioquímicamente, encontrando también resultados promisorios para investigaciones futuras teniendo en cuenta que este inhibidor (YBPCI) presenta una marcada estabilidad a elevadas temperaturas, a pHs extremos y a altas fuerzas salinas, así como también notable estabilidad bioquímica frente a ensayos de simulación gástrica in vitro (Capítulo 2 – Parte 2). En el Capítulo 3 se describe la purificación y caracterización bioquímica del primer inhibidor de papaína proveniente de Moringa oleifera, observándose interesantes actividades biológicas con aplicaciones medicinales, principalmente actividad anticoagulante y actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas. En el Capítulo 4 se desarrolla el análisis bioinformático de la estructura del EGF, con el fin de diseñar una estrategia de mutagénesis sitio-dirigida que permita la producción de un EGF mutante con resistencia a la proteólisis. Este capítulo se encuentra en etapa de investigación, ya que al haber hallado actividad protectora con el inhibidor de carboxipeptidasa aislado de papas andinas en el Capítulo 2 – Parte 1 (rimaPCI), la investigación fue desviada a la búsqueda de nuevos inhibidores que presenten dicha actividad. En el último capítulo, Capítulo 5, se presentan las conclusiones más relevantes obtenidas a lo largo de la Tesis. Se describen además, las líneas de investigación que se originan a partir de este trabajo de tesis doctoral y en las que deberían orientarse las investigaciones futuras de nuestro grupo.

El estudio del transporte y la interacción de nanopartículas (NPs) con membranas biológicas es un aspecto relevante para su empleo en el campo de la nanomedicina, en diagnóstico de enfermedades y otras aplicaciones de la nanotecnología. La variedad enorme de diseños de NPs en cuanto a formas, tamaños y modificadores superficiales abre numerosas preguntas acerca de cómo es la interfase y cómo se modifican las membranas interactuando con las NPs en cuánto a posible formación de poros, defectos o fenómenos de permeación de agua o especies iónicas. Dentro de los diversos campos en los que se aplican actualmente conceptos de biomimetismo, son de gran interés los procesos y sistemas asociados con las membranas celulares. Estos sistemas tienen como base estructural la bicapa lipídica, la cual puede ser definida como una organización supramolecular consistente en un arreglo bidimensional de moléculas de fosfolípidos. Las bicapas de fosfolípidos pueden ser consideradas como sistemas modelo de las membranas celulares ya que preservan su fluidez bidimensional y pueden modificarse con proteínas de membrana, canales iónicos, receptores, transportadores y emplearse en numerosas aplicaciones en el campo de la biotecnología. Estos sistemas soportados se pueden caracterizar muy bien y constituyen el sustrato con el cual se estudiarán las interacciones con NPs, que por su parte deben ser sondas adecuadas para discutir los distintos aspectos de las interacciones que se pretenden dilucidar. Otro de los sistemas comúnmente empleados como sistemas modelo de biomembrana son las monocapas lipídicas que son películas que se obtienen mediante la deposición de las moléculas de los lípidos en una balanza de Langmuir donde es posible controlar tanto la organización y composición de la fase lipídica, como la de la subfase. De esta forma resultan particularmente útiles en el marco de la presente tesis ya que permiten investigar los distintos factores que intervienen en las interacciones NP-membrana. En este marco, este trabajo de Tesis se centra en el estudio de la interacción de nanopartículas de plata (AgNPs) recubiertas con citrato trisódico de sodio (CIT-AgNPs) y con ácido 4-mercaptobenzoico (MBA-AgNPs) con sistemas modelo de biomembrana constituidos por monocapas de Langmuir o bicapas soportadas del lípido dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC). La caracterización de las CIT-AgNPs y de las MBA-AgNPs, se realizó mediante Espectroscopia ultravioleta-visible(UV–Vis), Espectroscopia de Fluorescencia, Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS), Microscopía Electrónica de Transmisión de Alta Resolución (HRTEM), AFM y medida de su potencial zeta. Esta caracterización permitió conocer su tamaño, morfología, la naturaleza y estructura del recubrimiento superficial, las propiedades ópticas y las características de su carga superficial. Se realizaron estudios mediante XPS, HRTEM, técnicas electroquímicas y modelos teóricos de DFT de monocapas de MBA adsorbidas sobre superficies planas de Ag depositadas a subpotenciales sobre Au(111) para comprender la estructura superficial de las SAMs en los planos predominantes de las nanopartículas de Ag tal como son los de orientación (111). Para la construcción de sistemas biomiméticos se prepararon bicapas lipídicas de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) por fusión de vesículas sobre mica para estudiar la adsorción/inserción de las nanopartículas en las distintas regiones de la bicapa tales como bordes, defectos y zonas planas mediante microscopía de fuerzas atómicas (AFM). En el caso de usar como sistema modelo de biomembrana las monocapas soportadas de DMPC en balanza de Langmuir se buscó comprender el rol del orden/desorden de la monocapa en función de la presión lateral aplicada pudiendo cuantificar las interacciones de las nanopartículas en la subfase acuosa con la monocapas lipídicas a través de las isotermas de adsorción y las imágenes de microscopía de ángulo de Brewster (BAM). Los resultados obtenidos mostraron que las AgNPs exhibieron comportamientos distintos dependiendo de la naturaleza química del recubrimiento superficial y del ordenamiento de la capa de fosfolípidos. Se propone una explicación basada en la densidad de carga superficial y la naturaleza química del recubrimiento de las AgNPs.

El presente trabajo surge con el interés creciente en el estudio de las interacciones entre moléculas adsorbidas, la influencia que ejerce el adsorbente en ellas y la preocupación por caracterizar la superficie del mismo. Este último aspecto se ve plasmado en los esfuerzos realizados por la IUPAC (1,2) y organizaciones tanto europeas como americanas para lograr este propósito. Todos nuestros estudios se realizan sobre sistemas relativamente sencillos para reducir al mínimo el número de variables que afectan a las propiedades antes mencionadas. Este trabajo, que fuera comenzado hace varios años, y del cual ya se han publicado algunas conclusiones parciales, ha permitido resolver algunas cuestiones, pero al mismo tiempo se han planteado nuevas incógnitas que obligan a continuarlo, mejorando las técnicas experimentales a medida que se avance en el estudio y se requieran otros tipos de datos experimentales para verificar las conclusiones a las que se llegue.

Las nanopartículas (NPs) de metales nobles presentan gran interés tanto por sus propiedades básicas como por la amplia variedad de aplicaciones en las que se utilizan activamente. Para obtener NPs estables y evitar su aglomeración, es necesario utilizaragentes estabilizantes durante la síntesis. Estas moléculas se adsorben sobre la superficie de las NPs y evitan que estas interaccionen directamente con las partículas vecinas. Si bien existen diversas moléculas que pueden ser utilizadas para este fin, uno de los únicos tipos de NPs metálicas cuya distribución de tamaños es estrecha, son estables a lo largo del tiempo y pueden ser obtenidas en forma de polvo, lavadas, y utilizadas como si se tratase de un compuesto químico tradicional, son las NPs cubiertas por tioles. La gran estabilidad de estas partículas está dada por la alta energía del enlace que se forma entre el azufre del grupo tiol y el metal. Resulta, entonces, particularmente interesante estudiar la interfase entre la superficie metálica y las moléculas adsorbidas. En este trabajo se presenta un estudio de la interfase Au-tiol y Pd-tiol en diferentes sistemas que van desde monocapas autoensambladas (SAMs) de tioles sobre superficies planas hasta compuestos poliméricos de tiolatos metálicos, con especial énfasis en las NPs metálicas cubiertas por tioles. El estudio de estos sistemas fue realizado mediante la utilización de diversas técnicas. En todos los experimentos se controlaron las condiciones de medida de manera tal de minimizar los daños producidos sobre las muestras. En los casos en que esto no fue posible, se intentó elucidar qué tipo de daño se estaba produciendo para realizar el análisis de los resultados teniendo en cuenta estos efectos o bien descartar los datos que hayan sido afectados por los mismos.

Fil:Molina, Fernando Víctor. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Osella, Ana María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Saidman, Beatriz Ofelia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La accesibilidad web es un tema de connotación regional, nacional e internacional de relevancia social y cultural. La emergencia de diversas tecnologías disponibles desde la red de redes, se traduce en una necesidad de contemplarla particularmente en el diseño, desarrollo y mantenimiento de sitios web. Siendo la accesibilidad web un criterio de calidad del software, es de gran relevancia disponer y aplicar estándares y herramientas que permitan mensurar diferentes aspectos que aportan a este aspecto del software. Dado que la accesibilidad web se ha convertido en una preocupación debido a que incide directamente en la posibilidad de acceso de los ciudadanos a la información, comunicación y servicios. Este trabajo pretende ser un aporte para lograr mejoras desde la Ingeniería del Software, a este criterio presente en todos los espacios virtuales, especialmente en los destinados al desarrollo de actividades de enseñanza y de aprendizaje. La utilización de distintas herramientas ha proporcionado resultados coincidentes y diferentes en torno a las falencias detectadas. Lo expuesto indicaría la importancia del uso de varias herramientas para certificar la accesibilidad de un sitio web. Es decir, todas enriquecen la validación, aumentando la posibilidad de identificar errores que atentan contra el acceso igualitario al contenido web. Particularmente, la investigación realizada se refleja en un estudio que concentra una evaluación y análisis exhaustivos y completos considerando la AW en el código, el contenido. Los numerosos errores detectados requieren una urgente atención. Se ha comprobado que ninguna de las páginas validadas, cumplen con las pautas establecidas por el nivel de conformidad A, es decir, son inaccesibles para todos los usuarios. Así mismo, el elevado número de advertencias registradas implica una revisión manual, orientada a determinar si éstas constituyen un obstáculo de acceso al contenido web. La accesibilidad web requiere establecer un diseño y programación considerando las necesidades de todos los sujetos, además de asegurar una adecuada y permanente actualización del código para lograr la compatibilidad de las páginas con los software de usuario y las ayudas técnicas.