Catálogo de publicaciones

Las turberas fueguinas representan la concentración más austral de turberas en el mundo y se caracterizan por albergar comunidades de gran valor ecológico, como resultado de las condiciones climáticas y biogeográficas en las que se desarrollan. El conocimiento de la diversidad microfúngica en estos ambientes es escaso. Por lo tanto, la presente Tesis Doctoral tiene como objetivo principal caracterizar y analizar la composición y la diversidad de la comunidad de hongos microscópicos presentes en turberas compactas de Astelia-Donatia en situaciones geográficas disímiles, su vinculación con las variables ambientales, la profundidad y su importancia en la descomposición de la materia orgánica. Se determinaron y compararon rasgos físico-químicos de dichas turberas y se observó que los mismos resultaron similares. Ambas turberas están sometidas a las mismas condiciones de pH muy ácido (aprox. 4), bajas temperaturas (2-5°C) y acumulan turba con altos contenido hídrico y de carbono (más del 90%) y bajo contenido de nitrógeno (menos del 4%). Previo al abordaje de la diversidad, se evaluó la eficacia de tres metodologías clásicas de cultivo y aislamiento fúngico. Es así que la técnica de lavado de partículas de suelo mostró ser la más eficiente y adecuada para aislar microhongos presentes en muestras de turba. A partir de 80 muestras de turba, se obtuvieron 3.255 aislamientos fúngicos que correspondieron a 9 géneros (Aureobasidium, Beauveria, Botryosporum, Cladosporium, Mortierella, Mucor, Parasterinella, Penicillium, Trichoderma) y 19 especies de Hyphomycetes, representados principalmente por las Subdivisiones Ascomycotina y Zygomycotina; siendo mayor el número de Ascomycetes. Las especies más frecuentes fueron Aurebasidium pullulans, Beauveria bassiana, Mortierella alpina, Penicillium frequentans y Trichoderma viride. Con la implementación de metodologías moleculares se identificaron 30 micelios estériles que correspondieron a las especies Tolypocladium cylindrosporum, T. inflatum, Fusarium culmorum y un hongo perteneciente a la clase Leotiomycetes (ectomicorriza no cultivable), que al presentar requerimientos de cultivo diferentes no habían sido aisladas con las metodologías clásicas. La mayoría de las especies presentan una distribución geográfica muy amplia y corresponden a la microcarga normal de turberas y conforman una comunidad cuya estructura (riqueza) es simple, con una diversidad de nivel medio y presentan cierta homogeneidad con respecto su distribución. Es decir, que el número, tipo y frecuencia de especies no varió con respecto al tipo de sustrato, la profundidad de muestreo y la ubicación geográfica. Por otra parte, las muestras no presentaron un ordenamiento acorde a la composición de especies, discriminando según los tipos de sustrato y la temporada de muestreo. Sin embargo, los hongos microscópicos se organizan y responden a las variables ambientales, y si éstas se mantienen homogéneas y estables resulta probable que sus microorganismos asociados sigan la misma tendencia. Finalmente, se evaluó la habilidad degradativa de 4 microhongos más frecuentemente aislados y la influencia de la temperatura y el tipo de sustrato sobre esta actividad. Los resultados mostraron que las 4 cepas presentan una mayor habilidad para descomponer turba de Sphagnum con respecto a Astelia y esta actividad se incrementa con el aumento de la temperatura de incubación. Los resultados expuestos en este trabajo representan una gran base de información de los hongos microscópicos de turberas compactas de Astelia-Donatia, y además, generan nuevas posibilidades de investigación vinculadas con su funcionalidad en estos ambientes.

La babesiosis bovina es una enfermedad enzoótica causada por protozoarios Apicomplexa del género Babesia. En Argentina, esta enfermedad es provocada por B. bovis y B. bigemina, ambas trasmitidas por la garrapata Rhipicephalus microplus. La caracterización molecular de B. bigemina permitiría realizar estudios epidemiológicos, desarrollar pruebas para diagnóstico y sintetizar vacunas. En este trabajo se seleccionaron clones biológicos a partir de una cepa patógena y una cepa atenuada de B. bigemina, ambas adaptadas a la multiplicación continua in vitro, utilizando diluciones límite. Estos clones fueron útiles para establecer la constitución genética de aislamientos y cepas de referencia, comparar clones con diferente fenotipo de virulencia, evaluar marcadores moleculares, y caracterizar aislamientos silvestres. Se compararon los genes 18S rARN, rap1c y gp45 y las regiones intergénicas ITS y diferentes secuencias repetitivas en clones y cepas silvestres. El gen gp45 no pudo utilizarse debido a la falta detección en una cepa y las regiones ITS mostraron elevado polimorfismo. Sólo 3 ms y 1 MS permitieron diferenciar clones con diferentes genotipos. Estos marcadores permitieron agrupar clones y cepas por su fenotipo de virulencia. El análisis de las secuencias de los genes 18S rARN y rap1c de los clones biológicos, confirmó que ciertas subpoblaciones de Babesia prevalecen durante la adaptación in vitro. En conclusión, los clones y los marcadores moleculares seleccionados permitieron establecer la diversidad existente entre cepas obtenidas de diferentes regiones de Argentina y de otros países. Este trabajo establece la base para definir la importancia de la patogenia de B. bigemina en infecciones naturales.

La babesiosis bovina es una enfermedad enzoótica causada por protozoarios Apicomplexa del género Babesia. En Argentina, esta enfermedad es provocada por B. bovis y B. bigemina, ambas trasmitidas por la garrapata Rhipicephalus microplus. La caracterización molecular de B. bigemina permitiría realizar estudios epidemiológicos, desarrollar pruebas para diagnóstico y sintetizar vacunas. En este trabajo se seleccionaron clones biológicos a partir de una cepa patógena y una cepa atenuada de B. bigemina, ambas adaptadas a la multiplicación continua in vitro, utilizando diluciones límite. Estos clones fueron útiles para establecer la constitución genética de aislamientos y cepas de referencia, comparar clones con diferente fenotipo de virulencia, evaluar marcadores moleculares, y caracterizar aislamientos silvestres. Se compararon los genes 18S rARN, rap1c y gp45 y las regiones intergénicas ITS y diferentes secuencias repetitivas en clones y cepas silvestres. El gen gp45 no pudo utilizarse debido a la falta detección en una cepa y las regiones ITS mostraron elevado polimorfismo. Sólo 3 ms y 1 MS permitieron diferenciar clones con diferentes genotipos. Estos marcadores permitieron agrupar clones y cepas por su fenotipo de virulencia. El análisis de las secuencias de los genes 18S rARN y rap1c de los clones biológicos, confirmó que ciertas subpoblaciones de Babesia prevalecen durante la adaptación in vitro. En conclusión, los clones y los marcadores moleculares seleccionados permitieron establecer la diversidad existente entre cepas obtenidas de diferentes regiones de Argentina y de otros países. Este trabajo establece la base para definir la importancia de la patogenia de B. bigemina en infecciones naturales.

Tesis para obtener el grado de Magíster Scientiae en Manejo y Conservación de Recursos Naturales, de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en junio de 2004

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Laboratorio de Biología Molecular. Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional de San Luis -CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2014. 173 h. + CD. ils.; tabls.; maps; figs. Contiene Referencia Bibliográfica + Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

En esta tesis se estudian aspectos demográficos y los factores que determinan la abundancia de ratas (Ramis norvegicus) en un ambiente urbano y en granjas avícolas del Partido de Exaltación de la Cruz, Provincia de Buenos Aires, Argentina; así como su rol como potenciales hospedadores y transmisores de leptospirosis, triquinosis, salmonellosis y helmintos intestinales. Las granjas se caracterizan por presentar gran disponibilidad de alimento y refugio durante todo el año y a su vez sufren perturbaciones como la aplicación de rodenticidas. Se realizaron muestreos en 3 casas de la ciudad de Exaltación de la Cruz y 6 granjas avícolas por estación del año, desde la primavera de 1999 hasta el invierno de 2000 y desde la primavera de 1999 hasta el invierno de 2001, respectivamente. En cada ambiente se colocaron trampas jaula de captura viva cada 20 metros durante tres días consecutivos. Los roedores capturados fueron determinados específicamente, medidos, pesados y sexados. Posteriormente fueron sacrificados y se extrajeron distintos órganos para la detección de los distintos patógenos. Se analizó la asociación entre las abundancias de ratas con variables meteorológicas y con caracteristicas internas de las granjas, relacionadas con la disponibilidad de alimento, refugio y posibilidad de invasión desde zonas vecinas. La especie más capturada fue Ratlus norvegicus, detectándose en un 70% de las granjas avícolas y en un 16% de las casas urbanas. La variación de la abundancia de ratas no siguió un patrón estacional ni estuvo asociada a las características propias de las granjas evaluadas en este estudio. En las granjas avícolas se detectó reproducción y reclutamiento a lo largo de todo el año, actividad reproductiva a edades más tempranas y un mayor número de crías por camada que las citadas para otras poblaciones, lo cual implica un alto potencial de incremento poblacional. Sin embargo, habria un límite al crecimiento impuesto por el control que efectúa el hombre, el efecto de las precipitaciones y una posible densodependencia intrínseca de la población. Para obtener un control más exitoso habría que aplicar rodenticida en el 86% de las granjas en forma simultánea y bajo un asesoramiento técnico adecuado, debido que el conjunto de granjas podría estar actuando como una metapoblación donde se producen recolonizaciones por ratas en aquellas granjas sujetas a control por venenos desde las granjas no controladas. Con respecto a su rol como hospedador de patógenos, Ranus norvegicus no actuaría como hospedador de Trichinella spiralis ni Leprospira interrogans en la zona de estudio mientras que si lo sería de Salmonella Enteritidis y diversos helmintos intestinales.

La queratitis estromal herpética (QEH) es una patología que se presenta en felinos, humanos y ratones. Esta enfermedad muestra dos fases diferenciadas, una etapa temprana o viral y una tardía o inmunoinflamatoria. La QEH, al no ser tratada de manera adecuada conduce a ceguera corneal. El presente trabajo tiene como objetivo general evaluar y comparar la eficacia terapéutica de la ciclosporina A (Cs- A) y la rapamicina en las diferentes fases de la QEH. Para cumplir este objetivo, se utilizó un modelo de QEH en ratones a través de la inoculación corneal directa de Herpesvirus humano 1 (HSV-1) cepa KOS. La eficacia de los tratamientos se evaluó en la fase viral y en la fase inmunoinflamatoria a través de los cambios observados en el comportamiento viral, en las concentraciones de mediadores TNF-α, NF-KB, JNK y ERK relacionados con la respuesta inflamatoria local y los signos clínicos e histopatológicos más relevantes asociados a la enfermedad. La inmunosupresión en la primera fase provocó un aumento en la carga viral y se asoció a un incremento en los mediadores proinflamatorios. No se observaron cambios en el aspecto clínico e histopatológico de los animales comparados con el grupo control enfermo. Los resultados en la segunda fase demostraron que tanto la rapamicina como la Cs-A produjeron cambios favorables en la transparencia y disminución de la neovascularización de la córnea tanto en el aspecto clínico como en el histopatológico. Los resultados obtenidos en este trabajo permitirán continuar con diferentes ensayos destinados a establecer estrategias terapéuticas efectivas para la QEH.

La resistencia a los antibióticos se ve favorecida por el abuso y el mal uso de los antimicrobianos en medicina humana y animal. Los aceites esenciales son un gran recurso para hacer frente a esta problemática. Melaleuca armillaris pertenece a la familia Myrtaceae, rica en especies con aceites esenciales. Los extractos de plantas han demostrado actividad antimicrobiana en muchas investigaciones. Combinamos este aceite esencial (AE) con tres antibióticos diferentes para evaluar la interacción farmacodinámica establecida entre ellos frente a Staphylococcus aureus. Los antimicrobianos que utilizamos fueron Cloxacillina (CLOX), Rifaximina (RIF) y Eritromicina (ERI). El AE se obtuvo mediante destilación de arrastre de vapor de agua y su composición se analizó por GC–FID–MS. Los componentes más abundantes en el AE fueron 1.8 cineol (72.3%), limoneno (7.8%) y α-pineno (6%). Trabajamos con aislamientos de S. aureus de tipo salvaje (n = 6) de vacas Holstein portadoras de mastitis subclínica, una cepa de S. aureus (SARM) resistente a la meticilina proporcionada por el INEI-ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán" y S. aureus ATCC 29213 como cepa de referencia control. La concentración inhibitoria mínima (CIM) de CLOX, RIF, ERI, AE y de las combinaciones entre los anitimicrobianos y el AE se determinaron mediante microdilución en caldo a pH 7.4; 6.5 y 5.0. Se utilizó el método de tablero de damas para evaluar la interacción acontecida entre el AE y los antibióticos. Se estableció el índice de Concentración Fraccionaria Inhibitoria (CFI). De aquellas combinaciones que produjeron los valores más bajos de CFI, evaluamos el índice de actividad antibacteriana (E), establecido como la diferencia entre los valores Log10 del número de bacterias viables al inicio (nt0) y al final de la prueba (nt24). Para ello se construyeron curvas de muerte bacteriana para los antibióticos en forma individual, el AE y sus combinaciones a pH 7.4; 6.5 y 5.0 en concentraciones de 0.5, 1, 2, 4 y 8 veces la CIM. Consideramos efecto bacteriostático (E = 0), efecto bactericida (E = -3) y efecto de erradicación virtual de bacterias (E = -4). La CIM del AE a pH 7.4 fue de 25 μL/mL para la cepa control ATCC 29213 y 12.5 μL/mL para todas las cepas y aislamientos tipo salvaje analizadas. Estos valores disminuyeron con la acidez del medio en el orden de 2 y 4 veces. Se demostró una clara actividad sinérgica entre el AE y CLOX, permitiendo reducir la CIM del α-lactámico frente a S. aureus. Esta interacción se vio favorecida por la acidificación del medio, donde concentraciones menores de CLOX lograron un efecto bactericida, cercano a la erradicación virtual, en presencia de pequeñas cantidades de AE. La actividad sinérgica entre CLOX y AE fue particularmente importante frente a la cepa SARM. La RIF presentó una elevada actividad antimicrobiana (0.032 μg/mL) contra S. aureus independientemente de las condiciones de pH. Combinando RIF con AE, encontramos un efecto sinérgico en el que el antibiótico se potenciaba, particularmente a pH 5.0 (la CIM disminuyó 8 veces con 1.6 μL/mL de AE). Una mezcla de 0.004 μg/mL de RIF y 12.5 μL / mL de AE permite a pH 7.4 alcanzar un efecto de erradicación virtual (E = -4) frente a aislamientos de tipo salvaje. Algo similar ocurre con la cepa de referencia. La acidificación de los medios mejora la actividad AE/RIF. Así, concluimos que la RIF es un potente antibiótico contra S. aureus que no requiere el uso de adyuvantes. Sin embargo, estos resultados se presentan como muy promisorios para el tratamiento de infecciones estafilocócicas de difícil resolución, debido a la resistencia antimicrobiana de S. aureus a los antibióticos convencionales, donde las opciones de tratamiento son cada cez más limitadas. En el caso de ERI, la actividad disminuyó en medio ácido (la CIM se incrementó 16 veces), pero cuando se combinó con el AE, se mantuvo el nivel terapéutico del antibiótico frente a aislamientos de S. aureus sensibles. La combinación de AE con ERI redujo la CIM del antibiótico frente a todas las cepas y aislamientos y mostró un efecto sinérgico parcial con valores de CFI entre 0.5 y 1. Para los aislamientos resistentes, a pH 7.4, 25 μL/mL de AE redujeron la CIM de ERI 16 veces y a pH 5.0, 12.5 μL/mL disminuyeron la CIM más de 8 veces. Se obtuvieron resultados similares con los aislamientos salvajes y la cepa de referencia. Los AE pueden actuar como reguladores del metabolismo intermediario activando o bloqueando las reacciones enzimáticas a nivel ribosomal, o incluso cambiando las estructuras de la membrana. Por lo tanto, estos resultados indican el potencial modulador del AE de M. armillaris junto a ERI y pueden ser una alternativa interesante para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por S. aureus resistente.

En el presente Trabajo de Tesis, se diseñó e implementó un sistema experimental para estudiar la Emisión Acústica (EA) producida durante la deformación triaxial de probetas en forma de aros. Se construyeron todos los componentes necesarios para los ensayos. Se diseñaron y construyeron distintos tipos de probetas, cortadas transversalmente de tubos de acero microaleado sin costura, usados en la industria petrolera, a fin de inducir distintas fuentes de EA (deformación, creación y propagación de fisuras, rotura de la capa de óxido). Se caracterizaron química, mecánica y metalográficamente los materiales de las probetas ensayadas. Las superficies de rotura de los materiales empleados, fueron observadas en un microscopio electrónico de barrido (MEB), identificándose los distintos tipos de fractura. Se realizaron 22 ensayos, sirviendo los 10 primeros, para poner a punto todo el sistema de medición, eligiéndose los parámetros óptimos. Se logró caracterizar cada tipo de probeta por el comportamiento medio de los parámetros Amplitud, Duración y Risetime de las señales de EA, obteniéndose una clara separación en "clusters". Esto permitiría en ensayos en campo sobre tubos similares, hacer una identificación general de las posibles fuentes de EA. No se encontró un comportamiento temporal definido en la evolución de los parámetros de las señales de EA, a medida que avanzaba cada ensayo. Estadísticamente se demostró que dentro de cada tipo de probeta, los ensayos son réplicas entre sí. Se calcularon los coeficientes de correlación entre los tres parámetros de las señales de EA, para todos los ensayos, encontrándose la mayor correlación entre la Amplitud y la Duración. Para cada ensayo, se estudiaron estadísticamente las distribuciones de los parámetros Duración, Risetime y Amplitud. No encontrándose una única función de distribución que ajustase todos los histogramas experimentales de los dos primeros. En el caso de la Amplitud, primero, de acuerdo a la ley potencial, se obtuvieron valores del exponente comprendidos entre los citados en la literatura publicada. Luego, se encontró que una única función de distribución ajustaba todos los histogramas experimentales, dicha función fue la Log-normal, que ya aparecía citada en la literatura publicada. Buscando alguna explicación física al hecho anterior, se analizó primero la influencia del sistema de detección, demostrándose que el transductor piezoeléctrico de banda ancha empleado para recoger la EA producida, mantiene la linealidad entre la amplitud de los impulsos mecánicos incidentes en el sensor (deformación de la superficie del material) y la amplitud de las señales eléctricas salientes (Amplitud de las señales de EA). Luego, se demostró, teniendo en cuenta el comportamiento estadístico de los fenómenos físicos involucrados, que las amplitudes de las deformaciones dentro del material obedecen a una distribución Log-normal. Teniendo en cuenta la linealidad del sistema de registro de la EA, se concluyó que las Amplitudes de las señales de EA deben seguir la misma distribución Log-normal. Por último, se hacen algunos comentarios destinados a relacionar dos fenómenos que aunque ocurren a escalas muy diferentes, parecen responder a la misma dinámica, la E A a escala microscópica, y los terremotos a escala varios ordenes de magnitud mayor. Finalmente, se sugiere para estudios posteriores, la aplicación de los nuevos conceptos como criticalidad auto-organizada, fractales y ruido 1/f al fenómeno de la Emisión Acústica.

La señalización por insulina comprende una compleja cascada de eventos que llevan a la regulación del metabolismo de la glucosa y al crecimiento celular. Fallas en la respuesta a insulina conducen a diabetes mientras que en ciertos tipos de cáncer se encontraron aumentos en la actividad de esta vía se señalización. En mamíferos el gen del receptor de insulina (IR) adquirió un exón adicional junto con la capacidad de procesarlo alternativamente originando dos isoformas, IR-A e IR-B. En esta tesis se presenta el desarrollo de herramientas que permitieron visualizar procesos celulares in vivo por técnicas de microscopía. Esto permitió estudiar la endocitosis de las dos isoformas del IR en células individuales en respuesta a insulina y al factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-II). Una mayor internalización para el IR-A que para el IR-B en respuesta a ambos ligandos fue demostrada. Esto condujo a estudiar la señalización río abajo del receptor observando que la insulina desencadena una cascada mitogénica a través del IR-A y una predominantemente metabólica a través del IR-B. Cuando el estudio se extendió al IGF-II, pudo mostrarse que un mismo receptor sea mitogénico (IR-A) o metabólico (IR-B) se comporta diferente en respuesta a un ligando mitogénico (IGF-II) o metabólico (insulina). La existencia de los híbridos IR-A/IR-B en la membrana fue estudiada generando una quimera del IR capaz de ser modificada extracelularmente y que actúa como dominante negativo selectivo del efecto mitogénico. Esto permitió detectar los dímeros en membrana, analizar su formación y estudiar la señalización diferencial de cada isoforma. Por microscopía de fuerza atómica se midió la interacción molecular entre la insulina y cada IR mostrando que la misma es mayor para el IR-A. Se propone a la dinámica de internalización como el mecanismo responsable de la señalización diferencial de las dos isoformas del IR en respuesta a un mismo ligando. Se plantea un modelo de activación diferencial donde el IR-A se activa más y de forma más sostenida internalizándose más rápido, activando así la vía mitogénica desde los endosomas. Por otro lado, la isoforma B se internaliza de forma más lenta, permitiendo mayor señalización desde la membrana, reclutando moléculas efectoras de esta vía, gatillando la fosforilación de Akt, regulando la actividad de enzimas metabólicas.