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Los canales de calcio operados por voltaje tipo CaV2 presinápticos acoplan la despolarización de membrana al influjo de calcio, desencadenando la liberación de vesículas sinápticas que contienen neurotransmisores. Existen muchos mecanismos fisiológicos que controlan la actividad de los CaV2, siendo los receptores acoplados a proteína G (GPCR) uno de los más efectivos. Esta modulación ocurre mediante la alteración de la expresión, el tráfico o el funcionamiento de los CaV2 e impacta en la actividad neuronal. GHSR es un GPCR que posee una alta actividad constitutiva -independiente de la unión a ligando- la cual modula los CaV2 en un sistema de expresión heterólogo. A diferencia de la función fisiológica de su actividad evocada por ghrelina, el rol de su actividad constitutiva aún no se comprende completamente, debido a su naturaleza crónica y a la falta de agonistas inversos específicos. GHSR se encuentra ampliamente expresado en numerosos núcleos cerebrales con bajo acceso a la ghrelina plasmática como el hipocampo, donde se ha reportado que la aplicación de ghrelina exógena provoca distintos efectos, como la reorganización y el aumento de la densidad de espinas sinápticas, el incremento en la plasticidad a largo plazo y la neurogénesis. Así, en esta tesis postulamos que la modulación de los CaV2 por la actividad constitutiva de GHSR podría ser relevante en la neurotransmisión hipocampal. Nuestra estrategia experimental consistió en realizar registros de patch-clamp en configuración de célula entera en cultivos hipocampales primarios de embriones de 16-18 días de ratones C57BL6 salvajes y deficientes en GHSR, luego de manipular los niveles de expresión de GHSR mediante transducción lentiviral. Encontramos que la actividad constitutiva de GHSR reduce las corrientes nativas CaV2.1 y CaV2.2, siendo el CaV2.2 el subtipo más afectado. Luego, indagamos acerca del mecanismo por el que ocurre esta modulación mediante la coexpresión de versiones fluorescentes de los CaV2 y GHSR en un sistema de expresión heterólogo. Así, encontramos que la reducción de la corriente macroscópica conlleva una reducción de la densidad en membrana de CaV2.1 y CaV2.2, y además, demostramos que esta forma constitutiva de inhibición de los CaV por GHSR depende de la presencia de la subunidad auxiliar CaVβ. Este subconjunto de datos fue parte de dos trabajos publicados en colaboración con otros miembros de nuestro laboratorio. Al evaluar si la modulación de CaV2 por la actividad constitutiva de GHSR afecta la transmisión sináptica en el hipocampo, encontramos que ésta conduce a una disminución de la liberación del neurotransmisor inhibitorio GABA pero no de glutamato. Por otro lado, encontramos que GHSR no afecta la neurotransmisión inhibitoria o excitatoria independiente de los CaV ni la maquinaria de exocitosis de vesículas sinápticas. En base a nuestros resultados, postulamos que la selectividad del efecto de GHSR está vinculada con la mayor dependencia de la neurotransmisión GABAérgica del subtipo CaV2.2 respecto de CaV2.1. Esto es coincidente con varios estudios que reportan una mayor dependencia de la liberación de GABA con los CaV2.2, mientras que la neurotransmisión glutamatérgica depende en mayor medida de los CaV2.1. Para evaluar las consecuencias fisiológicas del efecto que observamos en neuronas en cultivo exploramos cómo afecta la actividad constitutiva de GHSR al circuito hipocampal intacto. El giro dentado es el punto de ingreso al circuito principal de la formación hipocampal, y funciona como un filtro fuertemente controlado mediante interneuronas locales. Observamos que la actividad constitutiva de GHSR reduce la transmisión GABAérgica local en el giro dentado en rebanadas horizontales de cerebro de ratón, mientas que no modifica la salida excitatoria del giro dentado a las neuronas piramidales de CA3. En resumen, en este trabajo de tesis doctoral estudiamos el efecto de la actividad constitutiva de GHSR sobre las corrientes CaV nativas y la transmisión sináptica en neuronas del hipocampo, un área con acceso restringido a ghrelina. El efecto de la actividad constitutiva de GHSR y su selectividad hacia la neurotransmisión GABAérgica dependiente de CaV2.2 podría tener importantes implicancias en los procesos fisiológicos que dependen del hipocampo como el aprendizaje y la memoria, en los cuales GABA ha ganado relevancia en los últimos años.

Se estudió la reacción de hidrólisis de la lactosa en conjunto con la concentración de proteínas en suero de quesería, empleando una preparación comercial de la enzima beta-galactosidasa inmovilizada sobre una membrana plana comercial de ultrafiltración. La inmovilización de la enzima permite su reutilización en un sistema continuo. Se seleccionó una membrana de ultrafiltración (polietersulfona, 10 kDa.) de semejantes características a las utilizadas en las industrias lácteas. Se estudiaron distintas condiciones de inmovilización covalente y multipuntual de la enzima en la membrana, en base a: concentración del agente activante (glutaraldehído) y agregado o no de inhibidores. Se establecieron las condiciones de inmovilización que mejor resultado mostraron en términos de actividad y estabilidad del biocatalizador. Se estudió la estabilidad térmica del biocatalizador ya que el proceso de concentración de proteínas de suero por UF se lleva a cabo a 55°C y la temperatura óptima de la enzima es 37°C. Se encontró que si bien la estabilidad del biocatalizador disminuye al alejarnos de la temperatura óptima, comparando los resultados con los de la enzima libre a 55°C, la estabilidad se incrementa considerablemente. A la enzima se caracterizó cinéticamente adoptando un modelo de reacción del tipo Michaelis-Menten con inhibición competitiva por producto. Se determinaron las constantes cinéticas. Se modeló la variación temporal del flujo de permeado, como así también la variación del flujo de permeado con la temperatura a diferentes presiones de trabajo.

A modo de resumen, los estudios realizados para definir la relevancia de los rafts lipídicos en el proceso de adhesión de B. pertussis a células epiteliales están descritos en el Capítulo 2, estos estudios indican que B. pertussis se adhiere a dominios lipídicos en un proceso dependiente de FHA. En el Capítulo 3 se describen los estudios realizados para evaluar la capacidad de B. pertussis para invadir y sobrevivir en células epiteliales respiratorias y el rol de los rafts en este proceso. Los estudios indican que B. pertussis ingresa a las células epiteliales por un mecanismo dependiente de rafts lipídicos, microtúbulos y la activación de tirosin quinasas. Un porcentaje de bacterias es capaz de sobrevivir en localización intracelular lo que sugiere que la invasión de células epiteliales podría constituir un mecanismo de evasión de la respuesta inmune. En el Capítulo 4 se describen los estudios realizados para caracterizar la interacción de B. pertussis con neutrófilos humanos en presencia y en ausencia de anticuerpos opsonizantes y el rol de los rafts lipídicos en la evasión de la respuesta inmune. Los estudios indican que bajo condiciones no opsonizantes B. pertussis es capturada y fagocitada a través de dominios rafts lo que determina que la bacteria sea transportada a compartimientos no lisosomales donde evade la acción bactericida de estas células inmunes. Por el contrario, la fagocitosis mediada por anticuerpos conlleva a la inactivación de la bacteria en compartimientos lisosomales poniendo énfasis en la importancia de la presencia de anticuerpos opsonizantes en el sitio de infección. En el Capítulo 5 se describen estudios que evalúan el tráfico intracelular de B. pertussis luego de ser fagocitada por los macrófagos humanos así como los mecanismos de sobrevida a largo plazo. Los estudios indican que bajo condiciones no opsonizantes B. pertussis no sólo es capaz de sobrevivir por varios días dentro de los macrófagos sino que es capaz de replicar en compartimientos con características de endosomas tempranos. A su vez, estos estudios indican que la presencia de anticuerpos opsonizantes es fundamental para prevenir la replicación intracelular. En el Capítulo 6 se presenta la Discusión General de este trabajo. En un Anexo de esta Tesis se presentan los estudios realizados para evaluar el rol de la variación antigénica en Prn, único antígeno presente en las actuales formulaciones vacunales que induce la producción de anticuerpos opsonizantes, en la evasión de las cepas circulantes a la respuesta inmune inducida por vacunación.

Fil:León, Marina Daniela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En esta tesis se realiza el estudio de las prácticas de recolección de vegetales silvestres que llevaron a cabo los grupos cazadores recolectores de la costa norte de Santa Cruz (CNSC) entre el Holoceno medio y tardío. El proyecto arqueológico de la CNSC es dirigido por la Dra. Alicia Castro y abarca el estudio arqueológico de las sociedades que habitaron el litoral marino en el norte de esta provincia. La escala espacial comprende de norte a sur, el límite interprovincial de Chubut y Santa Cruz hasta la localidad de bahía Laura. En sentido este-oeste abarca la franja litoral de costa propiamente dicha y hacia el interior un territorio de extensión variable que se ha denominado franja intermedia. Los resultados arqueológicos más relevantes del proyecto CNSC evidencian un aprovechamiento intensivo tanto del litoral marino como de sus recursos faunísticos, desde el Holoceno medio al tardío (Castro et al. 2003, Zubimendi et al. 2011). Se han registrado diferentes estrategias de uso del espacio por parte de estos grupos humanos en relación con los recursos que el sector en particular ofrecía (Zubimendi 2010). En este contexto, desde un enfoque paleoetnobotánico, se propone en la presente tesis analizar la interacción entre los grupos cazadores recolectores y las plantas a través de las prácticas de recolección. Estas últimas se definen a partir de la selección, obtención, gestión y consumo de plantas silvestres. Las hipótesis que guiaron esta investigación son: que las sociedades cazadoras recolectoras de la CNSC utilizaron y consumieron plantas silvestres. Asimismo, que en la interacción hombre-planta existieron criterios organolépticos, de las propiedades biofísicas de la madera, simbólicos y de disponibilidad que definieron la selección y recolección de plantas dentro de las sociedades cazadoras recolectoras de la CNSC. En este sentido que la recolección de vegetales silvestres se desarrolló en relación a otras estrategias de subsistencia y movilidad de los grupos que habitaron la CNSC. Por último, que estas sociedades desarrollaron procesamientos poscolecta de los vegetales a través de una tecnología adecuada. Para contrastar estas hipótesis se utilizó una aproximación holística y, por lo tanto se estudiaron distintas líneas de evidencias. En primer lugar, se recopilaron fuentes bibliográficas del siglo XVI al XXI, a partir de las cuales se extrajeron categorías referidas a las prácticas de recolección desarrolladas por los distintos grupos que habitaron Patagonia, los usos de las plantas, el procesamiento de las mismas y los agentes de recolección en el contexto histórico en el que se produjo esa información. Se realizaron entrevistas etnobotánicas a pobladores locales de la ciudad de Puerto Deseado y la localidad de Tellier. Dichas entrevistas fueron abiertas, semiestructuradas a través de las cuales se analizaron las dimensiones: prácticas de recolección, categorías de uso de plantas, sistemas de clasificación y transmisión de conocimiento. Se desarrolló la observación participante y colecta de ejemplares en las recorridas con tres informantes por las chacras y la ría Deseado. En tercer lugar, se recopilaron publicaciones científicas sobre el registro arqueobotánico de Patagonia continental argentina y se analizaron los resultados expuestos en ellas. En este sentido, se tuvo en cuenta la identificación taxonómica del resto recuperado, tipo de restos (macro o microvestigio), estado de conservación (i.e. seco, carbonizado), período temporal y ubicación espacial del hallazgo. Esta información permitió desarrollar criterios amplios para la elaboración de la colección de referencia. Esta última se presenta en dos secciones: una conformada por macrorrestos vegetales (tallo, hoja y frutos) en la que se desarrolla además un protocolo experimental de carbonización controlada para la interpretación de los restos antracológicos. La otra sección, presenta el material de referencia de microvestigios (tejidos de frutos, hojas y tallos). En relación a los macrorrestos vegetales, se identificaron partes leñosas y no leñosas de 10 sitios arqueológicos de tres sectores: Golfo San Jorge, Cabo Blanco y Punta Medanosa. Es importante mencionar que el registro arqueobotánico recuperado proviene de distintos tipos de sitios: alero, cueva, a cielo abierto y conchero. En relación a los procesamientos poscolecta, específicamente la molienda se analizaron publicaciones científicas de arqueología de Patagonia continental Argentina con menciones sobre estos instrumentos. Se extrajo la siguiente información: sitio, contexto, cronología, materia prima, existencia de análisis de adherencias, presencia /ausencia de microrestos y su identificación. Posteriormente se realizaron prospecciones asistemáticas sobre el sector sur de la ría Deseado donde se tomaron muestras in situ y se recuperó un artefacto de molienda que fue analizado en el laboratorio. De este último se tomaron muestras a través del raspado y pipeteado con agua desmineralizada. De la colección Museo del Hombre y su Entorno (Caleta Olivia) se analizaron cinco instrumentos a partir de la toma de muestras in situ. Los resultados obtenidos permitieron identificar que las familias con mayor cantidad de taxa utilizados y mencionados a través de las distintas líneas de investigación (i.e. fuentes documentales, etnobotánica, registro arqueobotánico de Patagonia y registro arqueobotánico de CNSC) fueron principalmente: Asteraceae y Fabaceae. En las fuentes documentales además de ambas familias se mencionaron con mayor frecuencia taxa de Apiaceae, mientras que en las entrevistas etnobotánicas también predominó Lamiaceae. En el registro arqueobotanico de Patagonia predominó, además de las anteriores, Poaceae y en el caso de CNSC, a través del registro antracológico, además de Asteraceae predominaron Anacardiaceae, Berberidaceae y Solanaceae. En cuanto a las categorías de uso, en las fuentes documentales el 35,4% de los taxa mencionados para un único fin correspondió a la categoría de uso alimenticia, el 22,2% respondió a medicinal y el 19,2% fueron plantas multipropósito. En relación a las entrevistas etnobotánicas para las localidades de Tellier y Puerto Deseado, el 47% de los taxa mencionados se clasifican en categorías de uso medicinal, mientras que el 27% combustible y el 15% multipropósito. Es notable la disminución de la categoría de uso alimenticia que respondería a la incorporación de dietas basadas en productos industriales y manufacturados. En el caso del registro arqueobotánico de Patagonia analizado desde de las publicaciones científicas existentes, se deduce que no es posible cuantificar la recuperación de taxa por categoría pero sí inferirlas: alimenticias, cestería, combustible, y artefactos en madera. En este caso es significativa la ausencia de la categoría medicinal. Para CNSC los macro y microrrestos recuperados permitieron obtener información acerca de usos relativos a la categorías combustible, alimenticia, artefactos en madera y posiblemente medicinal. La evidencia recuperada para CNSC, a partir de la identificación de 11 familias y 16 taxa: Adesmia, Atriplex/Suaeda, Berberis, Bulnesia, Chuquiraga, cf. Cercidium, cf. Grindelia, Colliguaja, Discaria, Ephedra, Lycium, Pinus, Prosopidastrum, Prosopis contrasta en forma positiva la hipótesis de que los cazadores recolectores utilizaron y consumieron plantas silvestres. Para el estudio de la interacción de los grupos cazadores recolectores y las plantas silvestres en CNSC, se generó un modelo a partir del cual se registraron criterios de selección de distintos grupos y poblaciones de Patagonia continental argentina (fuentes bibliográficas) y las entrevistas etnobotánicas de Tellier y Puerto Deseado. Se discutió el valor de la analogía y de qué manera podía ser utilizada en las inferencias del registro arqueológico. Se registraron los criterios de selección para las plantas silvestres en la esfera de precolecta y colecta que estarían asociados principalmente a las características organolépticas de las plantas (i.e. aroma, sabor, color y textura). En el caso de las plantas combustibles los criterios registrados en las entrevistas a pobladores locales fueron: facilidad para hacer brasa, duración de la brasa, poder calórico, facilidad para el encendido, producción de humo, disponibilidad de la especie. A través de los estudios anatómicos del registro antracológico, se observó que los leños de la estepa arbustiva del Golfo San Jorge presentaron por un lado, una producción de resinas y aceites esenciales que podrían haber funcionado como caracteres organolépticos para los grupos cazadores recolectores. Por otra parte los taxa con mayor densidad de carbones en los fogones y carbones dispersos fueron los de mayor dureza, capacidad de producción de brasa y duración de la misma (i.e. Schinus, Berberis ) así como también de rápido encendido (ricos en resinas) y corta duración (i.e. Senecio/Baccharis, Lycium). En otros casos por el contrario, los taxa seleccionados son característicos por su rápido consumo y producción de ceniza (i.e. Atriplex/Suaeda). Se considera posible inferir la selección de estos taxa a partir de las propiedades de las maderas y criterios organolépticos. También se concluyó que los taxa utilizados en los fuegos no variaban en relación al sitio alero, cueva, conchero o a cielo abierto sino que respondían a actividades específicas para las que fuera elaborado el fogón. Se discutió la funcionalidad de los fogones a partir de la termoalteración de restos malacológicos (i.e. sitio 112, Las Hormigas) y restos líticos (i.e. El Oriental), entre otros. Se discute a partir de los resultados antracológicos las estrategias de movilidad y subsistencia de los grupos cazadores recolectores del Holoceno medio y tardío, siendo utilizadas en todos los casos leñas disponibles alrededor de los sitios, pero que los taxa fueron seleccionados de acuerdo a la funcionalidad del fogón y de las actividades desarrolladas en los sitios. Es importante destacar la selección de la madera de Berberis para la confección de un artefacto de madera, fragmento de arpón, que fue recuperado junto a otros seis arpones en hueso. Hallazgos importantes para discutir la tecnología de captura de pinnípedos y peces (en el caso del arpón de madera) asociada a rompecráneos para el Holoceno tardío donde la costa fue habitada con mayor intensidad. También se registraron para CNSC artefactos potencialmente utilizados en el procesamiento poscolecta de recursos vegetales silvestres. La recuperación de microvestigios de dos de los instrumentos permitió la identificación de dos taxa Prosopidastrum globosum y aff. Prosopis, resultados que estimulan a ampliar la muestra analizada. Los resultados obtenidos permiten inferir que los grupos cazadores recolectores que habitaron la CNSC gestionaron los recursos vegetales silvestres durante el Holoceno medio y tardío.

En esta tesis se realiza el estudio de las prácticas de recolección de vegetales silvestres que llevaron a cabo los grupos cazadores recolectores de la costa norte de Santa Cruz (CNSC) entre el Holoceno medio y tardío. El proyecto arqueológico de la CNSC es dirigido por la Dra. Alicia Castro y abarca el estudio arqueológico de las sociedades que habitaron el litoral marino en el norte de esta provincia. La escala espacial comprende de norte a sur, el límite interprovincial de Chubut y Santa Cruz hasta la localidad de bahía Laura. En sentido este-oeste abarca la franja litoral de costa propiamente dicha y hacia el interior un territorio de extensión variable que se ha denominado franja intermedia. Los resultados arqueológicos más relevantes del proyecto CNSC evidencian un aprovechamiento intensivo tanto del litoral marino como de sus recursos faunísticos, desde el Holoceno medio al tardío (Castro et al. 2003, Zubimendi et al. 2011). Se han registrado diferentes estrategias de uso del espacio por parte de estos grupos humanos en relación con los recursos que el sector en particular ofrecía (Zubimendi 2010). En este contexto, desde un enfoque paleoetnobotánico, se propone en la presente tesis analizar la interacción entre los grupos cazadores recolectores y las plantas a través de las prácticas de recolección. Estas últimas se definen a partir de la selección, obtención, gestión y consumo de plantas silvestres. Las hipótesis que guiaron esta investigación son: que las sociedades cazadoras recolectoras de la CNSC utilizaron y consumieron plantas silvestres. Asimismo, que en la interacción hombre-planta existieron criterios organolépticos, de las propiedades biofísicas de la madera, simbólicos y de disponibilidad que definieron la selección y recolección de plantas dentro de las sociedades cazadoras recolectoras de la CNSC. En este sentido que la recolección de vegetales silvestres se desarrolló en relación a otras estrategias de subsistencia y movilidad de los grupos que habitaron la CNSC. Por último, que estas sociedades desarrollaron procesamientos poscolecta de los vegetales a través de una tecnología adecuada. Para contrastar estas hipótesis se utilizó una aproximación holística y, por lo tanto se estudiaron distintas líneas de evidencias. En primer lugar, se recopilaron fuentes bibliográficas del siglo XVI al XXI, a partir de las cuales se extrajeron categorías referidas a las prácticas de recolección desarrolladas por los distintos grupos que habitaron Patagonia, los usos de las plantas, el procesamiento de las mismas y los agentes de recolección en el contexto histórico en el que se produjo esa información. Se realizaron entrevistas etnobotánicas a pobladores locales de la ciudad de Puerto Deseado y la localidad de Tellier. Dichas entrevistas fueron abiertas, semiestructuradas a través de las cuales se analizaron las dimensiones: prácticas de recolección, categorías de uso de plantas, sistemas de clasificación y transmisión de conocimiento. Se desarrolló la observación participante y colecta de ejemplares en las recorridas con tres informantes por las chacras y la ría Deseado. En tercer lugar, se recopilaron publicaciones científicas sobre el registro arqueobotánico de Patagonia continental argentina y se analizaron los resultados expuestos en ellas. En este sentido, se tuvo en cuenta la identificación taxonómica del resto recuperado, tipo de restos (macro o microvestigio), estado de conservación (i.e. seco, carbonizado), período temporal y ubicación espacial del hallazgo. Esta información permitió desarrollar criterios amplios para la elaboración de la colección de referencia. Esta última se presenta en dos secciones: una conformada por macrorrestos vegetales (tallo, hoja y frutos) en la que se desarrolla además un protocolo experimental de carbonización controlada para la interpretación de los restos antracológicos. La otra sección, presenta el material de referencia de microvestigios (tejidos de frutos, hojas y tallos). En relación a los macrorrestos vegetales, se identificaron partes leñosas y no leñosas de 10 sitios arqueológicos de tres sectores: Golfo San Jorge, Cabo Blanco y Punta Medanosa. Es importante mencionar que el registro arqueobotánico recuperado proviene de distintos tipos de sitios: alero, cueva, a cielo abierto y conchero. En relación a los procesamientos poscolecta, específicamente la molienda se analizaron publicaciones científicas de arqueología de Patagonia continental Argentina con menciones sobre estos instrumentos. Se extrajo la siguiente información: sitio, contexto, cronología, materia prima, existencia de análisis de adherencias, presencia /ausencia de microrestos y su identificación. Posteriormente se realizaron prospecciones asistemáticas sobre el sector sur de la ría Deseado donde se tomaron muestras in situ y se recuperó un artefacto de molienda que fue analizado en el laboratorio. De este último se tomaron muestras a través del raspado y pipeteado con agua desmineralizada. De la colección Museo del Hombre y su Entorno (Caleta Olivia) se analizaron cinco instrumentos a partir de la toma de muestras in situ. Los resultados obtenidos permitieron identificar que las familias con mayor cantidad de taxa utilizados y mencionados a través de las distintas líneas de investigación (i.e. fuentes documentales, etnobotánica, registro arqueobotánico de Patagonia y registro arqueobotánico de CNSC) fueron principalmente: Asteraceae y Fabaceae. En las fuentes documentales además de ambas familias se mencionaron con mayor frecuencia taxa de Apiaceae, mientras que en las entrevistas etnobotánicas también predominó Lamiaceae. En el registro arqueobotanico de Patagonia predominó, además de las anteriores, Poaceae y en el caso de CNSC, a través del registro antracológico, además de Asteraceae predominaron Anacardiaceae, Berberidaceae y Solanaceae. En cuanto a las categorías de uso, en las fuentes documentales el 35,4% de los taxa mencionados para un único fin correspondió a la categoría de uso alimenticia, el 22,2% respondió a medicinal y el 19,2% fueron plantas multipropósito. En relación a las entrevistas etnobotánicas para las localidades de Tellier y Puerto Deseado, el 47% de los taxa mencionados se clasifican en categorías de uso medicinal, mientras que el 27% combustible y el 15% multipropósito. Es notable la disminución de la categoría de uso alimenticia que respondería a la incorporación de dietas basadas en productos industriales y manufacturados. En el caso del registro arqueobotánico de Patagonia analizado desde de las publicaciones científicas existentes, se deduce que no es posible cuantificar la recuperación de taxa por categoría pero sí inferirlas: alimenticias, cestería, combustible, y artefactos en madera. En este caso es significativa la ausencia de la categoría medicinal. Para CNSC los macro y microrrestos recuperados permitieron obtener información acerca de usos relativos a la categorías combustible, alimenticia, artefactos en madera y posiblemente medicinal. La evidencia recuperada para CNSC, a partir de la identificación de 11 familias y 16 taxa: Adesmia, Atriplex/Suaeda, Berberis, Bulnesia, Chuquiraga, cf. Cercidium, cf. Grindelia, Colliguaja, Discaria, Ephedra, Lycium, Pinus, Prosopidastrum, Prosopis contrasta en forma positiva la hipótesis de que los cazadores recolectores utilizaron y consumieron plantas silvestres. Para el estudio de la interacción de los grupos cazadores recolectores y las plantas silvestres en CNSC, se generó un modelo a partir del cual se registraron criterios de selección de distintos grupos y poblaciones de Patagonia continental argentina (fuentes bibliográficas) y las entrevistas etnobotánicas de Tellier y Puerto Deseado. Se discutió el valor de la analogía y de qué manera podía ser utilizada en las inferencias del registro arqueológico. Se registraron los criterios de selección para las plantas silvestres en la esfera de precolecta y colecta que estarían asociados principalmente a las características organolépticas de las plantas (i.e. aroma, sabor, color y textura). En el caso de las plantas combustibles los criterios registrados en las entrevistas a pobladores locales fueron: facilidad para hacer brasa, duración de la brasa, poder calórico, facilidad para el encendido, producción de humo, disponibilidad de la especie. A través de los estudios anatómicos del registro antracológico, se observó que los leños de la estepa arbustiva del Golfo San Jorge presentaron por un lado, una producción de resinas y aceites esenciales que podrían haber funcionado como caracteres organolépticos para los grupos cazadores recolectores. Por otra parte los taxa con mayor densidad de carbones en los fogones y carbones dispersos fueron los de mayor dureza, capacidad de producción de brasa y duración de la misma (i.e. Schinus, Berberis ) así como también de rápido encendido (ricos en resinas) y corta duración (i.e. Senecio/Baccharis, Lycium). En otros casos por el contrario, los taxa seleccionados son característicos por su rápido consumo y producción de ceniza (i.e. Atriplex/Suaeda). Se considera posible inferir la selección de estos taxa a partir de las propiedades de las maderas y criterios organolépticos. También se concluyó que los taxa utilizados en los fuegos no variaban en relación al sitio alero, cueva, conchero o a cielo abierto sino que respondían a actividades específicas para las que fuera elaborado el fogón. Se discutió la funcionalidad de los fogones a partir de la termoalteración de restos malacológicos (i.e. sitio 112, Las Hormigas) y restos líticos (i.e. El Oriental), entre otros. Se discute a partir de los resultados antracológicos las estrategias de movilidad y subsistencia de los grupos cazadores recolectores del Holoceno medio y tardío, siendo utilizadas en todos los casos leñas disponibles alrededor de los sitios, pero que los taxa fueron seleccionados de acuerdo a la funcionalidad del fogón y de las actividades desarrolladas en los sitios. Es importante destacar la selección de la madera de Berberis para la confección de un artefacto de madera, fragmento de arpón, que fue recuperado junto a otros seis arpones en hueso. Hallazgos importantes para discutir la tecnología de captura de pinnípedos y peces (en el caso del arpón de madera) asociada a rompecráneos para el Holoceno tardío donde la costa fue habitada con mayor intensidad. También se registraron para CNSC artefactos potencialmente utilizados en el procesamiento poscolecta de recursos vegetales silvestres. La recuperación de microvestigios de dos de los instrumentos permitió la identificación de dos taxa Prosopidastrum globosum y aff. Prosopis, resultados que estimulan a ampliar la muestra analizada. Los resultados obtenidos permiten inferir que los grupos cazadores recolectores que habitaron la CNSC gestionaron los recursos vegetales silvestres durante el Holoceno medio y tardío.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

Los bacteriófagos que infectan bacterias ácido lácticas (BAL) son el principal problema de fallas en la fermentación generando grandes pérdidas económicas. Lactobacillus casei resulta de especial interés porque además de contribuir con las propiedades organolépticas del producto final, muchas cepas presentan propiedades probióticas y son parte de productos comerciales. El uso de las mismas es el resultado de años de investigación que valida los supuestos beneficios en los alimentos. Debido a esto, la infección por fagos de estas cepas específicamente elegidas es perjudicial ya que no pueden ser reemplazadas con facilidad. En esta tesis estudiamos dos aspectos fundamentales de la relación fago-bacteria en Lactobacillus casei. Por un lado, la caracterización a nivel genómico y proteómico de los fagos Lactobacillus casei J-1 y PL-1 con particular énfasis en el aparato de reconocimiento del receptor o placa base a nivel estructural y funcional. Por otro, la presencia de profagos presentes en L. casei BL23 con el objetivo de evaluar el riesgo en la generación de fagos con capacidad infectiva en la industria láctea. Las placas base ubicadas en la punta de la cola son grandes complejos multiproteicos conformados por un ensambaje de seis proteínas distales de la cola (Dit), tres proteínas de la cola asociadas a lisinas (Tal) y un número variable de proteínas de unión al receptor (RBPs) que reconocen estructuras presentes en las envolturas bacterianas. Sin embargo, la secuenciación de los fagos J-1 y PL-1 ha mostrado que carecen de las canónicas RBPs. En su lugar, hemos demostrado que la Dit, hasta ahora sólo descripta como estructural, cumple un rol en el reconocimiento del receptor siendo la ramnosa al menos uno de los azúcares reconocidos por estos fagos. En la secuencia de Dit de J-1 y PL-1 existen dos inserciones ausentes en las “clásicas” Dits. La primera inserción presenta homología a módulos de unión a carbohidratos (CBMs, en este caso CBM1) mientras que para la segunda no se encontró similitud. La resolución de la estructura por rayos X de este dominio reveló un plegado similar a CBMs y se lo denominó CBM2. Con el objetivo de descifrar la función de estos módulos, se realizaron ensayos de unión a las bacterias y de inhibición de la adsorción que demostraron que el CBM2, pero no el CBM1, era el responsable del reconocimiento. Ensayos con el polisacárido de pared (CWPS) rico en ramnosa purificado de L. casei BL23 inhibieron la unión del CBM2 a las bacterias. La reconstrucción por microscopía electrónica de la placa base de los viriones enteros muestra que el CBM2 se encuentra en la periferia del complejo, óptimo para reconocer al CWPS. Análisis de secuencia revela que estas Dit evolucionadas están conservadas en fagos que infectan BAL. En resumen, estos resultados identifican a las Dit evolucionadas como los antireceptores en los fagos J-1 y PL-1. A su vez, generando nanoanticuerpos que reconocen al complejo Dit y la región N-terminal de Tal se mostró que uno de ellos bloquea la infección. Por otro lado, Tal tiene la capacidad de hidrolizar el peptidoglicano bacteriano que permitiría la inyección del ADN. Los fagos pueden encontrarse no solo en los sustratos usados como materia prima sino también como profagos en las propias cepas iniciadoras. La inducción de profagos y generación de virus con potencial de infectar otras cepas es un riesgo en la industria láctea. Hemos identificado 3 profagos completos (PLE1, PLE2, PLE3) en el genoma de L. casei BL23. Usando PCR cuantitativa, mostramos que 2 de ellos se inducen aunque con distintas cinéticas (PLE2 y PLE3). Según datos de secuenciación, microscopía electrónica y espectrometría de masa, al menos uno forma un virión potencialmente infectivo. Análisis estructural de las placas base de los profagos muestra nuevamente la presencia de CBMs en las proteínas Dit. Estos resultados resaltan la relevancia de los CBMs en las Dits evolucionadas en los primeros pasos de la infección y sugieren que deberían considerarse como dispositivos bona-fide de adhesión y no solo como proteínas meramente con función estructural como habían sido descriptas hasta hoy. El estudio del complejo multi-proteico involucrado en el reconocimiento al huésped y conservado en fagos que infectan cepas de BAL junto con el estudio de la inducción de profagos aporta datos de relevancia que podrían utilizarse para desarrollar estrategias anti-fágicas en la industria láctea.

El cultivo de soja [Glycine max (L.) Merr.] tiene una amplia difusión y ocupa el cuarto puesto en rendimiento a nivel mundial detrás del arroz, maíz y trigo; EE. UU. y Arg, son el primer y tercer productor mundial de soja en el mundo, respectivamente. Ambos países poseen una amplitud de ambientes diversos en cuanto a clima (precipitaciones, fotoperiodo, temperaturas, etc.) y suelo que permiten evaluar un gradiente importante de GM. Todos los años se evalúan en ensayos comparativos de rendimiento multi-ambientales (ECR) diversas variedades en distintos países alrededor del mundo. El objetivo de los ECR es no solo evaluar variedades sino también la identificación de mega-ambientes. Aunque el rendimiento de un genotipo es el resultado combinado de los efectos del G, el E y la interacción GE, solo G y GE son relevantes para la evaluación de las variedades y la identificación de mega-ambientes. En este trabajo se evaluaron en ECR en ambientes de EE. UU. y Arg. variedades de soja con un rango de madurez entre 3.7 a 4.9 durante dos campañas en cada país. En EE. UU. se agruparon las variedades en GM “cortos” (3.7 a 4.4) y otro GM llamado “largos” (4.2 a 4.9). En los ambientes de Arg. también se registraron las variables días a R1, días a R8, altura en R8 (cm), vuelco (escala) y peso de 1000 granos (gr). Los objetivos del trabajo fueron 1) estimar los componentes de variancia de G, E y GE para la variable rendimiento en grano, 2) mediante gráficos biplot GGE estudiar los efectos de G y e interacción GE y existencia de mega-ambientes entre ambos países, 3) identificar genotipos estables y con buena adaptación y 4) caracterizar los ambientes de Arg. y los genotipos utilizados mediante las variables fenotípicas evaluadas. Los resultados del análisis de variancia mostraron que para ambos grupos (“cortos “y “largos”) la magnitud de la interacción GE respecto a G no justifica dividir la región en estudio en distintos mega-ambientes. Los ambientes de Estados Unidos y de Argentina mostraron un patrón de heredabilidad similar, una correlación positiva y mega-ambientes comunes, permitiendo concluir que existen ambientes comunes para seleccionar variedades para ambos países para el rango de madurez empleado. Se identificaron genotipos estables y adaptados a la región. Los resultados obtenidos para caracterizar los genotipos en los ambientes de Arg. permitieron concluir que el comportamiento de las variedades con germoplasma seleccionado para los ambientes de EE. UU. se comportó de manera similar según su GM con variedades locales de Arg.

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causa la principal enfermedad que afecta al maíz en la Argentina. Su genoma consiste en diez segmentos de ARN de doble cadena (S1 a S10) que codifican para un total de trece proteínas. El virus es transmitido de manera persistente y propagativa por insectos de la familia Delphacidae. Luego de adquirir el virus, sólo una pequeña proporción de los insectos vectores pueden transmitir la enfermedad al alimentarse de plantas sanas. Se desconocen aún las bases moleculares de la transmisión de MRCV y en general de las funciones que las proteínas virales cumplen durante la infección. Para establecer si existe una correlación entre la acumulación viral y la transmisión, se desarrolló un protocolo útil para la cuantificación de MRCV u otros ARN endógenos en insectos individuales mediante RT‐qPCR. Se optimizaron los pasos a seguir desde el almacenamiento de muestras hasta la cuantificación viral. Debido a que la técnica de RT‐qPCR requiere la previa validación de controles internos invariables en los tratamientos a estudiar, se seleccionaron, clonaron y secuenciaron 7 genes de mantenimiento del delfácido transmisor Delphacodes kuscheli y se evaluó la estabilidad de su expresión durante la infección con MRCV. Se determinó que, de los 7 genes estudiados, el gen de la ubiquitina es el más establemente expresado y por lo tanto adecuado para ser utilizado como control interno de referencia. La plataforma desarrollada no sólo permitirá la cuantificación precisa del título de MRCV en individuos D. kuscheli, sino que además abre el camino a futuros estudios del cambio en la expresión de genes endógenos de los insectos infectados con MRCV. Esto permitirá aportar datos moleculares para lograr una compresión más integral de la interacción MRCV‐delfácido vector. En paralelo, se decidió estudiar la función que cumplen las proteínas de MRCV durante la replicación viral en el insecto expresándolas en células Sf9 (de insecto no hospedante) y se analizó su localización subcelular por inmunofluorescencia y en células vivas. Se determinó que tanto las proteínas estructurales P3, P4 y P8 como la proteína no estructural P7‐1, se distribuyen en el núcleo y el citoplasma celular. Dado que el tamaño de estas proteínas excede el límite permitido por el complejo del poro nuclear, los resultados sugieren que las mismas serían transportadas activamente al núcleo celular. Asimismo, se observó que la proteína P5‐2 se localiza exclusivamente en el núcleo. Es posible que estas proteínas de MRCV capaces de ingresar al núcleo celular jueguen un rol en la regulación transcripcional de las células del hospedante. Se observó que la proteína P5‐1 posee una distribución citoplasmática heterogénea de aspecto granuloso y que dicha distribución se torna homogénea en ausencia del tripéptido carboxilo terminal TKF, el cual es un presunto motivo de unión a proteínas PDZ o de importación a peroxisomas. Por otro lado, se determinó que P6 forma grandes cúmulos perinucleares amorfos y es capaz de relocalizar parte de la tubulina celular a éstas formaciones. Esto sugiere un posible rol para P6 en la formación del material fibrilar que se observa en células de insecto y planta infectadas con MRCV. La proteína P9‐2 fue capaz de localizar en la membrana plasmática e indujo la formación de filopodios membranosos en la superficie de las células, por lo que esta proteína podría estar involucrada en el transporte del virus a través de la membrana durante la infección del insecto vector. Por su lado, la proteína de cápside externa P10 fue capaz de localizar en el retículo endoplasmático y de colocalizar completamente con tubulina, sugiriendo que el MRCV explota el sistema de secreción y el citoesqueleto de tubulina para el ensamblado y/o transporte viral. Finalmente, P9‐1 fue capaz de formar inclusiones citoplasmáticas conspicuas similares a cuerpos de inclusión virales (VIBs) o viroplasmas. A continuación, se utilizaron algunas combinaciones de fusiones fluorescentes de proteínas del MRCV para analizar su colocalización subcelular. No se logró observar colocalización entre la proteína P9‐2 y P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 o P10. Tampoco se observó colocalización entre P9‐1 y P10 o P5‐2. Por otro lado, se determinó que P6 colocaliza con P10, P9‐1 y P7‐2, indicando que P6 podría cumplir algún rol en la formación del viroplasma y/o reclutamiento de otras proteínas a estas estructuras, así como en el movimiento intracelular de los viriones. Dado que la localización subcelular de P9‐1 es similar a la distribución característica de las proteínas mayoritarias de viroplasma de reovirus, decidimos estudiar más en profundidad sus propiedades funcionales y bioquímicas. Observamos que, al igual que otras proteínas mayoritarias de viroplasmas de reovirus, P9‐1 se auto asocia en complejos de alto peso molecular al ser expresada en bacterias, auto interacciona in vivo localizadamente en los cuerpos de inclusión que forma en células de insecto, tiene la capacidad de unir ácidos nucleicos de simple cadena, posee actividad ATPasa y alberga un dominio importante para la formación de cuerpos de inclusión en su mitad carboxilo terminal. Estos resultados indican que P9‐1 es el componente mayoritario de los viroplasmas y por lo tanto juega un rol fundamental en la replicación y ensamblado del MRCV en las células hospedantes.