Catálogo de publicaciones

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causa la principal enfermedad que afecta al maíz en la Argentina. Su genoma consiste en diez segmentos de ARN de doble cadena (S1 a S10) que codifican para un total de trece proteínas. El virus es transmitido de manera persistente y propagativa por insectos de la familia Delphacidae. Luego de adquirir el virus, sólo una pequeña proporción de los insectos vectores pueden transmitir la enfermedad al alimentarse de plantas sanas. Se desconocen aún las bases moleculares de la transmisión de MRCV y en general de las funciones que las proteínas virales cumplen durante la infección. Para establecer si existe una correlación entre la acumulación viral y la transmisión, se desarrolló un protocolo útil para la cuantificación de MRCV u otros ARN endógenos en insectos individuales mediante RT‐qPCR. Se optimizaron los pasos a seguir desde el almacenamiento de muestras hasta la cuantificación viral. Debido a que la técnica de RT‐qPCR requiere la previa validación de controles internos invariables en los tratamientos a estudiar, se seleccionaron, clonaron y secuenciaron 7 genes de mantenimiento del delfácido transmisor Delphacodes kuscheli y se evaluó la estabilidad de su expresión durante la infección con MRCV. Se determinó que, de los 7 genes estudiados, el gen de la ubiquitina es el más establemente expresado y por lo tanto adecuado para ser utilizado como control interno de referencia. La plataforma desarrollada no sólo permitirá la cuantificación precisa del título de MRCV en individuos D. kuscheli, sino que además abre el camino a futuros estudios del cambio en la expresión de genes endógenos de los insectos infectados con MRCV. Esto permitirá aportar datos moleculares para lograr una compresión más integral de la interacción MRCV‐delfácido vector. En paralelo, se decidió estudiar la función que cumplen las proteínas de MRCV durante la replicación viral en el insecto expresándolas en células Sf9 (de insecto no hospedante) y se analizó su localización subcelular por inmunofluorescencia y en células vivas. Se determinó que tanto las proteínas estructurales P3, P4 y P8 como la proteína no estructural P7‐1, se distribuyen en el núcleo y el citoplasma celular. Dado que el tamaño de estas proteínas excede el límite permitido por el complejo del poro nuclear, los resultados sugieren que las mismas serían transportadas activamente al núcleo celular. Asimismo, se observó que la proteína P5‐2 se localiza exclusivamente en el núcleo. Es posible que estas proteínas de MRCV capaces de ingresar al núcleo celular jueguen un rol en la regulación transcripcional de las células del hospedante. Se observó que la proteína P5‐1 posee una distribución citoplasmática heterogénea de aspecto granuloso y que dicha distribución se torna homogénea en ausencia del tripéptido carboxilo terminal TKF, el cual es un presunto motivo de unión a proteínas PDZ o de importación a peroxisomas. Por otro lado, se determinó que P6 forma grandes cúmulos perinucleares amorfos y es capaz de relocalizar parte de la tubulina celular a éstas formaciones. Esto sugiere un posible rol para P6 en la formación del material fibrilar que se observa en células de insecto y planta infectadas con MRCV. La proteína P9‐2 fue capaz de localizar en la membrana plasmática e indujo la formación de filopodios membranosos en la superficie de las células, por lo que esta proteína podría estar involucrada en el transporte del virus a través de la membrana durante la infección del insecto vector. Por su lado, la proteína de cápside externa P10 fue capaz de localizar en el retículo endoplasmático y de colocalizar completamente con tubulina, sugiriendo que el MRCV explota el sistema de secreción y el citoesqueleto de tubulina para el ensamblado y/o transporte viral. Finalmente, P9‐1 fue capaz de formar inclusiones citoplasmáticas conspicuas similares a cuerpos de inclusión virales (VIBs) o viroplasmas. A continuación, se utilizaron algunas combinaciones de fusiones fluorescentes de proteínas del MRCV para analizar su colocalización subcelular. No se logró observar colocalización entre la proteína P9‐2 y P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 o P10. Tampoco se observó colocalización entre P9‐1 y P10 o P5‐2. Por otro lado, se determinó que P6 colocaliza con P10, P9‐1 y P7‐2, indicando que P6 podría cumplir algún rol en la formación del viroplasma y/o reclutamiento de otras proteínas a estas estructuras, así como en el movimiento intracelular de los viriones. Dado que la localización subcelular de P9‐1 es similar a la distribución característica de las proteínas mayoritarias de viroplasma de reovirus, decidimos estudiar más en profundidad sus propiedades funcionales y bioquímicas. Observamos que, al igual que otras proteínas mayoritarias de viroplasmas de reovirus, P9‐1 se auto asocia en complejos de alto peso molecular al ser expresada en bacterias, auto interacciona in vivo localizadamente en los cuerpos de inclusión que forma en células de insecto, tiene la capacidad de unir ácidos nucleicos de simple cadena, posee actividad ATPasa y alberga un dominio importante para la formación de cuerpos de inclusión en su mitad carboxilo terminal. Estos resultados indican que P9‐1 es el componente mayoritario de los viroplasmas y por lo tanto juega un rol fundamental en la replicación y ensamblado del MRCV en las células hospedantes.

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad del maíz en nuestro país provocando grandes pérdidas económicas. El virus es transmitido por chicharritas de la familia Delphacidae e infecta además diversas gramíneas como trigo, cebada, avena y sorgo, dando lugar a síntomas severos. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de ARN doble cadena (ARNdc) que codifican para trece proteínas. Durante el ciclo de infección, el MRCV replica en cuerpos de inclusión citoplasmáticos virales denominados viroplasmas, y nuestro grupo demostró que están compuestos principalmente por la proteína no estructural P9-1 (Maroniche, 2011). Para otros reovirus se ha demostrado que los viroplasmas contienen además ARN viral y proteínas virales minoritarias junto con componentes celulares del hospedante. Con el fin de avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad en primer lugar se analizaron las interacciones de las proteínas del MRCV entre sí utilizando la técnica de doble híbrido de levaduras (Y2H). Se identificaron cuatro interacciones positivas: P6 con P6 y con P9-1, P9-1 con P9-1, y P9-2 con P9-2. Se definieron además las regiones de P6 y de P9-1 involucradas en las interacciones utilizando mutantes de deleción y se encontró que la región central de P6 con un posible dominio “coiled-coil” es necesaria para la interacción consigo misma y con P9-1, mientras que los últimos 24 residuos de P9-1 intervienen en la formación de dímeros de P9-1. Estos resultados, junto con resultados previos del grupo (Maroniche, 2011), permitieron postular a P6 como componente minoritario del viroplasma e indicaron que la región C-terminal de P9-1 sería necesaria para la formación del viroplasmas. Adicionalmente se evaluó la interacción de las proteínas virales P6, P7-2, P9-1, P9-2 y P10 con proteínas celulares que son candidatas a cumplir roles relevantes en la interacción MRCVhospedante. Ente otros resultados, se encontró que P7-2 interactúa con la proteína SKP1 (SPhase Kinase Associated Protein 1) componente del complejo E3 ligasa del sistema ubiquitinaproteasoma (UPS). Estos resultados son de gran relevancia ya que sugieren que P7-2 tiene la capacidad de interferir con el UPS. Para continuar con la caracterización de las proteínas virales P9-1 y P6 e identificar posibles componentes celulares asociados con los viroplasmas, se realizaron relevamientos de una biblioteca de ADN copia (ADNc) de hoja de trigo por Y2H. Se encontró que P9-1 es capaz de interactuar con una proteína con posible función de aldosa 1-epimerasa y otra con posible función de aciltransferasa. Por su parte, P6 mostró interacción con una posible tiorredoxina. Dado que las proteínas identificadas intervienen en el metabolismo de la planta, se postula que su interacción con proteínas virales podría estar asociada con la generación de síntomas. Finalmente se determinó que tanto P6 como P9-1 contienen potenciales motivos PEST de degradación vía proteasoma. Se construyeron mutantes sin estos motivos y se observó un incremento en los niveles de acumulación de P6 y P9-1 mutadas en plantas, sugiriendo que los PEST serían funcionales. Si bien aún resta comprender los mecanismos precisos que subyacen a las interacciones proteína-proteína encontradas en este trabajo de Tesis y sus consecuencias biológicas, estos resultados significan un importante avance en el conocimiento de la función y rol de las proteínas codificadas por el MRCV, en especial de P6 y P9-1.

En esta Tesis doctoral se profundizó en el estudio de la interacción lípido-receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) en dos aspectos: por un lado, el mecanismo de inhibición de ácidos grasos libres (AGLs), antagonistas no competitivos del AChR, y por el otro, la ubicación del AChR en dominios líquido-ordenados (Lo) condicionada por dos características particulares de la membrana. Con la finalidad de dilucidar el mecanismo de antagonismo de los AGLs sobre el AChR, se utilizaron AGLs con un doble enlace único en diferentes posiciones de una cadena acílica de 18 átomos de carbono. Estudios funcionales realizados con la técnica de patch-clamp han mostrado que solo el cis-6-18:1 y el cis-9-18:1 reducen la duración del estado de canal abierto del receptor, sugiriendo, por lo tanto, un mecanismo de bloqueo alostérico del canal. Mediante espectroscopía de fluorescencia se comprobó que todos los AGLs se ubican en la interfase lípido-AChR, quedando el cis-6-18:1 restringido a los sitios denominados sitios anulares, mientras que el resto de los AGLs ocupa también sitios no-anulares. Por otro lado, estudios de polarización de fluorescencia mostraron que el AGLs cis-9-18:1 es el que ocasiona el mayor desorden en la membrana. Se comprobó i) que todos los cis-AGLs generan cambios conformacionales del AChR a nivel transmembrana, ii) que los cis-9-18:1, cis-11-18:1 y cis-13-18:1 perturban al AChR en su estado de reposo e iii) que los cis-6-18:1 y cis-9-18:1 son los que causan una mayor perturbación del estado desensibilizado. De esta manera, la posición e isomería del ángulo de torsión de los AGLs insaturados serían un factor clave en el bloqueo del AChR, sugiriendo entonces que los AGLs con un único doble enlace y ubicados superficialmente en la membrana inhiben en forma directa la función del AChR, posiblemente al perturbar una secuencia aminoacídica transmembrana involucrada en los cambios alostéricos necesarios para la apertura del canal iónico. Se postula que en la membrana plasmática el AChR se encuentra en dominios lipídicos denominados ?balsas? (?rafts?). Sin embargo, el AChR no muestra preferencia por dominios Lo en sistemas modelo compuestos por esfingomielina (SM), colesterol (Col) y POPC (1:1:1), pero sí lo hace un segmento transmembrana (γM4) que exhibe mayor contacto con los lípidos. Es decir, su distribución no dependería exclusivamente de sus propiedades intrínsecas sino también de señales extrínsecas a la proteína. En este trabajo de Tesis se estudió la posible partición diferencial del AChR en los dominios Lo en dos sistemas modelo diferentes en función de: a) la presencia de diferentes especies puras de SM en la membrana, y b) la existencia de asimetría transbicapa en el sistema modelo, mediante el agregado de SM de cerebro (bSM) en la hemicapa externa. Tanto la existencia de asimetría como la presencia de 16:0-SM o 18:0-SM, en comparación con las bSM y 24:1-SM, producen una partición preferencial del AChR en los dominios Lo. De este modo, la localización del AChR en estos dominios depende no solo de sus propiedades sino también de las características propias de la membrana en la que se encuentra. Entender la interacción lípido-AChR es de gran importancia para determinar tratamientos que puedan mejorar o inhibir la función del AChR y tratar enfermedades que lo involucren.

La importancia del conocimiento de la estructura interfacial reside en el hecho de que en ella se producen los fenómenos de transferencia electroquímica y adsorción. La comprensión de estos últimos es de relevancia en áreas tales cinética electroquímica, coloides, corrosión, membranas biológicas, química física de componentes de suelos, etc. En el presente trebajo se estudia el fenómeno de adsorción iónica sobre mercurio en contacto con soluciones acuosas rnezcla de electrolitos. Los estudios sobre la adsorción se han realizado en su mayoría a partir de sistemas binarios 122, comprobándose para ellos un cumplimiento satisfactorio del modelo aceptado (Grahame-Stern-Gouy-Chapmam 28) para su interpretación 52 53. Los estudios sobre este fenómeno.apartir de mezclas de electrolitos se han realizado bajo la suposición, no comprobada para estos sistemas, de que el anión fluoruro no se adsorbe específicamente. Sin embargo, existen evidencias de que dicho anión muestra un comportamiento inverso al indicado, tanto en sistemas binarios 134 como en mezclas de electrolitos acuosos 79 156 , aunque en el último caso esto no ha sido determinado fehacientemente. Por otra parte, en general, las cantidades específicamnte adsorbidas, a carga sobre el metal constante, muestran diferencias cuando se comparan sistemas binarios con mezclas. En el estudio de la adsorción a partir de mezclas acuosas de electrolitos se presenta el problema de tener que regular dos variables de concentración independientes, y existe controversia a cerca de cual es el conjunto de estas más adecuado a utilizar en la isoterma de adsorción específica 134 129 125. Se han propuesto para estos casos la fuerza iónica y la molalidad de uno de los electrlitos, así como las actividades de las sales 115. En el presente trabajo se propone también la utilización de las actividades individuales de los aniones , ya que estos son los que se adsorben específicamente. Hasta el presente no ha sido publicado ningún estudio de la adsorción específica competitiva de aniones. El estudio de la adsorción a partir de mezclas de dos electrolitos acuosos en las que ambos aniones son capaces de adsorberse específicamente, permite investigar varios de los aspectos mencionados 9 130. Por esta razón, en el presente trabajo, se estudia la interfase mercurio- KCL(aq) + Kl (aq). En este caso ambos aniones presentan una adsorción específica elevada (fuerte), aunque en distinto grado, sobre dicho metal a partir de sus soluciones binarias individuales. También en las soluciones mezcla de estas sales es posible estimar los coeficientos de actividad iónica con bastante exactitud, lo cual permite analizar el sistema bajo distintas variables de concentración con el fin de intentar hallar la más adecuada. En el capítulo I se desarrollan los puntos teóricos referentes al tema en cuestión, en el II se detalla la parte experimental, en el III se presentan los resultados obtenidos y los cálculos realizados. El análisis de aquellos se realiza en el capítulo IV.

Las citoquinas pro-inflamatorias son inducidas en condiciones patológicas en el sistema nervioso central (SNC) en situaciones de trauma o infección, y se ha demostrado que son capaces de exacerbar y/o disminuir una lesión (Rothwell and Luheshi, 2000). Asimismo, son expresadas de manera constitutiva e inducible por las células del SNC y actúan fisiológicamente sobre las neuronas en el cerebro normal adulto, modulando la plasticidad sináptica, la transmisión sináptica, etc. (Vitkovic et al., 2000). El sistema de la interleuquina-l (IL-1) juega un rol decisivo en la respuesta inflamatoria. La expresión de sus ligandos (IL-1α, lL-1β e IL-1ra) y de sus receptores ha sido demostrada en varias regiones del SNC y bajo diversas condiciones (Rothwell and Luheshi, 2000). Otros trabajos han demostrado no sólo una variedad de efectos de la lL-1 en el cerebro o en neuronas y glia in vitro, sino que los resultados publicados hasta la fecha resultan muchas veces contradictorios, demostrando efectos opuestos en el mismo sistema de estudio. El objetivo general de esta tesis es estudiar de manera sistemática y profunda los roles fisiológicos y los efectos farmacológicos de la IL-1 en el cerebro. Para ello se investigó a la molécula en cuatro modelos diferentes en los cuales se estudiaron las respuestas de la glia, las citoquinas, la neurodegeneración y las variaciones en el comportamiento, de forma de obtener una visión global de la fisiología de la IL-1 en el SNC. (1) Observamos similitudes y diferencias regionales en la respuesta aguda a la IL-1β. Por ejemplo, detectamos reclutamiento de neutrófilos en todas las regiones inyectadas, pero neurodegeneración sólo en el giro dentado. (2) En un modelo en rata de la enfermedad de Parkinson observamos Ia activación atípica de la microglia en la región lesionada, con una regulación particular de la expresión de citoquinas. (3) Demostramos que la neurogénesis en el mesencéfalo no es un fenómeno fisiológicamente relevante. (4) Demostramos que la IL-1α endógena hipocampal tiene un rol modulador del aprendizaje aversivo. De esta manera, caracterizamos funciones y/o efectos de la IL-1 en el SNC, obteniendo evidencia empírica no sólo de funciones especificas de la IL-1 sino también de características más generales de la gliosis/inflamación en el SNC. Así, observamos que los efectos de la IL-1 dependen tanto de las concentraciones utilizadas como de la región que se está estudiando y, probablemente, de la densidad glial en la misma. Por ejemplo, observamos que la IL-1 endógena modula el aprendizaje, pero que, cuando se inoculan cantidades farmacológicas de la misma, causa degeneración en la misma región (hipocampo).

En líneas celulares de origen leucémico se han encontrado deleciones en el brazo corto del cromosoma 9, donde se localizan los genes del interferón de tipo I, lo que en un principio hizo suponer que el interferón se comportaba como un gen supresor de tumor. Se propuso ver si la producción de interferón estaba alterada en las leucemias linfoblásticas agudas (LLA), y si esas alteraciones génicas estarían relacionadas con la capacidad de producción de interferón a por las células malignas al ser inducidas con virus Sendai. Se determinó la capacidad de las células leucémicas de 21 pacientes de LLA, de la línea celular establecida K 562 y de dadores normales de producir interferón a "in vitro" al ser inducidos con virus Sendai con un priming de interferón α. La producción de interferón a por los blastos leucémicos y células normales fue muy variable oscilando entre 633 a 8850 pg/ml/5x10 6 células, no siendo estadísticamente significativo, tampoco se hallaron diferencias entre los subgrupos de LLA. En 4 de los 7 casos estudiados por Southern blot se pudo estudiar la producción de interferón α, presentando uno de ellos deleción de genes de interferón α. De las 21 leucemias en dos casos produjeron una cantidad de interferón α mínima. Esto sugiere que la malignidad en las LLA con baja producción de interferón α podría deberse a la pérdida de algún gen supresor de tumor. Se investigó la frecuencia y asociación de alteraciones del p 16, el interferón α y el interferón β en un total de 39 casos de LLA. De ellos, diez pacientes (25,6 %) presentaron anormalidades de al menos uno de los tres genes estudiados. Se encontró en un porcentaje del 13% deleciones en los genes del interferón α y β, así como también en los recientemente identificados genes supresores de tumor p15 y p16 (23%) los cuales se encuentran próximos a los genes el interferón. Estos datos indican que en las LLA, representando un cuarto de las LLA totales estudiadas el gen p16 está delecionado con mayor frecuencia que los genes de los interferones de tipo 1. Además de p16, el 37,5% está asociado con deleciones del interferón, sugiriendo una asociación entre ambas. Estos datos sugieren que la ausencia de p16, inhibidor de las ciclinas, podría modificar el ciclo celular normal y favorecer la transformación blástica. Su asociación con la deleción de los genes de los interferones de tipo I podría constituir eventos de la leucemogénesis. El porcentaje de deleciones, a su vez dependió del fenotipo de la célula leucémica, siendo mayor en los casos de LLA T que en aquellas precursoras B. Para un mejor tratamiento de la enfermedad es necesario partir de un buen diagnóstico, para lo cual se buscó detectar clonalidad, de tipo B o T por medio de la identificación de fragmentos reordenados, ya sea de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (clonalidad B) o de la cadena γ del receptor de los linfocitos T (clonalidad T). A su vez por medio de un mapeo de restricción se llegó a una correcta identificación del subtipo de reordenamiento Vγl en las LLA T. Esto cobra importancia, sobre todo para el seguimiento posterior de la enfermedad mínima residual, sin embargo no es suficiente para la determinación del linaje celular.

Los carbapenemes son potentes antibióticos β-lactámicos, reservados como drogas de último recurso para el tratamiento de infecciones severas o por parte de organismos resistentes. Desafortunadamente, la creciente prevalencia en las últimas dos décadas de organismos con resistencia a estas drogas, en particular de las Enterobacterias Resistentes a Carbapenemes (CRE), constituye una seria amenaza a la efectividad del uso terapéutico de los mismos. El principal mecanismo de resistencia a carbapenemes es la producción de carbapenemasas, β-lactamasas capaces de degradar el antibiótico e inactivarlo. De acuerdo a su mecanismo catalítico se distinguen dos tipo de estas enzimas: las serín-β-lactamasas que utilizan un residuo de serina en su sitio activo para formar un intermediario covalente con el antibiótico y luego hidrolizarlo, y las metalo-β-lactamasas (MBLs), que utilizan iones Zn(II) para posicionar el sustrato y generar el hidroxilo que actúa como nucleófilo, sin formación de un intermediario covalente. NDM-1 es una de las MBLs de relevancia clínica de más reciente aparición. Desde su identificación en el año 2008, se ha expandido con gran rapidez a nivel mundial, y ya ha sido detectada en más de 70 países. NDM-1 difiere de las demás enzimas de su clase debido a su localización celular: es una lipoproteína anclada a la cara interna de la membrana externa de organismos Gram-negativos, mientras que las demás MBLs caracterizadas son enzimas periplasmáticas solubles. Esta localización celular se debe a la presencia de una señal de lipidación denominada lipobox dentro del péptido líder de NDM-1, reconocida por un sistema biosíntesis de lipoproteínas altamente conservado en bacterias. Hasta el momento se han descripto 19 variantes naturales de NDM, las cuales difieren entre sí por un número reducido de mutaciones puntuales. La presencia de Zn(II) en el sitio activo de las MBLs es indispensable para su funcionamiento. El espacio periplasmático, donde actúan estas enzimas en Gramnegativos, carece de mecanismos capaces de mantener la homeostasis de este metal, por lo que el Zn(II) disponible para las MBLs se encuentra directamente ligado a su concentración extracelular. Esto adquiere importancia durante una infección, dado que el sistema inmune utiliza la respuesta de Inmunidad Nutricional para restringir la disponibilidad de Zn(II) y otros cationes metálicos para el patógeno invasor. Como parte de este mecanismo, los neutrófilos liberan en los sitios de infección grandes concentraciones de calprotectina (CP), una proteína capaz de quelar con alta afinidad Zn(II) y Mn(II). En el presente trabajo de tesis se estudió el efecto de la disponibilidad de Zn(II) sobre la capacidad de conferir resistencia de las MBLs. En particular, se evaluó el efecto del anclaje a membrana de NDM-1 sobre las propiedades de la enzima, haciendo foco en su tolerancia a baja disponibilidad de Zn(II). Además, se buscó evaluar qué características de la enzima se encuentran bajo presión de selección mediante un análisis comparativo de sus alelos clínicos. Para determinar el efecto de la disponibilidad de Zn(II) sobre la funcionalidad de las MBLs, se compararon las resistencias de células de E. coli productoras de las MBLs de mayor relevancia clínica (NDM-1, VIM-2, IMP-1 y SPM-1) en medio de crecimiento suplementado con distintas concentraciones del quelante ácido dipicolínico (DPA). Si bien la resistencia de todas las MBLs se vio reducida gradualmente por adición de cantidades crecientes de DPA, se observó que distintas MBLs presentaban distintos grados de susceptibilidad a la limitación de Zn(II). Se encontró además que la adición de quelantes al medio de crecimiento lleva a la degradación de las MBLs, debido a que las formas desprovistas de metal de las mismas son más sensibles a la proteólisis. Se construyeron mutantes solubles de NDM-1 para analizar cómo afecta el anclaje a membrana las propiedades de la enzima. Si bien estas variantes eran activas y brindaban niveles de resistencia similares a los de NDM-1 salvaje en medio rico, resultaban más sensibles a la reducción en los niveles de Zn(II) extracelulares, y eran degradadas más rápidamente que la enzima salvaje cuando perdían metal. Por lo tanto el anclaje a membrana en NDM-1 contribuye a la adaptación de la enzima a baja disponibilidad de Zn(II), incrementando su estabilidad frente a la proteólisis. La caracterización de los primeros 16 alelos clínicos de NDM-1 demostró que no existen diferencias importantes entre los mismos en cuanto a la resistencia que otorgan en medio de cultivo rico con elevada disponibilidad de Zn(II), en concordancia con reportes previos. Sin embargo, las propiedades de los alelos difieren marcadamente bajo limitación de Zn(II), y gran parte de ellos tienen mayor capacidad de conferir resistencia bajo estas condiciones respecto a NDM-1. Asimismo, muchos de los alelos presentan mayor estabilidad in vivo que NDM-1, observándose los mayores incrementos en esta propiedad a causa de las mutaciones A233V y E152K. Por otro lado, la mutación más frecuente entre los alelos, M154L, contribuye a la adaptación de la enzima a condiciones de baja disponibilidad de Zn(II) mediante el incremento en la afinidad de unión de este metal. Se comprobó también que la localización de NDM-1 en la membrana externa incrementa su secreción a OMVs respecto a las formas solubles de la enzima. Las OMVs (vesículas de membrana externa) son partículas esféricas formadas a partir de protrusiones de la membrana externa de Gram-negativos, que se escinden y liberan de la célula generando una vesícula cerrada rodeada de membrana externa y que contiene en su lumen componentes periplasmáticos. Las OMVs son producidas por todas las bacterias Gram-negativas, bajo todas las condiciones de crecimiento, y se encuentran asociadas a una amplia variedad de procesos tales como adquisición de nutrientes, formación de biofilms, comunicación celular, resistencia a antibióticos y patogénesis. Se encontró que las OMVs que transportan NDM-1 poseen actividad β-lactamasa, y que son capaces de proteger a células sensibles a antibióticos β-lactámicos de la acción de los mismos. Además, la caracterización de OMVs generadas por distintos aislamientos clínicos productores de NDM-1 demostró que estas vesículas pueden contener la enzima así como el gen codificante para la misma. Las OMVs por lo tanto podrían haber contribuido a la rápida diseminación de NDM-1 a nivel mundial.

Los endófitos colonizan asintomáticamente el interior de las plantas durante una parte o todo su ciclo de vida. Han sido encontrados en todas las especies vegetales estudiadas y en diferentes regiones climáticas del mundo, perteneciendo principalmente a especies fúngicas y bacterianas. Los endófitos pueden conferir beneficios a sus hospederos, como la protección frente a herbívoros y patógenos, adaptación a condiciones de estrés, promoción del crecimiento y activación de mecanismos de defensa. Los objetivos de este trabajo fueron: a) determinar las frecuencias de infección de los endófitos en plantas sanas de trigo y soja; b) analizar la existencia de variaciones cuali-cuantitativas en diferentes cultivares, diversos órganos, diferentes estadíos del ciclo fenológico y distintas campañas agrícolas; c) comparar la diversidad de las comunidades endófitas de ambos cultivos y d) evaluar la capacidad antagónica potencial de especies endófitas frente a Pyrenophora tritici-repentis y Macrophomina phaseolina, causantes de la mancha amarilla del trigo y de la podredumbre carbonosa de la soja, respectivamente. Para ello, se recolectaron muestras de plantas de trigo y soja de diferentes órganos, estadíos, cultivares y campañas agrícolas y se realizaron aislamientos en medio de cultivo artificial. Los endófitos aislados fueron identificados utilizando la metodología convencional sobre la base de sus características morfobiométricas y culturales. A fines de evaluar el potencial biocontrolador de los endófitos de cada hospedante se seleccionaron diferentes especies con los que se realizaron pruebas de antagonismo in vitro e in vivo. En trigo, las diferentes combinaciones -endófitos se confrontaron en ensayos en laboratorio (cultivos duales y test de germinación de esporas) y ensayos en invernáculo, evaluando la reducción de la severidad de la mancha amarilla en plántulas. En soja, las combinaciones M. phaseolina-endófitos fueron confrontadas en pruebas en laboratorio (cultivos duales y un bioensayo con semillas peleteadas con endófitos sembradas en medio de cultivo colonizado por M. phaseolina) e in vivo sembrando semillas peleteadas con endófitos en sustrato inoculado con el patógeno. Los resultados mostraron que el trigo y la soja hospedan comunidades conformadas por un gran número de especies fúngicas, cuya composición mostró depender del hospedante y de las condiciones ambientales. A su vez, las comunidades endofíticas mostraron una dinámica espacial, evidenciada en las variaciones cuali-cuantitativas en los órganos y una dinámica temporal, demostrada con las variaciones cuali-cuantitativas de las especies a lo largo de los ciclos fenológicos de ambos cultivos. La mayoría de las especies aisladas en ambos hospedantes pertenecieron al Phylum Ascomycota, distribuidas mayoritariamente en las clases Dothidiomycetes y Sordariomycetes. La comparación de las comunidades endofíticas de trigo y soja mostró que la riqueza específica en soja fue mayor, destacándose las hojas seguidas por los tallos para ambos hospedantes. Los índices de diversidad revelaron una tendencia hacia una distribución equitativa de las especies aunque algunas fueron más abundantes según el hospedante y el órgano. La mayoría de los endófitos de trigo evaluados por su potencial biocontrolador frente a P. tritici-repentis redujo su crecimiento en los cultivos duales en comparación con el testigo, destacándose el efecto de Trichoderma hamatum, Penicillium sp., Bacillus sp. y Paecilomyces lilacinus. A su vez, la mayoría de los endófitos ocasionó alteraciones morfológicas en los conidios y/o micelio del patógeno. Bacillus sp. y Fusarium sp., redujeron significativamente el porcentaje de germinación de esporas del patógeno en comparación con el testigo. En el ensayo de invernáculo, T. hamatum, Chaetomium globosum y Fusarium sp. redujeron la severidad de la mancha amarilla en las hojas evaluadas. Se destaca a T. hamatum por efecto en la reducción de P. tritici-repentis y en la reducción de los síntomas de la mancha amarilla y a Bacillus sp. que antagonizó al patógeno en los ensayos in vitro. Todos los endófitos evaluados por su potencial biocontrolador frente a M. phaseolina redujeron su crecimiento en cultivos duales en comparación con el testigo, destacándose T. aureoviride, T. harzianum, T. koningii, T. pseudokoningii y T. longibrachiatum, los que a su vez ocasionaron alteraciones en las hifas del patógeno. En las pruebas in vitro, se destaca el comportamiento de T. harzianum (V5) y las dos cepas de T. longibrachiatum por mejorar significativamente el porcentaje de semillas germinadas y el largo de radícula en comparación con el testigo enfermo. En los bioensayos in vivo todos los endófitos mostraron efectividad en la protección frente a M. phaseolina al reducir la sintomatología de la podredumbre carbonosa. Las dos cepas de T. longibrachiatum mostraron buen comportamiento antagónico frente a M. phaseolina, sin embargo evidenciaron variaciones según las pruebas. Se destaca el efecto de T. harzianum (V5) que mostró buen efecto antagónico en cultivos duales, los mayores porcentajes de germinación en las pruebas in vitro e in vivo y en la protección de las plántulas frente a M. phaseolina y en la protección frente al avance de la enfermedad desde la emergencia hasta los 21 días. El presente estudio aporta al conocimiento de las comunidades endófiticas asociadas al trigo y la soja en Argentina, su dinámica temporal y espacial. A su vez, se ha demostrado que endófitos aislados de estos hospedantes mostraron capacidad biocontroladora frente a P. tritici-repentis y M. phaseolina y en la reducción de la severidad de la mancha amarilla y la podredumbre carbonosa, respectivamente. Se destaca el efecto de T. hamatum frente a P. tritici-repentis y de T. harzianum frente a M. phaseolina. Los resultados promisorios obtenidos motivan la continuación de las investigaciones con miras a la inclusión de los endófitos como potenciales alternativas inocuas para el manejo integrado de ambas enfermedades.

Para conocer los cambios, que la edad produce en la microdureza de la dentina y su posible influencia sobre la instrumentación de los conductos radiculares, se realizaron dos experiencias: La primera consistió en analizar la dureza dentinaria en raíces distases y palatinas de primeros molares inferiores y superiores, de edades conocidas, divididas en tres grupos etarios: Jóvenes (20 a 30 años, Adultos (40 a 50 años) y Adultos Mayores (> de 60 años). La segunda consistió en evaluar mediante un mecanismo de censores conectado a un sistema computarizado, las fuerzas que durante el trabajo mecánico son generadas por limas convencionales de acero, de acero flexibles y un sistema rotatorio (Profile). La determinación de la microdureza se hizo sobre cortes transversales rizados a 2 mm del ápice (Nivel 1) y a 4 m de aquél (Nivel 2), en los que se establecieron tres zonas (periconducto, intermedia y vecina al cemento) en el espesor dentinario extendido entre el conducto y el cemento. Esta experiencia se dividió en dos estudios (A y B) según el indenter del micródurometro fuera accionado con una carga de penetración de 50 o 100 grs. En el Estudio 'A' comprobamos que una carga de 50 grs. era insuficiente, puesto que la elasticidad dentinaria rechazaba el indenter -fenómeno que denominamos 'efecto rebote'- produciendo improntas que no reflejaban la realidad. Por el contrario, los obtenidos con una carga de 100 grs. (Estudio 'B'), permitieron comprobar que: a) la edad sólo tendría una manifiesta influencia en dientes menores de 30 años, ya que en edades mayores, la dureza dentinaria entraría en un período de estabilidad, b) la dureza a nivel del ápice de la raíz distal mostró ser significativamente menor que la detectada en la palatina, c) las diferencias entre los Niveles 1 y 2 fueron muy evidentes, especialmente en la raíz distal, d) la dureza de la dentina del periconducto fue significativamente menor que en las restantes, cualquiera fuera la edad del diente y nivel de la raíz estudiados. En cuanto a las fuerzas que los instrumentos producen sobre la pared dentinaria, se comprobó que los manuales de acero de uso mostraban un evidente incremento a medida que aumentaba la edad, por el contrario, las producidas por el sistema mecanizado fueron constantes y muy similares en los tres grupos etarios, observándose además respecto a las anteriores, un marcado incremento cuando eran generadas por el movimiento de impulsión y rotación. Se concluye, que la microdureza dentinaria pareciera no experimentar con la edad un incremento regular en todas las piezas dentarias, como tampoco dentro de un mismo diente. Aumentaría en forma progresiva hasta los 30 años, para luego entrar en un estado de equilibrio. Los sectores menos duros y por ende más vulnerables -cualquiera sea la edad del diente-, se encuentran siempre a nivel apical y dentro de él, en el espesor dentinario que delimita al conducto. Por otra parte, el sistema Profile genera más fuerza y presión que los instrumentos manuales, especialmente en el movimiento de impulsión y de rotación.

En la primera parte de esta Tesis son presentados los resultados del estudio de la cinética de molienda, donde se investigan los efectos del tiempo de molienda sobre los parámetros estructurales e hiperfinos. En una segunda parte se presentan y discuten los resultados del efecto del contenido de Cu en las propiedades estructurares, hiperfinas y magnéticas de la aleación ternaria, empleando para ello las técnicas mencionadas a continuación. La información aportada por DRX permitió determinar las fases presentes, parámetros de red de la fase mayoritaria y el tamaño de cristalita, y cómo éstos evolucionaban al variar el contenido de Cu en las muestras. La posibilidad de realizar medidas de XAS en el Laboratorio Nacional de Luz Sincrotrón (LNLS) ubicado en Campinas, Brasil permitió conocer como se distribuían los átomos en la estructura fcc, es decir, si ésta era una distribución al azar o si existían regiones ricas en un material u otro, lo que podría suceder debido a las distintas entalpías de mezcla que poseen los elementos constituyentes entre si. Además de ésto se pudo determinar la variación de la distancia a primeros vecinos con la concentración de Cu, y estudiar si existía oxidación de los metales en la aleación. Los resultados de EM a temperatura ambiente brindaron información sobre el entorno atómico de los átomos de Fe, pudiendo de esta forma determinar, por medio de modelos de ajuste, parámetros que indiquen si existen gradientes de campo eléctrico producidos por una asimetría en la distribución de carga o desdoblamientos magnéticos debido a las fases con orden magnético presentes. La incorporación substitucional de los átomos de Cu en la estructura fcc-FeMn fue seguida mediante la evolución de los parámetros hiperfinos con el contenido de dicho aleante. Para completar el estudio hiperfino se realizaron medidas empleando un criógeno de ciclo cerrado de He en el rango de temperaturas entre 300 K y 21 K. Las temperaturas características obtenidas en cada caso fueron comparadas posteriormente con las correspondientes a las medidas magnéticas realizadas. La información obtenida mediante diversas técnicas de caracterización magnética, junto con distintos modelos en los que se estudian la evolución de los parámetros obtenidos, brindan un amplio panorama de la respuesta estructural y magnética del sistema.