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El objetivo de este estudio es contribuir a la preparación de Si₃N₄, mediante el estudio cinético del sistema Si-N₂, en escala de laboratorio. Este estudio permitirá predecir aspectos vinculados al diseño de reactores para la producción de Si₃N₄ con fines industriales. Por ello se intentará llegar al conocimiento de los mecanismos y parámetros cinéticos de las reacciones de formación de las fases α y β del Si₃N₄ , partiendo de los reactivos Si y N₂ en el rango de temperaturas de 1300°C a 1367°C. Se investigarán los mecanismos cinéticos que controlan dichas reacciones, calculándose para cada uno de ellos los valores de las constantes de velocidad, energías de activación y factores preexponenciaies. El conocimiento de los mecanismos y cinéticas de formación de las fases α -Si₃N₄ y β -Si₃N₄, permitirá predecir las condiciones operativas que favorecen el desarrollo de cada modificación. A través del control de estas reacciones será posible optimizar la microestructura del producto a fin de obtener buenas propiedades mecánicas en la confección de piezas.

Se decidió realizar este estudio por el hecho que no se tenía referencias hasta la fecha sobre si estaba en presencia de anticuerpos contra Neospora caninum los rodeos de la zona sur de la provincia de Mendoza y si se encontraban, en que cantidad y por ende si estaban produciendo daños en la producción regional. Se recolectaron, almacenaron y procesaron sueros de hembras bovinas en edad reproductiva provenientes la región descripta, teniendo en cuenta la población total de la zona, para la obtención de dicha muestra. Posteriormente se puso a punto la técnica de diagnóstico de Inmunofluorescencia Indirecta en el Laboratorio CEDIVE, para la detección de anticuerpos contra Neospora caninum, se comenzó con el procesamiento de los sueros en dicho laboratorio y se culmino en el Laboratorio de la Fundación Coprosamen y los resultados se detallan a continuación. Los resultados obtenidos en los 270 sueros (27 establecimientos) fue de 7 sueros positivos (7 establecimientos), esto nos daría un porcentaje de 1,85 % de los sueros procesados, y una prevalencia aparente del 25,9% en establecimientos. De considerarse solo las muestras procesadas con sueros frescos la prevalencia resultaría de 5 establecimientos de cada 7 (71,4%) y una general en animales de 5 cada 70 (7,1%). Si bien las diferencias entre las dos series muestreadas, podrían atribuirse a problemas de conservación de la primera, la prevalencia aparente en animales resulta en general, más baja que otras zonas del país. La baja prevalencia de la infección en animales de la zona estudiada podría estar asociada a lo extensivo de las explotaciones en las que las tasas de contacto para transmisiones horizontales son bajas.

Se estudió la expresión de integrinas en placentas porcinas de diferentes períodos gestacionales y su regulación por hormonas esteroideas y citoquinas. Se determinó integrinas por inmunoperoxidasa, concentración de progesterona por RIA, estrógenos por quimioluminiscencia e interferón-γ, IL-6, IL-12, IL-15 e IL-18 por ELISA. Las integrinas αvβ3 y β3 se encontraron en vellosidades y endometrio hacia los ±37 días, mientras que β1 expresó alta positividad desde los 37 días hasta el final de la preñez. Las glándulas uterinas fueron negativas a α3, mientras que las vellosidades expresaron marcaje durante la gestación. Se halló alta concentración de P4 a partir de los 60 días (45,6 ± 20,77 ng/ml) en homogenatos placentarios fetales hasta los 80 días, momento en que declina hasta el final de la preñez. También en estos extractos los E2 fueron significativamente más altos (41840 ±18724,07 pg/ml) que los hallados en homogenatos placentarios maternos (p<0,0001) al fin de la gestación. El IFN-γ, la IL-6 y la IL-12 mostraron un pico a los 32 días de gestación solo en los extractos fetales. Solo la IL-15 se mantuvo elevada durante la preñez, disminuyendo a término, lo que señalaría su probable regulación por la P4. La IL-18 se encontró en los extractos fetales a los ± 60-70 días de preñez. En conclusión, las integrinas acompañaron los aumentos de P4 registrados en los extractos placentarios fetales. La alta expresión de α3 en el trofoblasto acompañada de la baja expresión de αvβ3 y β1 al final de la gestación, formaría parte de las señales moleculares que permiten el desprendimiento de la placenta. Se sugiere que la IL-15 estimularía la síntesis de IgG, mientras que las IL-12, IL-15 e IL-18 en momentos puntuales de la gestación, como del IFN-γ, señalarían el rol del sistema inmune innato en la preñez porcina.

La determinación de la forma del arco inferior y la conformación del arco de trabajo es un factor preponderante en la mecánica ortodoncica como en la estabilidad post-tratamiento. Es importante comprender que ante las diferentes formas de arco que se pueden presentar, son insuficientes las formas en que se presentan los arcos preformados, siendo indispensable la necesidad de individualizar los arcos de acero para cada caso a tratar. La técnica desarrollada en este trabajo puede ser reproducida fácilmente y brinda al profesional una variada cantidad de formas diferentes de arco, esto es una ventaja sobre aquellos métodos que poseen unas pocas formas.

La presencia de agentes infecciosos en colonias de animales de laboratorio representa un serio problema en las investigaciones biomédicas. Algunos microorganismos patógenos pueden inducir signos clínicos o causar infecciones subclínicas. La presencia de estos agentes puede modificar parámetros fisiológicos y producir alteraciones significativas en los resultados experimentales. Entre los virus murinos presentes en colonias de ratones se destaca el Virus Diminuto del Ratón (MVM) perteneciente a la Familia Parvoviridae considerado un virus de alta prevalencia en colonias de ratones y un contaminante de algunos stock de virus y de tumores trasplantables. Como todos los parvovirus, la dependencia de la replicación del MVM por funciones moduladas por la proliferación, diferenciación y transformación celular indica que el virus requiere de células en división para replicarse. La misma se produce en diversos órganos como el páncreas, intestino delgado, órganos linfoides, hígado y riñones. Este virus se libera y transmite a través de las heces y la orina, donde puede persistir durante varias semanas. Los animales sanos se infectan al ponerse en contacto con el animal enfermo o con sus heces y orina. El virus ingresa por vía oronasal para luego diseminarse. La signología clínica se manifiesta diferente en animales inmunocompetentes y en inmunodeficientes. En general, en los primeros no se manifiesta la enfermedad clínica a menos que estén sometidos a un estrés, mientras que en los segundos es más frecuente observar alteraciones en su comportamiento y en su anatomofisiología. También puede reducir la tasa de crecimiento tumoral directamente o impedir su desarrollo (oncólisis), altera la modulación de la respuesta inmune de las células tumorales, interfiere con la selección de nuevos trasplantes y provoca una reducción química de los tumores. Por todas estas razones, el desarrollo de técnicas de diagnóstico sensibles y precisas permite conocer la eficiencia de los sistemas de barreras sanitarias instaladas en las colonias, obtener datos más representativos de la prevalencia de este virus con el fin de conocer la magnitud de la infección y poner en práctica las medidas de control adecuadas. Actualmente el diagnostico de MVM se realiza a través de la detección serológica de anticuerpos antivirales en el huésped o por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de muestras de suero, órganos o heces. La prueba de inhibición de la hemaglutinación (IHA) fue la primera técnica utilizada para la detección de anticuerpos (Ac) pero se requiere de grandes cantidades de antígeno viral. Más recientemente, las dos técnicas serológicas más usadas son la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y el inmunoensayo enzimático (ELISA). La técnica de IFI es una prueba fácil de realizar para un pequeño tamaño en las muestras de suero mientras que ELISA es una técnica automatizada alternativa, sensible y específica comúnmente utilizada para un gran número de muestras.El diagnóstico del parvovirus del ratón (MPV) aislado en los últimos años, que también debe estar ausente en ratones utilizados en experimentación, puso en perspectiva los resultados serológicos positivos contra MVM debido a que en la mayoría de la técnicas serológicas presenta reacción cruzada con MVM, siendo necesario contar con técnicas complementarias que permitan discriminar ambos virus. El objetivo de este trabajo es determinar la prevalencia de infecciones por MVM en colonias de ratones de Argentina y estudiar la influencia de este virus en la contaminación de tumores transplantables. Para lograr estos objetivos se procederá a estandarizar una técnica de ELISA para la detección de Ac contra MVM, a determinar la prevalencia de MVM en colonias de ratones en Argentina a través de la comparación de las técnicas de ELISA e IFI, a desarrollar una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de ADN viral de MVM y MPV que permita discriminar los resultados serológicos de ELISA e IFI en ratones provenientes de diferentes colonias y a estudiar la detección e interferencia de la contaminación por MVM en tumores transplantables en ratones.

La dependencia con la temperatura de la fracción de neutros de Ga+ dispersados por una superficie de oro, sumado al carácter no magnético del ion, han inducido a depreciar cualquier efecto de correlación electrónica en el intercambio decarga entre el ion y la superficie durante el proceso de colisión. En este trabajo se muestra que, al contrario de esta suposición, la interacción electrón-electrón en el ion resulta crucial para describir los resultados experimentales. Se realizan tres cálculos diferentes en relación al tratamiento de la correlación electrónica en el marco del modelo de Anderson: un modelo simple sin interacción, una aproximación considerando la fluctuación de espín para los orbitales tratados independientemente, y el cálculo más completo considerando las seis configuraciones posibles para el Ga neutro tratadas de manera correlacionada. A través de un estudio comparativo, se infiere la importancia de los efectos de correlación en el intercambio de carga. Se encuentra que la fracción de neutros medida no puede ser descripta teóricamente, sin incluir interacciones electrón-electrón. Incluir las seis configuraciones espín-orbital como posibles canales de neutralización resulta esencial para una descripción adecuada de la neutralización de iones Ga+ dispersados por una superficie de oro. A través de un análisis de los sistemas Ga/Ag e In/Au, se reafirma que la proximidad de los niveles de un electrón del proyectil al nivel de Fermi de la superficie es un factor determinante de la influencia de la correlación electrónica en la fracción de neutros y su dependencia con la temperatura.

El presente trabajo de tesis realizado en un modelo celular tuvo como finalidad la comprobación de la hipótesis de que el hinchamiento hipotónico promueve la liberación de Óxido Nítrico (NO). Utilizando miocitos cardíacos de rata demostramos, a partir de la medición de la fluorescencia de DAF-FM, que el hinchamiento hipotónico promueve la liberación de NO. La utilización de inhibidores como L-NAME (inhibidor inespecífico de las NOS), nitroguanidina (inhibidor especifico de nNOS), wortmanina (inhibidor de eNOS) y rianodina+ácido ciclopiazónico (inhibidores de la función del retículo sarcoplasmático (RS)), y a través del uso de una maniobra no farmacológica que consistió en realizar los experimentos en miocitos de ratones que tienen delecionado funcionalmente el gen NOS1 para la nNOS (NOS1KO) pudimos comprobar que la isoforma responsable en la producción de NO durante el hinchamiento hipotónico era la nNOS ubicada en el RS. Luego, con el objetivo de evaluar los mecanismos por los que se traducía la deformación de la membrana plasmática en la activación de la nNOS durante el hinchamiento hipotónico, evaluamos la fluorescencia de DAF-FM en presencia de colchicina (inhibidor de la polimerización de los microtúbulos) y de dorsomorfina (inhibidor de la proteína dependiente de AMP (AMPK)). En base a los resultados obtenidos pudimos comprobar que el citoesqueleto estaría sensando la deformación de la membrana y lo traduciría en la activación de AMPK con el consecuente aumento de la producción de NO mediado por la nNOS. A través de la medición de la amplitud del transitorio de Ca2+ y el acortamiento celular de los miocitos cardíacos en ausencia y presencia de diferentes inhibidores como los antes mencionados para inhibir las NOS y además ODQ (inhibidor de la guanilato ciclasa soluble (GCs)) y KT5823 (inhibidor de la proteína quinasa G (PKG)) pudimos observar que el NO estaría generando soporte contráctil a través de un mecanismo dependiente de GMPc/PKG durante el efecto inotrópico negativo (EIN) asociado al hinchamiento hipotónico. Este soporte contráctil se debería a un mecanismo dependiente de GMPc/PKG que promueve que el sitio Ser2808 del receptor de rianodina (RyR2) esté más fosforilado provocando que este receptor esté más sensibilizado frente a un dado Ca2+ citosólico generándose un mayor transitorio de Ca2+ y así el soporte contráctil. Por otro lado, observamos que exponer a los miocitos adultos a una solución hipotónica mejora su supervivencia y que el NO no estaría mediando este efecto.

El presente trabajo de tesis tiene tres partes principales. En la primera parte se describen estudios de producción de PGasa por A. sojae en cultivos sumergidos aprovechando residuos agroindustriales, poniendo especial atención en el uso de cáscaras de soja. Luego de un estudio preliminar de producción con varios subproductos, se eligió emplear cáscaras de soja y se continuó con la búsqueda de componentes relevantes del medio de cultivo y optimización de los mismos para maximizar la actividad PGasa, empleando fundamentalmente diseño experimental multivariado y metodología de superficie de respuesta. De esta forma se mejoró la productividad volumétrica al doble mediante una variación en el pH inicial del cultivo en un rango muy pequeño de pH ácido que oscila en 2.60. El proceso optimizado se transfirió exitosamente a biorreactores de tanque agitado en términos de productividad volumétrica. A su vez, se obtuvo una actividad PGasa de 42 U/ml con un rendimiento de 1.39 U/g de cáscara de soja, un valor que se sitúa dentro de los más elevados reportados con este subproducto. El incremento de la concentración del medio de cultivo al doble en biorreactor no se tradujo en una duplicación de la productividad volumétrica, y la evolución del oxígeno disuelto a lo largo del proceso es coherente con una limitación del cultivo en oxígeno. En este medio de cultivo el microorganismo produjo también actividad xilanasa. La caracterización morfológica del cultivo reveló que A. sojae se desarrolló como micelio disperso a valores de pH inicial de 2.40 -2.80 mientras que, a la inversa, a pH 5.40 predominó la morfología de pellets. Por otro lado, se estudió la producción de actividad PGasa con cáscaras de naranja, pomazas de durazno y damasco, empleando una cepa de A. sojae superproductora. Se utilizaron diseños de superficie de respuesta de Doehlert para estudiar la producción de PGasa con estos tres residuos por separado, y finalmente el cultivo se transfirió a biorreactores de tanque agitado en los que se ensayaron diferentes perfiles de agitación y aireación con un medio de cultivo compuesto por una mezcla de cáscaras de naranja y pomaza de damasco. Controlando el oxígeno disuelto con el flujo de aire a un valor fijo de agitación (600 rpm), la tensión de oxígeno disuelto se mantuvo sobre el 25 % a lo largo del cultivo y se obtuvieron los mejores resultados, una producción de 380 U/ml, que representa una mejora en 1.5 veces respecto a los niveles obtenidos llevando a cabo la fermentación a flujo de aire y velocidad de agitación constantes (1 vvm y 600 rpm). En la segunda parte se describe la producción, purificación y posterior caracterización de una endo-poligalacturonasa producida por Aspergillus sojae en cultivos sumergidos, utilizando como fuente única de carbono y energía cáscara de naranja. A partir del seguimiento de la cinética de producción de A. sojae en un medio de cultivo compuesto por cáscara de naranja molida y (NH4)2SO4, se escogió cosechar el cultivo a las 168 horas desde iniciado, por ser el momento en el cual la actividad enzimática, determinada por dos métodos distintos, alcanzó valores máximos. Una vez obtenido un sobrenadante libre de biomasa y partículas provenientes del medio de cultivo, la purificación se realizó por medio de una serie de pasos cromatográficos de intercambio iónico y exclusión molecular. Según análisis electroforéticos, se obtuvo una fracción homogénea con un PM de 47 kDa y un pI de 4.2. A destacar, la enzima probó ser considerablemente estable frente a condiciones desde muy ácidas hasta neutras (pH 1.5-6.5) y presentó un valor de KM particularmente bajo, 0.134 mg/ml, lo que da cuenta de su elevada afinidad por su sustrato. En condiciones estáticas la PGasa resultó ser completamente estable hasta 45° C, y presentó una vida media de inactivación térmica de 2 horas a 50° C. Además de su actividad frente a ácido poligalacturónico (APG) y pectina, la enzima exhibió actividad solubilizadora de pectina, siendo su rango de actividad óptima sustrato-dependiente, si bien actúa mejor en un rango de pH concertado de 3.3-5.0. Los análisis por cromotografía en capa fina (CCF) revelaron que el tri-galacturonano es el principal producto final de hidrólisis de APG, indicando el carácter endo- de la PGasa. La enzima permaneció estable y su actividad inalterada frente a SO2, etanol y varios cationes ensayados excepto Hg2+, el cual inactivó la actividad por completo. Estas propiedades convierten a la endo-PGasa de A. sojae en un potencial candidato para ser utilizado en los procesos de extracción y clarificación de jugos de fruta, y durante la elaboración de vino en la etapa pre-fermentativa de desfangado de mosto. La tercera parte comienza con la descripción del proceso de obtención de un preparado pectolítico de A. sojae (PP-AS), desde el cultivo del microorganismo a partir de cáscaras de naranja hasta la obtención de una preparación sólida. PP-AS se caracterizó en términos de actividades enzimáticas relevantes para aplicación vinícola y luego se aplicó, por un lado, al mosto de uva blanca previo a la fermentación alcohólica para evaluar la promoción de la clarificación del mismo, y por otro lado, durante la maceración fermentativa en vinificaciones en tinto con el fin de estudiar su efecto en el desarrollo del color del vino y en su composición fenólica y aminoacídica. De todas las actividades enzimáticas cuantificadas bajo condiciones de vinificación (pH 3.50 y 20° C), la actividad PGasa fue previsiblemente la principal, y probó ser estable e inalterable frente al SO2. También se verificó la existencia de actividad XYLasa, aunque en cantidades menores, y es destacable la ausencia de actividad pectinesterasa, la cual contribuye en la producción indeseable de metanol. La adición de PP-AS al mosto de uva blanca promovió en un período de tiempo razonable una clarificación efectiva del mismo ya que a diferencia del mosto sin adición exógena de pectinasas, el cual clarificó pobremente, los niveles de turbidez alcanzados fueron los recomendados para asegurar una fermentación alcohólica adecuada sin que el producto final pierda características sensoriales. Finalizada la elaboración de vinos blancos, aquellos elaborados a partir de los mostos clarificados con PP-AS presentaron niveles significativamente mayores que los vinos control de ácido L-málico y significativamente menores de ácido L-láctico, hecho característico de la fermentación maloláctica e indicativo de un metabolismo activo de bacterias ácido lácticas. Este resultado es atribuible a un desfangado eficaz gracias a la adición de enzimas pectolíticas, ya que durante la clarificación la carga microbiana disminuye sensiblemente y los mostos desfangados son menos proclives de sufrir fermentaciones indeseadas. Respecto a las vinificaciones en tinto, las actividades enzimáticas de PP-AS promovieron una extracción comparativamente más rápida de materia colorante ya que se alcanzó la máxima intensidad de color antes que en los vinos control. Luego de seis meses de almacenamiento en bodega, los vinos elaborados con PP-AS presentaron concentraciones más elevadas de ácidos cumárico, cafeico y aspártico (p < 0.05), sugiriendo una extracción mejorada de los componentes contenidos en las células de la uva.

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales

Fil:Silva, Adrián Mario. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.