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Modificaciones dependientes de actividad en los circuitos neurales han sido ampliamente reportadas. En particular, la experiencia modifica la sobrevida, el desarrollo y la conectividad de las células granulares (CGs) nacidas en el hipocampo adulto; sin embargo, los mecanismos que median este fenómeno son poco conocidos. En esta tesis investigamos el remodelado de los microcircuitos del giro dentado (GD) en ratones expuestos a un ambiente enriquecido (AE). Una breve exposición a un AE en una ventana de tiempo restringida durante el desarrollo de la nuevas CGs aceleró su integración funcional, y este efecto correlacionó con un GD mas activo. Esa integración funcional incrementada fue mimetizada por una activación quimiogenética in vivo de un pool de CGs maduras. Por técnicas de optogenética y electrofisiología ex vivo encontramos que las CGs maduras reclutan a las interneuronas parvalbumina (INs-PV), que a su vez contactan a las CGs en desarrollo. En concordancia, la estimulación quimiogenética de INs-PV o la despolarización directa de las CGs en desarrollo aceleró la integración funcional, mientras que la inactivación de las INs-PV previno los efectos del AE. Nuestros resultados revelan un mecanismo de remodelado dinámico por el cual la experiencia activa el circuito del GD, lo que determina una maduración acelerada de las CGs jóvenes a través un loop disináptico de feedback mediado por las INs-PV.

Tesis (Doctor en Física)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Matemática, Astronomía y Física, 2009.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

Los dermatofitos son hongos hialohifomicetes, queratinofílicos y patógenos primarios causantes de infecciones superficiales de la piel denominadas dermatofitosis, tiñas o tineas. Microsporum canis es el agente etiológico más frecuente de tinea capitis en la población infantil en Argentina y produce lesiones no inflamatorias o inflamatorias, con diferente grado de compromiso cutáneo dependiendo de la respuesta inmune del hospedador. La piel es la barrera del organismo con el medio ambiente por lo que la presencia de células de la inmunidad innata y adaptativa es crucial para el correcto desarrollo de una respuesta para resolver un daño, controlar una infección o para mantener la homeostasis del tejido. Las células de Langerhans (LC) son las únicas células dendríticas de la epidermis y podrían tener un rol durante las dermatofitosis. Además, la respuesta mediada por interleuquina 17 (IL-17) es clave en la defensa frente a patógenos extracelulares, como las bacterias y los hongos, y es esencial en la protección de las mucosas. Sin embargo, no se conocen los efectos de los dermatofitos en las funciones de las células dendríticas en el contexto de la piel y la participación de la respuesta mediada por IL-17 en la inmunidad anti-dermatofítica. El objetivo general de esta tesis fue investigar la respuesta inmune generada luego de la infección de la piel por el dermatofito M. canis y evaluar la función de las LC en la inducción de la inmunidad protectora en la dermatofitosis. En esta tesis, los estudios in vitro demostraron que hifas vivas de M. canis activan a las células XS106 (línea celular derivada de LC murinas) y a LC localizadas dentro de la epidermis. Además, ambos tipos celulares fueron capaces de inducir un perfil Th17 en cultivos con linfocitos alogénicos. Por otra parte, se desarrolló un modelo de infección epicutánea con M. canis en ratones C57BL/6, los cuales presentaron características clínicas e histopatológicas similares a la tinea capitis no inflamatoria en humanos. En este modelo, se demostró que durante la dermatofitosis predomina una respuesta adaptativa antígeno-específica tipo Th17. Además, la señalización de la vía IL17/IL-17R es necesaria para suprimir la proliferación fúngica en la piel y para controlar la respuesta inflamatoria exacerbada mediada por IFN-γ. Sin embargo, el reclutamiento de neutrófilos en la piel y su funcionalidad es independiente de la señalización por IL-17. A su vez, en ausencia de IL-17 e IFN-γ, se activarían mecanismos protectores eficientes que inhiben la proliferación de M. canis en la piel. Finalmente, mediante la infección con M. canis de ratones transgénicos Lang-EGFPDTR depletados de LC, se demostró la participación in vivo de las LC en la inducción de la respuesta Th17 específica frente al hongo. Esta tesis abre diferentes perspectivas de investigación para comprender la inmunidad de la piel en el contexto de la infección dermatofítica.

Lotus japonicus es una legumbre modelo ampliamente utilizada para el estudio de procesos importantes como la nodulación y la respuesta al estrés salino. Sin embargo, existen pocos estudios sobre la respuesta defensiva de esta especie contra microorganismos patógenos. Comprender como se protege esta especie modelo contra patógenos podría ayudar a desarrollar cultivares más tolerantes en especies de Lotus de relevancia agronómica, así como también en otros géneros de legumbres. Para poder dilucidar los mecanismos de defensa más importantes en esta leguminosa, en este trabajo se exploraron las principales respuestas de dos ecotipos fenotípicamente contrastantes, Miyakojima MG-20 y Gifu B-129, a la inoculación con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Las respuestas de defensa activadas en ambos ecotipos fueron considerablemente diferentes. Así, en Miyakojima MG-20 se observó una interacción compatible caracterizada por una rápida multiplicación de la bacteria, acompañada por un descenso en la eficiencia del fotosistema II, la aparición de clorosis, desecación y defoliación, así como un moderado pero sostenido aumento en los niveles de especies reactivas del oxígeno (EROs). Estos fenómenos sólo fueron observados en los folíolos inoculados y no afectaron el desarrollo normal de la planta. Por su parte, en Gifu B-129 la interacción fue incompatible, los síntomas fueron en general imperceptibles, la bacteria fue incapaz de multiplicarse en los tejidos de la planta y existió un aumento notable de las EROs durante las primeras horas luego de la inoculación con la bacteria. A partir de estudios transcripcionales utilizando microarreglos de ADN, pudieron identificarse alrededor de 3000 genes regulados diferencialmente frente a la inoculación con la bacteria en el ecotipo Miyakojima MG-20 y alrededor de 300 genes en el ecotipo Gifu B-129. Además, se comparó la expresión génica basal de estas líneas, observándose diferencias en genes relacionados con estrés biótico y abiótico, metabolismo hormonal, estado redox y procesos fotosintéticos. Por otro lado se realizó un estudio del metaboloma, en el cual también se observó un comportamiento contrastante entre ambos ecotipos, detectándose un conjunto diferente de metabolitos que se modifican frente a la inoculación con la bacteria. Integrando los resultados del transcriptoma y del metaboloma se pudieron identificar numerosas vías metabólicas afectadas de manera diferencial en respuesta al ataque bacteriano, lo que permite explicar las diferencias de comportamiento observadas entre ambos ecotipos. Entre estas vías se destacan el sistema de antioxidantes (ascorbato y glutatión), el metabolismo del ácido γ-aminobutírico, la síntesis y degradación de componentes de la pared celular, la síntesis y degradación lípidos y el metabolismo hormonal. Posteriormente, sobre la base del análisis transcriptómico se seleccionaron distintas líneas mutantes insercionales del ecotipo Gifu B-129 para un conjunto de genes que podrían jugar un rol importante en la defensa vegetal. La mayoría de tales líneas demostró una tolerancia equivalente a la observada en la línea salvaje, sugiriendo que los genes mutados no son esenciales en la respuesta de defensa en estos ecotipos. Sin embargo, una línea incapaz de expresar el gen de la enzima Poliamina Oxidasa I demostró una mayor tolerancia durante la patogénesis, lo que indicaría que la expresión de este gen afecta negativamente la respuesta defensiva de la planta. Este trabajo permitió describir de manera global las principales vías metabólicas reguladas en dos ecotipos de L. japonicus durante la respuesta a la bacteria P. syringae pv. tomato DC3000. Las diferencias entre las respuestas inducidas en el ecotipo Gifu B-129 (interacción incompatible) con las observadas en el ecotipo Miyakojima MG-20 (interacción compatible) permitieron discernir cuales son los mecanismos de defensa más efectivos entre los presentadaos por los ecotipos evaluados. Estos resultados podrían ser extrapolados a otras especies de leguminosas de interés agronómico.

Fil:Cuasnicú, Patricia S.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

KSHV es un oncovirus implicado en Sarcoma de Kaposi (KS) y otros cánceres asociados a SIDA. KS es un neoplasma caracterizado por la proliferación de células ahusadas y la intensa angiogénesis. Los mecanismos a través de los cuales KSHV causa la respuesta angioproliferativa de KS se desconocen y la reproducción de todos los aspectos de KS mediante infección experimental por KSHV aún no ha podido ser demostrada. El receptor acoplado a proteína-G (vGPCR) de KSHV puede estimular cascadas de señalización que inducen angiogénesis y transformación celular. Identificar estas cascadas puede tener significancia terapéutica. Ciclooxigenasa-2 (COX-2) es un medidor involucrado en angiogénesis tumoral que puede ser regulada por antinflamatorios (AINEs). En la primera parte de este trabajo demostramos que vGPCR regula la actividad y la expresión de COX-2 vía ERK-1/2. Encontramos que la inhibición de COX-2 impide la angiogénesis inducida por vGPCR y que la administración del AINE Celecoxib retarda el crecimiento tumoral con disminución en la vascularata y producción de VEGF. Así, COX-2 sería uno de los componentes moleculares del cambio angiogénico de vGPCR y un posible blanco terapéutico. En la segunda parte mostramos que la transfección con KSHV clonado en un Cromosoma Artificial Bacteriano (KSHVBac36) en preparaciones de médula ósea murinas enriquecida en precursores de células endoteliales (mEC) es suficiente para inducir tumorigénesis y llevar al cambio fenotípico angiogénico. Las células mEC transfectadas con KSHVBac36 (mECK36) estaban infectadas con KSHV, secretaban VEGF, eran angiogénicas in vivo e indujeron en ratones inmunodeficientes la formación de sarcomas de células ahusadas vascularizados que expresaban LANA y marcadores característicos de KS. La inhibición de la expresión de vGPCR en las mECK36 utilizando siRNA condujo a la inhibición de su angiogenicidad y tumorigenicidad. Estos resultados definen un modelo animal para estudiar la patogénesis de KS mediada por KSHV y señalan a vGPCR como uno de sus principales oncogenes angiogénicos.

La memoria no sólo implica recordar a lo largo del tiempo sino también mantener los recuerdos diferenciados y no confundirlos. Se cree que la capacidad de separar experiencias similares en recuerdos distintos se basa en la separación de patrones, un proceso computacional mediante el cual se amplifican pequeñas diferencias en la entrada de información. Sin embargo, dado que nuestro entorno cambia constantemente, también es crucial para la memoria episódica recordar nuestras experiencias anteriores a pesar de los cambios ambientales. Los modelos computacionales sugieren la existencia de un proceso complementario de compleción de patrones mediante el cual redes neuronales podrían recuperar memorias completas a partir de señales parciales o degradadas. Se cree que la región CA3 del hipocampo podría mediar este mecanismomediante la mejora plástica de las conexiones colaterales recurrentes de las neuronas CA3 que estaban activas durante el aprendizaje. Por otro lado, la separación de patrones se ha investigado en el giro dentado del hipocampo (GD), pero se sabe muy poco sobre este proceso en otras regiones del cerebro como la corteza perirhinal (Prh). En primer lugar, investigamos el papel de proteínas relacionadas con la plasticidad en la Prh y GD para la separación de patrones de las memorias de reconocimiento de objetos no espaciales.Encontramos que el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) es necesario para el almacenamiento en forma diferenciada de representaciones de objetos similares, pero no cuando estas representaciones son distintas. Además, el mecanismo está mediado por la proteína asociada al citoesqueleto regulada por la actividad (Arc). Finalmente, usando tanto una tarea dependiente del hipocampo como una dependiente de la Prh y manipulando la carga de similitud entre estímulos durante la codificación de la información, encontramos que los rNMDAs son efectores para las acciones plásticas del BDNF en la consolidación de memorias de objetos similares y deposiciones en el espacio en la Prh y DG respectivamente. Encontramos un rol de BDNF y Arc en la consolidación, en forma independiente del intervalo de retención de la memoria (la misma demanda de persistencia de memoria estaba presente en todas las condiciones). La interacción entre rNMDAs, BDNF y Arc parece ser necesaria para una discriminación exitosa en una forma independiente de la categoría del estímulo, argumentando a favor de mecanismos de plasticidad molecular conservados en todas las regiones a pesar de sus diferencias anatómicas. Proporcionamos evidencia novedosa con respecto a las proteínas 4 involucradas en la desambiguación de recuerdos de objetos fuera y dentro del GD y sugerimos que, a pesar de las diferencias anatómicas, mecanismos similares subyacen a la separación de patrones en el GD y la Prh que dependen exclusivamente de la similitud de los estímulos. Luego, decidimos estudiar la compleja interacción entre la separación de patrones y la compleción de patrones mediante tareas de comportamiento adecuadas. Con este fin, manipulamos la cantidad de señales disponibles durante la recuperación (fase de prueba) en una tarea de reconocimiento espontáneo de objetos para investigar la función de los receptores NMDA en CA3 (rNMDAs). Mostramos que la intervención farmacológica de los receptores CA3 rNMDAs del hipocampo altera de manera bidireccional la recuperación de la memoria espacial solo cuando las señales se degradan.Manipulaciones similares en el giro dentado no tienen ningún efecto sobre la compleción de patrones, pero sí sobre la separación. Estos hallazgos sugieren que los rNMDAs en CA3 son necesarios para la recuperación de memorias espaciales cuando se reduce la cantidad de información ambiental, y que los cambios plásticos en el giro dentado y CA3 son importantes para definir si la separación o la compleción de patrones se producen cuando se exponen a un contexto modificado.

La presente Tesis de Doctorado propuso investigar la existencia de alteraciones en el proceso de trombopoyesis en la trombocitopenia inmune (PTI). Para ello se utilizó un modelo in vitro de diferenciación de megacariocitos a partir de progenitores hematopoyéticos CD34+ normales. Al día 13 de cultivo, los megacariocitos maduros se incubaron con muestras de plasma de pacientes con PTI evaluando su efecto sobre la formación de proplaquetas, la capacidad de adhesión y spreading, la apoptosis celular y la activación de señales intracelulares al contacto con proteínas de matriz de médula ósea. Los plasmas de PTI produjeron una inhibición dosis-dependiente de la trombpoyesis, lo que se acompañó de alteraciones morfológicas en las proplaquetas. Además, estos plasmas no afectaron la madurez ni la sobrevida de los megacariocitos, lo que sugiere que las alteraciones en la producción plaquetaria son ocasionadas por un efecto directo sobre el proceso de trombopoyesis. La fracción de inmunoglobulinas G purificadas de los pacientes reprodujo la inhibición, mientras que la eliminación de los autoanticuerpos del plasma la revirtió, demostrando que son los autoanticuerpos los responsables, al menos en parte, de estas alteraciones. Además de la trombopoyesis, los plasmas con autoanticuerpos dirigidos contra las glicoproteínas IIb- IIIa y Ia-IIa afectaron la capacidad de adhesión y spreading de los megacariocitos a los ligandos medulares de estos receptores, fibrinógeno y colágeno I, respectivamente. En particular, la presencia de anticuerpos anti-GPIa-IIa de PTI provocó una pérdida de la capacidad fisiológica del colágeno I de inhibir la trombopoyesis, lo que sugiere que podría ocurrir liberación de plaquetas en forma prematura en el contexto del nicho osteoblástico medular. La existencia de alteraciones trombopoyéticas en presencia de plasmas de PTI sin autoanticuerpos detectados sugiere la existencia de autoanticuerpos dirigidos contra blancos alternativos. La presente Tesis de Doctorado expone resultados novedosos que demuestran que los autoanticuerpos de PTI tienen un efecto nocivo sobre la trombopoyesis y sobre otras funciones megacariocíticas, revelando nuevos mecanismos que contribuyen a la disminución del recuento de plaquetas en esta entidad.

El objetivo general del presente plan de trabajo es estudiar el rol de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (LCR) en el transporte de la ghrelina plasmática al cerebro. Los objetivos específicos a abordar son:1) Estudiar la capacidad de las células de la barrera sangre-LCR para transportar la ghrelina circulante al cerebro. 2) Desarrollar y caracterizar un cultivo primario de tanicitos para estudios in vitro. 3) Estudiar si el transporte de ghrelina a través de la barrera sangre-LCR depende del receptor de ghrelina (GHSR). 4) Estudiar los mecanismos moleculares por los cuales la ghrelina es incorporada en los tanicitos hipotalámicos.