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En la Argentina, entre los problemas sanitarios que afectan al cultivo de tomate (Solanum lycopersicum), se encuentran los fitonematodos. Actualmente, se usan fumigantes y nematicidas, siendo más complejo su control a partir del compromiso del país de eliminar el uso de bromuro de metilo. Como alternativa de bajo impacto ambiental, que garantiza la sustentabilidad del sistema, se encuentra la aplicación de elicitores y, entre ellos las hormonas vegetales. El Ácido Salicílico (AS), el Ácido Jasmónico (AJ) y el Etileno (ET) son hormonas vegetales que intervienen en todos los procesos de crecimiento e inducción de defensas de las plantas. La hipótesis de esta tesis fue: “La aplicación de hormonas induce o favorece la defensa de las plantas frente al ataque de Nacobbus aberrans, que disminuye la eficacia biológica y permite la producción de tomate en suelos infestados con este nematodo, sin aplicación de nematicidas o plaguicidas”; planteándose como objetivos generales: 1. comprobar, entender y desarrollar la Resistencia Sistémica Adquirida (RSA) y la Resistencia Sistémica Inducida (RSI), mediante la aplicación de hormonas en el sistema radical de plantines, trasplantados en suelos infestados con Nacobbus aberrans, 2.cuantificar el efecto del costo de la eficacia biológica, y 3. medir el rendimiento y sus componentes en un cultivo de tomate tratado con hormonas bajo condiciones de invernáculo. Se condujeron en forma consecutiva tres ensayos en maceta y uno sobre el suelo, todos en un invernáculo metálico de 24 por 40 m, en la Estación Experimental Julio Hirschhorn, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, UNLP (33º56'42,6”S, 60º33'35,6”W), utilizando tomate cv. Elpida. Para los ensayos en maceta se planteó un diseño enteramente aleatorizado con 5 repeticiones, mientras que en el campo el diseño fue en bloques completos aleatorizados con 4 repeticiones. Los datos se sometieron a análisis de la varianza y prueba de Tukey (p<0,05) utilizando el programa Infostat. El primer ensayo se destinó a evaluar el efecto sobre el crecimiento relativo de 3 concentraciones de cada hormona T1: AS 0,5 x 10-4 M, T2: AS 1,0 x 10-4 M, T3: AS 2,0 x 10-4 M, T4: AJ 1,00 x 10-3 M, T5: AJ 1,00 x 10-4 M, T6: AJ 1,00 x 10-5 M, T7: ET 0,35 x 10-3 M, T8: ET 0,70 x 10-3 M, T9: ET 1,40 x 10-3 M y un control sin hormonas (T10). Las aplicaciones se realizaron mojando el sustrato por drench con 1 ml por celda. Los plantines que se trasplantaron a macetas con sustrato infestado articialmente con Nacobbus aberrans (CN) (11000 N en 500ml) y a sustrato sin infestar (SN). Luego de 60 días, se observó una respuesta equivalente a todos los tratamientos SN, pero un mayor crecimiento relativo de plantas sometidas a T1, T2, T5, T6, T7 y T8 en CN. Estas concentraciones se utilizaron en el segundo ensayo, para ajustar el tiempo de aplicación previo al trasplante. Se utilizó sustrato SN inoculando los plantines por drench con 1 ml por celda 24, 72 y 168 horas antes del trasplante; manteniendo plantines sin tratar como control. El tiempo de aplicación previo al trasplante no modificó significativamente el crecimiento relativo de las plantas 60 días luego de la aplicación. A partir de estos resultados se desarrolló el tercer ensayo, con el fin de evaluar las 6 concentraciones y tiempo seleccionado (24 h) sobre variables morfológicas, de crecimiento y reproductivas hasta el 1º racimo de plantas cultivadas en macetas con sustratos CN y SN, utilizando plantas sin tratar como control. En CN, T2 produjo un crecimiento relativo significativamente mayor que T1, T5, T7, T8 y T10; sin diferencias significativas en el resto de las variables ni en SN. Este mismo ensayo se planteó en suelo, en el que como cultivo previo había tomate cv. Elpida sin injertar e injertado sobre Beaufort, Multifort, 9184 y Maxifort. Previo al trasplante, en el sitio de ensayo, se identificaron 33 saprófitos, 45 Helicotylenchus spp., 48 Nacobbus. aberrans J3 y J4, 64 Dorylaimus spp. y 76 Mononchus spp. cada 100 cm3 de suelo y 20 a 41 huevos y 24 a 40 J2 de Nacobbus aberrans por g de raíz, en cantidades significativamente más bajas en Elpida injertados sobre Maxifort y 9184. El 16/01/2014 se trasplantó tomate cv. Elpida, tratando a los plantines con T1, T2, T5, T6, T7 y T8, 24 horas antes del trasplante por drench con 1 ml por planta, dejando controles sin tratar. Sobre el folíolo terminal de la hoja inmediata inferior al último racimo desarrollado, entre el 3º y 4º racimo se midieron: temperatura del canopeo (cámara termográfica FLIR E-30) e intercambio de gases (analizador de gases por infrarrojo TPS-2, cubeta PLC-4: PPsystems), e índice de verdor (Chlorophyll metter SPAD-502. Minolta Co. Ltd.), sobre el foliolo terminal de la hoja inmediatamente inferior al 1º racimo. Se registró rendimiento total y por categorías comerciales por racimo, hasta la 6º corona, número de agallas y peso fresco de raíces, calculando índice de agallamiento como el cociente entre ambas variables y número de huevos de nemátodos y J2 en raíz, para calcular el índice reproductivo Pf/Pi[(Nº huevos-J2 Poblacion final e inicial )/Nº nemátodos en suelo previo al trasplante]. El intercambio gaseoso no fue significativamente modificado por los tratamientos. La temperatura foliar fue significativamente más baja en T2, que incrementó el índice de verdor respecto al testigo. Las hormonas incrementaron la producción de frutos con peso mayor a 150 g y el rendimiento total respecto al testigo, produciendo menor número de agallas, índice de agallamiento y reproducción. T2 produjo menor daño en raíces y mayor producción total y por racimos, seguido por T8 y T6. El aumento de resistencia en tomate frente a Nacobbus. aberrans, por el tratamiento con AS se muestra promisorio, siendo importante continuar investigando las implicancias prácticas del uso de elicitores y profundizar en la comprensión de su modo de acción para el control de Nacobbus aberrans.

Las proteínas del suero proveniente del proceso de elaboración de quesos poseen propiedades funcionales específicas y un elevado valor nutricional. Por esta razón, estas proteínas son utilizadas en la elaboración de sistemas alimentarios. El proceso de congelación (congelación, almacenamiento del producto congelado y descongelación) es un tratamiento ampliamente utilizado para conservar ingredientes y alimentos elaborados. No obstante, la formación de cristales de hielo puede afectar la calidad de estos productos. El objetivo general de esta tesis fue estudiar el efecto del proceso de congelación sobre las características físicas y químicas de sistemas alimentarios (suspensiones y un queso blando magro) elaborados con proteínas del suero. Se estudiaron suspensiones de proteínas del suero que fueron tratadas térmicamente a cuatro temperaturas y sometidas al proceso de congelación. Se analizó el contenido de proteína que se desnaturalizó y/o que formó agregados (PDA) y se determinó la cinética global de desnatualización-agregación. Además, se estudiaron quesos blandos magros elaborados con proteínas del suero que fueron sometidos al proceso de congelación, tomando muestras a distintos tiempos de maduración. Se determinaron las propiedades fisicoquímicas (humedad, concentración de sal, pH, proteína total y proteína en la fracción soluble a pH 4,6) y se calcularon los índices de maduración. Las propiedades reológicas de las suspensiones y de los quesos estudiados fueron analizadas por medio de ensayos oscilatorios realizando barridos de frecuencia dentro de la región de viscoelasticidad lineal. Los resultados obtenidos permitieron caracterizar a los sistemas alimentarios estudiados, identificando las propiedades que fueron afectadas por el proceso de congelación.

La hipoxia hipobárica (HX) puede definirse como un descenso de la presión barométrica con la consecuente disminución de la presión parcial de oxígeno en la atmósfera. La exposición a HX constituye un estímulo estresante para el organismo, por lo tanto, este debe desarrollar respuestas que le permitan hacer frente a las exigencias del ambiente, las cuales difieren entre las poblaciones que habitan permanentemente en zonas de gran altitud (hipoxia crónica continua, HCC) y aquellos individuos que trabajan en HX y retornan a zonas de baja altitud para descansar (hipoxia crónica intermitente, HCI). A pesar del hecho de que las respuestas fisiológicas que se desencadenan frente a la HX han sido ampliamente discutidas, las repercusiones de los bajos niveles de oxígeno a nivel de los tejidos orales aún no están claras. La literatura cuenta con estudios que analizan los tejidos periodontales y las glándulas salivales tanto en animales como en humanos expuestos a HX, pero en todos ellos las condiciones de exposición no son en las que habitualmente se desarrolla la vida. Por esta razón, este trabajo de tesis se centra en la evaluación del estado periodontal y glandular en ratas expuestas a 4200 metros de altura simulada, siendo nuestra hipótesis que la exposición a dicha altura causa una merma en la función biológica de los tejidos orales. Dichos tejidos serían capaces de aclimatarse pero esta respuesta podría variar dependiendo de si la exposición a HX es continua o intermitente.En nuestros modelos experimentales, se utilizaron ratas Wistar hembras (en crecimiento o adultas), las cuales se expusieron a HX durante 90 días con el fin de evaluar las propiedades biomecánicas mandibulares, la morfometría del hueso alveolar, la concentración de diversos biomarcadores del tejido gingival y de glándulas submaxilares (GSM), la histoarquitectura de GSM y la secreción salival. Además, hemos realizado experiencias en animales con inducción experimental de enfermedad periodontal (PE), con el fin de analizar el efecto de la HX en un hueso alveolar afectado por periodontitis. Los resultados del presente trabajo indican que la HX afecta negativamente las propiedades biomecánicas mandibulares en ratas en crecimiento, hecho probablemente vinculado a la disminución de la masa ósea de los animales y a la incapacidad de la mandíbula de adaptar su geometría durante la exposición a HX. El hueso alveolar también sufrió alteraciones, observándose reabsorción cortical lingual e interradicular, sin evidencia de desarrollo de una respuesta inflamatoria a nivel periodontal. La mencionada pérdida ósea podría ser considerada como un intento de aclimatación para aumentar la masa roja circulante, proceso fundamentalmente a cargo de la médula ósea de los huesos largos. El incremento de la actividad de la óxido nítrico sintasa inducible observado en el tejido gingival y en la GSM, da cuenta de la necesidad del organismo de aumentar el aporte de O2 en ambos sitios, lo que refuerza el concepto de intento de aclimatación a nivel periodontal y glandular.En ratas adultas, la exposición a HX no indujo cambios biomecánicos mandibulares, probablemente debido a que estos animales ya han completado su formación ósea. Es evidente que la exposición intermitente resultó más perjudicial en términos de aclimatación que la continua. Esto se vio reflejado en la menor secreción salival y en la mayor pérdida ósea interradicular en HCI, así como también en el aumento de la resorción ósea general. Los fenómenos homeostáticos desencadenados en respuesta a HX involucrarían la activación del factor inducible por hipoxia-1α y mecanismos adaptativos a nivel bioenergético mitocondrial, que parecen no ser del todo eficaces en HCI. Estos resultados conjuntamente con el análisis microscópico de las GSM sugieren una diferencia fenotípica durante la aclimatación en HCI y HCC, que involucraría cambios a nivel bioquímico, ultraestructural y molecular.Cuando se evaluó el efecto de la HX sobre ratas adultas sometidas a PE, nuestros resultados sugieren que la exposición a HX agrava las manifestaciones patológicas orales de la periodontitis, tanto a nivel óseo como glandular. Las vías de señalización que se activan a nivel celular durante la exposición a HCI y HCC podrían incrementar las señales de la cascada inflamatoria inducida por periodontitis, aumentando su efecto deletéreo sobre el periodonto y las GSM. En conclusión, la exposición a HX induce cambios en la fisiología del tejido periodontal y glandular de ratas en crecimiento y adultas, de forma diferencial cuando se las expone en forma continua como intermitente. Este trabajo de tesis constituye un antecedente valioso a la hora de evaluar la salud periodontal de individuos que habitan o trabajan en condiciones de HX y ayuda a una mejor comprensión de los procesos que regulan la homeostasis oral durante la aclimatación a la HX, pudiendo contribuir al desarrollo de estrategias para prevenir la hiposecreción salival y sus consecuencias en poblaciones expuestas a HX.

El trabajo de tesis propone la evaluación del efecto de la impregnación con sales de calcio como tratamiento previo para elaborar mamón en almíbar y mamón congelado. Con el espíritu de desarrollar productos de alto valor agregado se plantea el aprovechamiento de los carotenos presentes en la fruta madura en comparación con los procesos de elaboración donde se trabaja con fruta inmadura. La incidencia de la etapa de pretratamiento sobre la calidad del producto final, se analiza considerando principalmente los cambios nutricionales y sensoriales impartidos por distintas condiciones de elaboración propuestas.

Capítulo 1: “Estudio del rol de enzimas que participan en la acetilación de histonas en las respuestas frente a la radiación UV-B en plantas de Arabidopsis thaliana” Arabidopsis thaliana posee cuatro familias de histonas acetiltransferasas, la familia GNAT que posee 3 miembros denominados HAG1, HAG2 y HAG3; la familia MYST que posee 2 miembros, HAM1 y HAM2; la familia p300/CBP que posee 5 miembros denominados HAC1, HAC2, HAC4, HAC5 y HAC12; y la familia TAFII250, que posee 2 miembros, HAF1 y HAF2. En este trabajo de Tesis, la utilización de plantas de Arabidopsis thaliana con niveles nulos o disminuidos de las histonas acetiltransferasas de las familias HAG, HAC y HAF nos permitió demostrar que las histonas acetiltransferasas HAG3, HAF1 y HAC1 tienen diferentes roles durante la exposición de las plantas a la radiación UV-B, debido a que regulan la expresión de genes de respuesta al UV-B que son necesarios para el desarrollo de las mismas en respuesta a esta radiación. Capítulo 2: “Estudio del crecimiento de la hoja de plantas de maíz expuestas al UV-B solar” En Argentina, la producción agropecuaria es uno de los ejes de la economía, siendo el maíz uno de los principales cultivos. En trabajos anteriores se demostró que la radiación UV-B inhibía el crecimiento de las hojas de maíz. En este trabajo de Tesis, demostramos que los niveles de radiación UV-B presentes en la radiación solar inhiben el crecimiento de las hojas de maíz como consecuencia de una disminución en la producción celular; y esta respuesta está mediada, en parte, por el factor de transcripción ZmGRF1.

Tesis para obtener el grado de Doctora, de la Universitat Politècnica de València (España), en 2015

La luz puede ser usada para causar daño a los tejidos de diversas maneras, ya sea, térmica, mecánica o químicamente. Las aplicaciones de la luz incluyen técnicas terapéuticas en oftalmología, fotocoagulación, fotodisrupción y la fotoquímica. La fotoquímica difiere sustancialmente de las demás técnicas, ya que no implica ningún daño térmico o mecánico. El daño fotoquímico puede ocurrir naturalmente por exposición a la luz, induciendo mecanismos oxidativos. Por ejemplo, las consecuencias del estrés oxidativo de la retina generado por exposición a la luz, implican daño oxidativo de ADN, lípidos y proteínas (1,2). Durante años se ha incursionado en la utilización de diferentes terapias para la cura del cáncer. Una de ellas es la Terapia Fotodinámica. El presente trabajo de tesis se enmarca en este contexto, ahondando en el efecto del Beta-caroteno en el mecanismo de desactivación de oxígeno singlete en células mamíferas, a través del monitoreo directo de esta especie reactiva de oxígeno y la utilización de modelos donde se mimetiza tanto el ambiente heterogéneo al cual se enfrenta el carotenoide en la célula como la interacción con proteínas.

La enfermedad de Parkinson (PD, “Parkinson Disease”) es una enfermedad neurodegenerativa crónica, de desarrollo muy lento. Su característica neuropatológica sobresaliente es la pérdida de las neuronas dopaminérgicas de la substantía nigra (s.n.) del cerebro. No se conoce la causa cierta, ni existe una cura para esta enfermedad. Las citoquinas inflamatorias han sido halladas en el cerebro de pacientes con diversas enfermedades neurodegenerativas, inclusive con PD. El Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF) es una citoquina de particular interés, porque puede inducir tanto la sobrevida como la muerte de neuronas. El TNF y sus receptores han sido detectados en la s.n. de pacientes con PD, pero no de personas sanas. Sin embargo, no se tiene ninguna evidencia de cual podría ser la función del mismo en dicha patología. Utilizando ratones knock-in “hipomórficos” y un promotor específico de la s.n. (engrailed), se logró la expresión constitutiva de TNF en la s.n. de ratones. Combinando lo previo con dos elementos más (vectores adenovirales y el sistema Cre-LoxP), se desarrolló un modelo para lograr la expresión crónica de diferentes niveles de TNF en el cerebro de ratones in vivo. El mismo fue utilizado para analizar el papel de esa citoquina en la sobrevida o muerte de las neuronas dopaminérgicas. Realizando una única inyección estereotáxica de vectores adenovirales (Ad), se logró transducir las neuronas dopaminérgicas de la s.n. del ratón casi en un 100%. Así, cuando animales knock-in fueron inoculados en la s.n. con un adenovector codificante para la recombinasa Cre (AdCre), se observó la recombinación y escisión de un cassette que interfería con la expresión del transgén (cassette “PGK-neo”). El mismo estaba flanqueado por sitios llamados Lox-P (“floxeado”), los cuales son reconocidos por la recombinasa Cre. Seguidamente se demostró un aumento específico en la expresión del TNF respecto del basal en la s.n. de los animales knock-in inyectados con el AdCre, pero no cuando fueron inyectados con un Angal, o en animales silvestres (wt) inyectados con cualquiera de los dos adenovectores. Esos resultados demostraron que el mencionado cassette PGK-neo ejerce un efecto de “interferencia transcripcional” sobre el transgen de interés. Así, la combinación de las estrategias mencionadas ha permitido lograr la expresión constitutiva, e inducida, de una proteína de interés (TNF) en la s.n. del ratón. El análisis funcional de estos animales reveló que el TNF crónico inducido en algún momento de la vida adulta del animal provoca la lenta y progresiva desaparición de las neuronas dopaminérgicas de la s.n., representando un nuevo modelo de PD. Por otro lado, fue muy interesante observar que la expresión constitutiva de TNF logró aumentar 3 veces más el número de neuronas sobrevivientes que en los grupos controles ante el tratamiento de los animales con 6-hidroxidopamina (6-OHDa), una droga utilizada para modelar la PD. Estos resultados son un indicio para comenzar a comprender datos previos contradictorios de la literatura, referidos a la muerte o protección de neuronas mediado por TNF (el efecto final en cada caso podría depender de la concentración). La información aquí presentada será útil al considerar la posibilidad de una terapia que de alguna manera u otra afecte al TNF, o a cualquier otra citoquina (anti-inflamatorios, por ejemplo), como se ha realizado recientemente para esclerosis múltiple. Finalmente, la estrategia utilizada permitirá el estudio de las funciones de proteínas expresadas en la s.n. en forma controlada, y abre la posibilidad de establecer nuevos modelos animales de PD. Aún más, utilizando otros promotores endógenos, podrá permitir el estudio de otras patologías crónicas en el cerebro.

Los canales de calcio dependientes del voltaje (CaV) acoplan la despolarización de la membrana al influjo de calcio, desencadenando una diversidad de procesos celulares dependientes del calcio. Los CaV son, por lo tanto, críticos en la configuración de la actividad y función neuronal. Existen al menos diez genes que codifican para distintos subtipos de CaV, los cuales poseen características biofísicas particulares que les permiten cumplir fun-ciones muy diversas como el control de la excitabilidad neuronal (CaV3), la liberación de neurotransmisores (CaV2) y la transcripción (CaV1). Muchos neurotransmisores y fármacos que actúan a través de receptores acoplados a proteína G (GPCR) modulan la actividad neuronal al alterar la expresión, el tráfico o la función de los CaV. Los mecanismos depen-dientes de GPCR que regulan la densidad de los CaV en la superficie celular se observan en muchas neuronas pero están menos estudiados que otros efectos celulares de los GPCR. En el primer capítulo de esta tesis mostramos que la actividad constitutiva del re-ceptor de la hormona ghrelina (GHSR) puede inhibir el tráfico hacia la membrana plasmática de varios subtipos de CaV (CaV1.2, CaV1.3, CaV2.2, CaV3.2 y CaV3.3) en ausencia de ghre-lina utilizando como sistema experimental células HEK293T transfectadas en forma transitoria. Además mostramos que las corrientes CaV1 nativas en cultivos primarios de neuronas hipotalámicas son moduladas por la actividad constitutiva de GHSR. Esta forma basal de inhibición de los CaV depende de la presencia de la subunidad auxiliar CaVβ. Dicha proteína promueve que la subunidad principal CaVα1 sea exportada desde el retículo endo-plásmico hacia la superficie celular. De este modo, las acciones de GHSR en el tráfico de los CaV sugieren un nuevo papel para esta vía de señalización en áreas del cerebro que controlan la ingesta de alimentos, la recompensa, el aprendizaje y la memoria. Por otro lado, observamos que la aplicación aguda de ghrelina a células coexpresando GHSR y CaV3.3 inhibía la corriente macroscópica registrada, efecto que no se observaba al coex-presar el subtipo CaV3.2. Este hallazgo originó el segundo capítulo de esta tesis donde exploramos el efecto de ghrelina en los tres subtipos de CaV3 de expresión neuronal. Pudi-mos demostrar que ghrelina inhibe las corrientes T nativas en neuronas hipotalámicas y mediante la expresión heteróloga en células HEK293T determinamos que el subtipo Cav3.3 resultó ser el único sensible a dicha modulación. La modulación de CaV3.3 por ghrelina comprende una reducción en la conductancia máxima, un desplazamiento a voltajes hiper-polarizados de la curva corriente voltaje (curva I-V) y de la curva del estado estacionario de inactivación, y una aceleración de la cinética de activación e inactivación. Además nuestra predicción basada en modelado indica que la inhibición de CaV3.3 atenuaría la estimulación de los disparos de potenciales de acción originados por la inhibición de las corrientes de potasio por parte de ghrelina. En resumen, descubrimos un nuevo blanco de ghrelina en las neuronas: los CaV3.3. Este mecanismo implicaría una regulación negativa de la activación neuronal ejercida por la ghrelina. En conjunto nuestro trabajo contribuye al conocimiento de la amplia gama de acciones de GHSR, un receptor potencialmente útil para el desarrollo de fármacos para tratar desórdenes alimenticios.

Tesis (Magister en Ciencia y Tecnología de los alimentos) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016