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Las hemoproteínas son un conjunto ubicuo y extenso de proteínas, con una enorme diversidad funcional relacionada con la versátil reactividad del ion de hierro del grupo hemo. La gran mayoría de sus funciones biológicas involucran la unión de ligandos pequeños al metal, regulada por la identidad y dinámica de los aminoácidos de su entorno. La presente tesis tiene como objetivo aportar información microscópica acerca de los mecanismos de reacción de distintas hemoproteínas con moléculas pequeñas de relevancia biológica, como ser O2, H2 O2, NH2OH e hidropersulfuros, utilizando una combinación de técnicas de simulación computacional y experimentales, que incluyen, por un lado, dinámica molecular clásica (que abarca técnicas de muestreo demúltiples réplicas) e híbridas cuántico-clásicas (para el estudio de fenómenos reactivos), y por otro espectroscopía UV-visible, cinética de reacción utilizando un equipo flujo detenido y un electrodo sensible a HNO, recientemente desarrollado por el grupo donde fue realizada la presente tesis, para el seguimiento de su producción. En primer lugar fue estudiada —por técnicas de simulación—la unión de sustrato y el mecanismo de reacción de dos dioxigenasas hémicas, la indolamino 2,3-dioxigenasa y triptófano 2,3-dioxigenasa, mostrando cómo la dinámica de un loop flexible modula la actividad enzimática al regular la entrada/salida de sustrato. En segundo lugar, se estudió la producción de HNO debido a la peroxidación de hidroxilamina catalizada por mioglobina. Se utilizaron técnicas experimentales para caracterizar la cinética de reacción, y luego se analizó el mecanismo de reacción a través de métodos computacionales. Por último, se estudió experimentalmente la reacción de hidropersulfuros con mioglobina,mostrando la capacidad de los mismos de regular la reactividad del grupo hemo.

Las hemoproteínas son un conjunto ubicuo y extenso de proteínas, con una enorme diversidad funcional relacionada con la versátil reactividad del ion de hierro del grupo hemo. La gran mayoría de sus funciones biológicas involucran la unión de ligandos pequeños al metal, regulada por la identidad y dinámica de los aminoácidos de su entorno. La presente tesis tiene como objetivo aportar información microscópica acerca de los mecanismos de reacción de distintas hemoproteínas con moléculas pequeñas de relevancia biológica, como ser O2, H2 O2, NH2OH e hidropersulfuros, utilizando una combinación de técnicas de simulación computacional y experimentales, que incluyen, por un lado, dinámica molecular clásica (que abarca técnicas de muestreo demúltiples réplicas) e híbridas cuántico-clásicas (para el estudio de fenómenos reactivos), y por otro espectroscopía UV-visible, cinética de reacción utilizando un equipo flujo detenido y un electrodo sensible a HNO, recientemente desarrollado por el grupo donde fue realizada la presente tesis, para el seguimiento de su producción. En primer lugar fue estudiada —por técnicas de simulación—la unión de sustrato y el mecanismo de reacción de dos dioxigenasas hémicas, la indolamino 2,3-dioxigenasa y triptófano 2,3-dioxigenasa, mostrando cómo la dinámica de un loop flexible modula la actividad enzimática al regular la entrada/salida de sustrato. En segundo lugar, se estudió la producción de HNO debido a la peroxidación de hidroxilamina catalizada por mioglobina. Se utilizaron técnicas experimentales para caracterizar la cinética de reacción, y luego se analizó el mecanismo de reacción a través de métodos computacionales. Por último, se estudió experimentalmente la reacción de hidropersulfuros con mioglobina,mostrando la capacidad de los mismos de regular la reactividad del grupo hemo.

Los antibióticos β-lactámicos son la clase de antibiótico más utilizada. Sin embargo, el uso indiscriminado de antibióticos propulsó la generación de mecanismos de resistencia bacterianos. La diseminación global de esas estrategias entre bacterias de diferentes especies hace que los antibióticos conocidos se tornen ineficientes. Para restablecer la efectividad de los compuestos conocidos, se propone incorporar a los tratamientos inhibidores de los mecanismos de resistencia. El mecanismo más potente y mayormente empleado por las bacterias para hacer frente a la acción de antibióticos β-lactámicos es la producción de β-lactamasas. Estas enzimas hidrolizan el anillo β-lactama, dejando al compuesto inefectivo. Dentro de estas enzimas se encuentran las metalo-β-lactamasas (MβLs), que son enzimas dependientes de Zn(II), cuya relevancia clínica se debe a su capacidad para hidrolizar eficientemente los antibióticos β-lactámicos utilizados como último recurso, los carbapenemes. Al momento, no se cuenta con inhibidores de uso clínico para estas enzimas. Dentro de las MβLs, las enzimas de subclase B1 son las de mayor relevancia clínica. La enzima B1 New Dheli Metallo-β-Lactamase-1 (NDM-1), es una de MβLs de mayor relevancia clínica debido a su rápida diseminación y eficiente actividad carbapenemasa. Esta enzima posee dos iones metálicos en su sitio activo, ocupando los sitios conocidos como sitios 3H o 1 y DCH o 2. En el presente trabajo se propuso estudiar las características bioquímicas y biofísicas de esta enzima, el mecanismo por el cual cataliza la hidrólisis de carbapenemes y la relación entre la estructura su mecanismo catalítico.Se logró purificar a NDM-1 en forma soluble con buen rendimiento y contenido metálico. Esta enzima mostró ser eficiente al hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. La capacidad de unir Zn(II) fue medida por ensayos de competencia frente al quelante colorimétrico PAR. Estos ensayos mostraron que la incorporación de metal ocurre de manera secuencial, siendo mayor la afinidad por el primer ion metálico que por el segundo. Luego de la remoción del metal nativo, la enzima pudo incorporar Co(II) y Cd(II) en ambos sitios metálicos. Ambas proteínas metalo-sustituídas fueron activas, demostrando que estos metales pueden utilizarse como sondas espectroscópicas funcionales en esta enzima. El espectro de absorbancia de la proteína bi-Co(II)-NDM-1 mostró un patrón de 5 bandas de campo ligando (bandas d-d), propias de la coordinación de los iones metálicos en el sitio 3H, y una banda de transferencia de carga metal-ligando, producto de la interacción del Co(II) en el sitio DCH con la cisteína. La incorporación de Cd(II) a NDM-1 fue examinada por RMN de 113Cd(II). En el espectro se visualizaron dos bandas principales y cada una fue asignada a un sitio metálico. Estas señales fueron alteradas al incubar la enzima con el inhibidor de MβLs diseñado por el grupo, L-CS319, denotando que el compuesto interacciona con ambos metales al momento de su unión. Por lo tanto, estas enzimas pueden ser empleadas para estudiar cambios en la coordinación de los metales en el sitio activo durante procesos catalíticos o de unión de ligandos. En una segunda etapa, se estudió el mecanismo de hidrolisis de carbapenemes por NDM-1, utilizando técnicas de cinética rápida y diversas espectroscopias. Los datos obtenidos al estudiar el proceso de hidrólisis catalizado por bi-Zn(II)-NDM- y bi-Co(II)-NDM-1, revelaron que ambas enzimas emplean el mismo mecanismo de reacción. Este mecanismo es ramificado e incluye dos intermediarios de reacción productivos (EI1 y EI2). Sólo EI2 puede dar origen a un complejo EP estable. La formación de este complejo fue estudiada por titulación con sustrato hidrolizado en la enzima sustituida con Co(II). Los productos generados durante la hidrólisis de imipenem se estudiaron por RMN de 1H. En estos ensayos, se evidenció que la protonación era estereoselectiva y se concluyó que cada intermediario de reacción tendría que dar lugar a productos diferentes. La identidad de estas especies fue estudiada por cálculos computacionales. Por esta técnica, se comprobó que podría producirse la acumulación de especies intermediarias con carga negativa, cuya estabilidad dependería de la deslocalización de la carga y de interacciones con los iones metálicos. El pasaje de un intermediario a otro estaría marcado por la pérdida del agua coordinada a puente. Estudios recientes de nuestro grupo con las MβLs B2 Sfh-I y B3 GOB-18 (en su forma mono-metalada), revelaron que la hidrólisis de carbapenemes por estas enzimas cursa por medio del mismo mecanismo de reacción y que durante el proceso se acumulan intermediarios con características espectroscópicas similares a los observados en NDM-1. Estos resultados establecen al mecanismo catalítico como un punto de partida para el diseño racional de inhibidores activos frente a las tres subclases.El sitio activo de las MβLs B1 se encuentra rodeado por dos bucles, nombrados L3 y L10. Se ha reportado que el L3 tendría un papel fundamental en la primera interacción de la enzima con los sustratos y que ayudaría al posicionamiento de los mismos por medio de interacciones hidrofóbicas. Para evaluar la función de esta estructura en NDM-1, se generaron dos variantes en las que se intercambió el bucle nativo por el de enzimas de relevancia clínica de la misma subclase VIM-2 e IMP-1 (nombradas L3VIM y L3IMP), y una tercera variante en la que se insertó un residuo de prolina en la base del bucle (L3Pro). Las propiedades de estas variantes fueron evaluadas in bacteria e in vitro. Las variantes mostraron una disminución en su estabilidad y alteraciones en su afinidad por metal, siendo la variante L3VIM la que más se diferenció de la enzima salvaje. A diferencia de lo esperado, no se observaron grandes cambios en el perfil de sustrato de las variantes, pero si se evidenció una alteración en la acumulación de intermediarios de reacción durante la hidrólisis de nitrocefina y carbapenemes, indicando cambios en el mecanismo de reacción de las variantes. La vida media de los intermediarios fue mayor en L3IMP y menor en L3VIM y L3Pro. Fue posible resolver las estructuras de las enzimas L3IMP y L3Pro por cristalografía de rayos X. La mayor diferencia entre estas variantes fue la posición del L3 que, con respecto a la estructura de NDM-1, se encontraba más cerca del sitio activo en L3IMP y más alejado en L3Pro. Se encontró una correlación directa entre en tamaño del surco catalítico (modulado por la posición del bucle L3) y la acumulación de intermediarios de reacción: mientras más alejado del sitio activo se encontraba el L3, menor era la acumulación de los intermediarios. Este resultado indica que la secuencia de aminoácidos del L3 puede modular la vida media de los intermediarios, afectando el proceso de catálisis enzimática y estableciendo una correlación entre la estructura y la función en NDM-1.

Las benzodiacepinas se usan en la clínica como anticonvulsivantes, sedativos/hipnóticos, ansiolíticos y relajantes musculares; también producen amnesia anterógrada y son empleadas para facilitar la anestesia. El efecto terapéutico de las benzodiacepinas está mediado por la unión a un sitio específico en el receptor GABAA. Dado que en lugar de activar directamente al receptor las benzodiacepinas actúan estimulando las acciones del GABA endógeno, exhiben un gran índice terapéutico y baja toxicidad. Sin embargo, el consumo prolongado de benzodiacepinas induce tolerancia a la mayoría de sus efectos farmacológicos. El objetivo del presente trabajo fue analizar el mecanismo molecular de tolerancia a las benzodiacepinas, realizando estudios conductuales en combinación con análisis bioquímicos. Se estudió el efecto de administraciones diarias (1 inyección subcutánea por día) con vehículo o diacepam (15 mg/kg) en ratas durante 1 (tratamiento agudo), 7 o 14 días. Los estudios conductuales se llevaron a cabo 2 horas luego de la última inyección pues es el momento donde se alcanza la máxima concentración de diacepam en el plasma y el cerebro. El efecto ansiolítico de la benzodiacepina se determinó en el test del laberinto en cruz elevado, estimándolo como un aumento en el número de entradas y en el tiempo de permanencia en los brazos abiertos en relación al grupo de ratas administradas con vehículo. El efecto ansiolítico persistió luego del tratamiento con diacepam por 7 días pero fue abolido luego de la administración de 14 días. De este modo, la tolerancia a los efectos ansiolíticos del diacepam se detectó solamente luego del tratamiento más prolongado. El efecto sedativo del diacepam, estimado como una reducción en la actividad locomotora en el test del campo abierto comparado con animales tratados con vehículo, se observó luego del tratamiento agudo pero no se detectó luego de los tratamientos crónicos de 7 o 14 días. Por consiguiente, la tolerancia a los efectos sedativos se detectó luego de los dos tratamientos crónicos con diacepam. Estos resultados están de acuerdo con las evidencias previas que indican que la tolerancia a las benzodiacepinas se desarrolla con diferentes cursos temporales dependiendo del efecto farmacológico. Nuestros resultados mostraron que la concentración de diacepam en la corteza cerebral de las ratas no disminuyó luego de los dos tratamientos crónicos con la benzodiacepina con respecto al grupo de animales que recibió el tratamiento agudo, indicando que el proceso de tolerancia no está mediado por cambios en factores farmacocinéticos.

Las benzodiacepinas se usan en la clínica como anticonvulsivantes, sedativos/hipnóticos, ansiolíticos y relajantes musculares; también producen amnesia anterógrada y son empleadas para facilitar la anestesia. El efecto terapéutico de las benzodiacepinas está mediado por la unión a un sitio específico en el receptor GABAA. Dado que en lugar de activar directamente al receptor las benzodiacepinas actúan estimulando las acciones del GABA endógeno, exhiben un gran índice terapéutico y baja toxicidad. Sin embargo, el consumo prolongado de benzodiacepinas induce tolerancia a la mayoría de sus efectos farmacológicos. El objetivo del presente trabajo fue analizar el mecanismo molecular de tolerancia a las benzodiacepinas, realizando estudios conductuales en combinación con análisis bioquímicos. Se estudió el efecto de administraciones diarias (1 inyección subcutánea por día) con vehículo o diacepam (15 mg/kg) en ratas durante 1 (tratamiento agudo), 7 o 14 días. Los estudios conductuales se llevaron a cabo 2 horas luego de la última inyección pues es el momento donde se alcanza la máxima concentración de diacepam en el plasma y el cerebro. El efecto ansiolítico de la benzodiacepina se determinó en el test del laberinto en cruz elevado, estimándolo como un aumento en el número de entradas y en el tiempo de permanencia en los brazos abiertos en relación al grupo de ratas administradas con vehículo. El efecto ansiolítico persistió luego del tratamiento con diacepam por 7 días pero fue abolido luego de la administración de 14 días. De este modo, la tolerancia a los efectos ansiolíticos del diacepam se detectó solamente luego del tratamiento más prolongado. El efecto sedativo del diacepam, estimado como una reducción en la actividad locomotora en el test del campo abierto comparado con animales tratados con vehículo, se observó luego del tratamiento agudo pero no se detectó luego de los tratamientos crónicos de 7 o 14 días. Por consiguiente, la tolerancia a los efectos sedativos se detectó luego de los dos tratamientos crónicos con diacepam. Estos resultados están de acuerdo con las evidencias previas que indican que la tolerancia a las benzodiacepinas se desarrolla con diferentes cursos temporales dependiendo del efecto farmacológico. Nuestros resultados mostraron que la concentración de diacepam en la corteza cerebral de las ratas no disminuyó luego de los dos tratamientos crónicos con la benzodiacepina con respecto al grupo de animales que recibió el tratamiento agudo, indicando que el proceso de tolerancia no está mediado por cambios en factores farmacocinéticos.

El presente trabajo de tesis tiene por objetivo desarrollar una estrategia de control de la enfermedad psorosis de los cítricos mediante el uso de cítricos transgénicos resistentes a Citrus psorosis virus (CPsV), agente causal de la enfermedad. Para ello se trabajó con plantas de Citrus sinensis que expresaban un fragmento del gen que codifica para la proteína de cubierta de CPsV en una estructura de tipo hairpin (horquilla), inductora del silenciamiento génico. Este mecanismo otorgó a estas plantas transgénicas resistencia al virus, y en el contexto de esta tesis, se estudió la estabilidad de esta resistencia mediada por silenciamiento a lo largo del tiempo y de sus propagaciones vegetativas por injerto sobre un pie de Citrus jambhiri Lush. Se analizó además la transmisión del silenciamiento a través del injerto y el movimiento de sus señales a larga distancia. Finalmente se desafió a los injertos con CPsV para evaluar el impacto de la transmisión del silenciamiento sobre la resistencia al virus.

El cambio en la temperatura ambiental afecta a las reacciones biológicas y las células deben adaptarse. Un ejemplo de ello es la regulación de la fluidez de la membrana. Las bacterias pueden remodelar la fluidez de la bicapa con precisión a través de la incorporación de una mayor proporción de ácidos grasos insaturados cuando la temperatura de crecimiento disminuye, esto altera el ordenamiento de la bicapa lipídica y optimiza la fluidez. Pero, ¿cómo pueden las células "sensar" la fluidez de la membrana? La histidina quinasa DesK de Bacillus subtilis es el ejemplo paradigmático de un sensor térmico capaz de remodelar la fluidez de la membrana cuando la temperatura cae por debajo de 30 ° C, proporcionando un sistema para investigar el mecanismo de adaptación térmica. Entonces, ¿cuál es el mecanismo por el cual DesK es capaz de detectar cambios de temperatura y cómo puede convertir esta señal física externa en una respuesta biológica interna? Esta tesis estudia cómo la información térmica se integra, procesa y transduce para controlar la expresión génica y la intrigante posibilidad de que las deformaciones inducidas por la temperatura en la membrana celular actúen como reguladoras alostéricas. Como responsable del control por temperatura, encontramos una inestabilidad incorporada al sistema causada por un grupo de residuos hidrofílicos situados cerca del extremo N-terminal del primer segmento transmembrana, presumiblemente justo debajo de la interfase lípido/agua. Estos residuos enterrados en la fase lipídica a baja temperatura son capaces de bucear a la fase acuosa, estabilizando la posición del segmento transmembrana como una boya. En el extremo C-terminal de la parte transmembrana se detectó otro motivo sensible a la temperatura: el Cierre de Serina. El grosor de la membrana controla el estado de señalización del sensor al dictar el nivel de hidratación de este motivo hidrofílico metaestable. Nuestros resultados revelaron que DesK funciona como un dímero, en el que el motivo boya N-terminal actúa junto con un motivo hidrófilo C-terminal para causar una reorientación de las hélices en respuesta a cambios en el espesor de la membrana, dirigiendo la activación proteica. Sin embargo, la pregunta subyacente aún se mantiene: ¿Cómo puede la información detectada por la región transmembrana convertirse en un reordenamiento en el dominio catalítico citoplasmático para controlar la actividad de DesK? Aquí, identificamos una "región linker" implicada en la transmisión de la señal que conecta el transmembrana con el dominio citoplasmático. El linker adopta dos estados conformacionales en respuesta a los cambios de espesor de la membrana dependientes de la temperatura: (i) random coil, unido a las cabezas de los fosfolípidos, promoviendo el estado de la fosfatasa o (ii) no unido, formando una hélice continua que atraviesa la región de la membrana hasta el citoplasma, promoviendo así el estado quinasa. Nuestros resultados sostienen la idea de que el linker está dotado de una dualidad conformacional hélice/random coil que permite que se comporte como un interruptor de transmisión, con una discontinuidad en la hélice disminuyendo la relación de actividad quinasa/fosfatasa, como se requiere para modular la respuesta de DesK.

El objetivo del presente trabajo de Tesis se enfoca en el estudio de la degradación de distintos compuestos aromáticos mediante técnicas tipo Fenton y relacionadas. La posibilidad de aplicación de las técnicas PAOs implica la comprensión de las variables que determinan la eficiencia del proceso. La información disponible en la literatura especializada muestra que los procesos de oxidación avanzados son apropiados para el tratamiento de contaminantes orgánicos en solución. Sin embargo hasta el presente la información publicada acerca de la influencia de las condiciones de trabajo en la eficiencia y la cinética de estos procesos es generalmente incompleta. El diseño y optimización de técnicas para el tratamiento de efluentes a escala industrial requiere del conocimiento y la comprensión de los principales factores que regulan la eficiencia de los métodos de oxidación. En este marco, la adopción de una determinada técnica requiere del compromiso entre una mayor eficiencia y un menor costo. Por este motivo en la búsqueda de alternativas económicamente viables y un adecuado control de los factores que determinan la velocidad de mineralización, es crucial poseer un entendimiento cinético y mecanístico de los procesos involucrados. En este sentido, establecer correlaciones entre estructura y reactividad química de los sustratos e intermediarios de reacción es esencial para la comprensión y el modelado de este tipo sistemas. Los objetivos generales relacionados con este trabajo de tesis están encaminados hacia: a) El estudio de mecanismos de reacción y la influencia de las condiciones de trabajo en la cinética de las reacciones tipo Fenton, Electro-Fenton y Foto-Electro-Fenton para la degradación de contaminantes. b) El modelado físico-matemático de los sistemas estudiados. c) La búsqueda de correlaciones entre estructura molecular de los sustratos e intermediarios de reacción y su eficiencia de degradación.

El malato es un compuesto C4 que participa en procesos metabólicos claves para las plantas tales como fotosíntesis, respiración, regulación del pH celular, apertura estomática, nutrición y respuestas de defensa. Su importancia en la fisiología de plantas C3 hace necesario el estudio de las proteínas involucradas en su metabolismo. Entre ellas se encuentra la enzima málica (EM), que cataliza la descarboxilación oxidativa de malato a piruvato y CO2, con la concomitante reducción de NAD(P). En este trabajo se planteó como objetivo general estudiar el metabolismo del malato en plantas de A. thaliana utilizando líneas con potenciales cambios en la abundancia de este ácido C4 dadas por alteraciones en los niveles de enzima málica, en condiciones normales de crecimiento y ante diversas situaciones de estrés. Plantas de Arabidopsis mutantes y sobreexpresantes en la isoforma EM-NADP2 mostraron alteraciones en los perfiles metabólicos y redox, los cuales reflejan una gran relevancia de esta enzima en la homeostasis vegetal. Estos cambios afectaron de manera diferencial a procesos celulares diurnos y nocturnos. A su vez, el aumento de la actividad de EM-NADP2 afectó el desarrollo de la planta y provocó una mayor sensibilidad a condiciones de estrés osmótico. Además, una línea mutante en el gen que codifica para EM-NADP1 mostró una incrementada tolerancia a la exposición a aluminio, indicando que dicha enzima podría estar implicada en el mecanismo de respuesta a este tipo de estrés, regulando los niveles citosólicos de malato en raíces y/o afectando las vías de señalización involucradas. Finalmente, se estudió la posible participación de las isoformas EM-NAD(P) de A. thaliana en la síntesis de malato in vivo. Experimentos de complementación utilizando cepas de levadura mutantes permitieron determinar que las isoformas EM-NADP1-3, todas ellas de localización citosólica, son capaces de asumir un rol anaplerótico en un contexto celular. La carboxilación de piruvato pudo ser medida en extractos vegetales, siendo EM-NADP2 la isoforma que más contribuye a esta actividad en hojas.

Fil:Cantore de Ezcurra, María Leonor. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.