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SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine) es una proteína extracelular asociada a tejidos que presentan altas tasas de proliferación celular y remodelación de la matriz. En este trabajo se muestra que las lineas celulares de melanoma humano IIB-MEL-LES, IIB-MEL-IAN e IIB-MEL-J así como varios melanomas humanos metastásicos expresan altos niveles de la proteína y del ARNm de SPARC. Mediante análisis por Western Blot, detectamos una única banda de 42 kDa secretada in vitro por fibroblastos diploides humanos y un doblete de 40 a 45 kDa secretado por las tres líneas celulares de melanoma y en todos los melanomas metastásicos testeados. Algunas de las muestras de melanomas y de las líneas celulares mostraron un doblete adicional de 34-36 kDa. El ARNm de SPARC fue detectado por ensayos de northern blot en las tres líneas de melanoma estudiadas, en las l4 muestras de melanomas metastásicos y en los tumores inducidos en ratones atímicos. El patrón heterogéneo de SPARC secretado por las células de melanoma humano es resultado de la glicosilación post-traduccional y de un clivaje extracelular específico. A diferencia de lo que sucede con los fibroblastos humanos, las células de melanoma no sobreexpresaron SPARC luego del agregado de TGF-β. El análisis inmunohistoquímico demostró que SPARC se expresó fuertemente en el 100% de los melanomas primarios (7/7) y metastásicos (29/29), con moderación en la mayoría de los nevos displásicos positivos (13/14) y débilmente en los nevos benignos (4/25). No se detectó expresión de SPARC en melanocitos normales. Los datos sugieren que la expresión de de esta proteína está asociada a la progresión neoplásica del melanoma humano. En el presente trabajo también se describe la supresión parcial de la expresion de SPARC en 2 líneas de melanoma humano utilizando un vector de expresión con la secuencia antisentido para SPARC. La reducción de los niveles de expresión de esta proteína dio como resultado una reducción en la capacidad adhesiva e invasiva in vitro de las células tumorales sobre membranas basales reconstituídas, eliminando completamente su capacidad tumorigénica in vivo. Esta es la primera evidencia de que SPARC desempeña un papel clave la progresión del melanoma humano.

La autofagia es un proceso de degradación de componentes citoplasmáticos que en algunos casos puede jugar un rol citoprotectivo, mientras que en otros puede llevar a la muerte celular. En trabajos previos hemos descripto a la proteína transmembrana VMP1, la cual se encuentra inducida en la pancreatitis experimental. Con el objetivo de determinar su función, se estudió su participación en el proceso de autofagia. Los resultados obtenidos en esta tesis demostraron que la sobreexpresión de VMP1 induce autofagia en células cultivadas en un medio rico en nutrientes. Además, VMP1 está involucrada en la autofagia inducida por ayuno y rapamicina. Más aún, el silenciamiento de VMP1 inhibe la formación de autofagosomas por el tratamiento con ayuno o rapamicina sugiriendo que VMP1 es necesaria para la autofagia. Aún no ha sido esclarecido el rol de la autofagia en el cáncer de páncreas. Los estudios desarrollados en este trabajo sobre la autofagia y VMP1 en el cáncer de páncreas, indican que el tratamiento con gemcitabina induce autofagia en las líneas celulares de cáncer de páncreas PANC-1 y MIAPaCa-2, y que este proceso promueve la muerte celular por apoptosis. La inhibición de la autofagia con 3-metiladenina redujo significativamente el porcentaje de células apoptóticas en respuesta a la gemcitabina. También se observó que la gemcitabina induce la expresión temprana de VMP1, que el silenciamiento de VMP1 disminuye la apoptosis inducida por este agente quimioterapéutico y que la sobreexpresión de VMP1 aumenta significativamente el porcentaje de células apoptóticas. Estos resultados demuestran que la vía de autofagia mediada por VMP1 participa en la muerte celular por apoptosis inducida por gemcitabina. Con el objetivo de profundizar el estudio de los mecanismos moleculares mediante los cuales VMP1 interviene en la sobrevida o muerte celular, se buscaron interactores de esta proteína utilizando la estrategia de doble híbrido. Se demostró que VMP1 interacciona con S100A10, un miembro de la familia de proteinas S100 que se encontró sobreexpresado en adenocarcinomas pancreáticos. También se observó que la expresión basal del mRNA de S100A10 en las células MIAPaCa-2 es mayor que en las células HeLa. S100A10 se induce bajo estímulos autofágicos, como el tratamiento de ayuno y la gemcitabina, en células HeLa, pero no en las células tumorales MIAPaCa-2, sugiriendo que en estas su expresión se encuentra desregulada. El análisis del rol de la interacción VMP1-S100A10 en las células tumorales mostró que la sobreexpresión de VMP1 induce la expresión del mRNA de S100A10, sugiriendo que S100A10 forma parte de la respuesta celular mediada por VMP1. Cuando la proteína sobreexpresada es S100A10, se modifica la distribución intracelular de VMP1, disminuyendo su patrón punteado característico y aumentando la distribución en una estructura reticulada semejante al retículo endoplásmico. Finalmente se investigó la participación de S100A10 en el proceso de autofagia mediado por VMP1. Se observó que la sobreexpresión de S100A10 disminuye la formación de autofagosomas tanto en respuesta al tratamiento con gemcitabina como ante la inducción directa por la sobreexpresión de VMP1. Se determinó también que S100A10 reduce la apoptosis inducida por gemcitabina, ya que su silenciamiento aumentó la apoptosis causada por este agente quimioterapéutico. Por lo tanto, la expresión de S100A10 disminuye la autofagia y la apoptosis mediadas por VMP1, favoreciendo la resistencia a la muerte de las células de cáncer de páncreas. Los resultados de este trabajo contribuyen a elucidar el rol de la autofagia en el cáncer de páncreas, señalando a la autofagia mediada por VMP1 como un mecanismo molecular que conduce a la muerte por apoptosis de las células neoplásicas de origen pancreático, y a la proteína S100A10 como un mecanismo posible de supervivencia de las células de cáncer de páncreas, que actúa disminuyendo la capacidad de desarrollar autofagia y apoptosis. En base a los resultados obtenidos, proponemos a la vía de autofagia mediada por VMP1 como posible blanco para el estudio de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de páncreas.

Estudio del rol de la vía de PD-1 sobre la respuesta inmune de células NK y de los mecanismos inmunológicos inducidos por las células Th9 frente a la infección por M. tuberculosis La tuberculosis continúa siendo un grave problema de salud a nivel mundial a pesar de los tratamientos disponibles. Se estima que un tercio de la población mundial se encuentra infectada de manera asintomática con Mycobacterium tuberculosis, constituyendo un enorme reservorio de la bacteria. Ante eventos de inmuno-supresión, esos individuos pueden desarrollar enfermedad activa y transmitirla. La respuesta inmune frente a M. tuberculosis, requiere la inducción de un perfil de citoquinas de tipo Th1, donde el IFN-γ posee un rol fundamental. Sin embargo, actualmente se sabe que el IFN-γ no sería suficiente para controlar y erradicar completamente al patógeno del organismo hospedero. Por ello, resulta de crucial importancia para el desarrollo de nuevos tratamientos, vacunas y métodos de diagnóstico, conocer las bases moleculares y celulares que conllevan a la generación del correcto balance de poblaciones celulares efectoras durante la respuesta inmune contra el microorganismo. Así como dilucidar la interacción de proteínas específicas de la bacteria con las células del hospedero y, más aún, los mecanismos moleculares que involucran estas interacciones. Por lo mencionado, en este trabajo se investigó el rol de ciertas citoquinas, moléculas coestimulatorias e inmunomoduladores sobre las funciones efectoras de células NK y de linfocitos T durante la tuberculosis activa. Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que la molécula coestimulatoria PD-1 inhibe la respuesta de citoquinas Th1 frente a M. tuberculosis. Sin embargo, el rol de este receptor en la respuesta inmune innata durante la tuberculosis se desconocía. Por ello, en este trabajo se evaluó la expresión y función de los miembros de la vía de PD-1 en las células NK de pacientes con tuberculosis activa. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron por primera vez que las células NK humanas expresan constitutivamente los tres miembros de esta vía de señalización: el receptor PD-1 y sus dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. Más aún, demostramos que la estimulación con antígeno de M. tuberculosis incrementa la expresión de estas tres moléculas en células NK y que la señalización a través de las mismas inhibe la producción de IFN-γ y la citotoxicidad de estas células. A su vez, los datos obtenidos en este trabajo demostraron que M. tuberculosis induce la expansión de células T productoras de IL-9 con fenotipo característico de la subpoblación linfocitaria Th9. De acuerdo a nuestros resultados, la IL-9 producida colaboraría en la generación de un perfil Th1 durante la enfermedad activa, promoviendo así la producción de IFN-γ frente a M. tuberculosis. Finalmente, estudiamos la interacción de la proteína específica de M. tuberculosis, ESAT-6, con células T humanas y el efecto de ESAT-6 sobre la producción de IL-9 durante la tuberculosis humana. Caracterizamos la cinética de esta interacción y además identificamos tres proteínas linfocitarias que interactúan con ESAT-6. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el uso de anticuerpos bloqueantes y agonistas podría tener importantes implicancias en potenciales terapias para combatir infecciones bacterianas crónicas como la tuberculosis. Por otro lado, demostramos que ESAT-6 se une a linfocitos T humanos, ingresa a las células e interacciona con proteínas involucradas en el procesamiento y en la estabilidad de ARNm específicos. Este podría entonces tratarse de un mecanismo por el cual ESAT-6 modularía las funciones efectoras de linfocitos T, como lo es la producción de citoquinas, como factor de virulencia o mecanismo de evasión de la respuesta inmune por parte del patógeno.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2021

Anadenanthera colubrina var. cebil constituye un recurso forestal nativo Sudamericano el cual presenta una distribución discontinua en Argentina, restringiéndose su presencia a las provincias biogeográficas paranaense y de las Yungas. La hipótesis sobre la cual se sustentó el presente trabajo sostiene que el flujo génico homogeneiza las frecuencias génicas entre las poblaciones contrarrestando los efectos de la deriva genética provocados por la fragmentación. Los objetivos generales de este trabajo fueron: indagar acerca del rol evolutivo del flujo génico y de la deriva genética como fuerzas modeladoras de las frecuencias génicas en las poblaciones fragmentadas y determinar la importancia del movimiento de los alelos a través de la dispersión de las semillas y del polen. Se emplearon marcadores moleculares selectivamente neutros de herencia biparental, microsatélites nucleares, y de herencia uniparental, microsatélites cloroplásticos.

Anadenanthera colubrina var. cebil constituye un recurso forestal nativo Sudamericano el cual presenta una distribución discontinua en Argentina, restringiéndose su presencia a las provincias biogeográficas paranaense y de las Yungas. La hipótesis sobre la cual se sustentó el presente trabajo sostiene que el flujo génico homogeneiza las frecuencias génicas entre las poblaciones contrarrestando los efectos de la deriva genética provocados por la fragmentación. Los objetivos generales de este trabajo fueron: indagar acerca del rol evolutivo del flujo génico y de la deriva genética como fuerzas modeladoras de las frecuencias génicas en las poblaciones fragmentadas y determinar la importancia del movimiento de los alelos a través de la dispersión de las semillas y del polen. Se emplearon marcadores moleculares selectivamente neutros de herencia biparental, microsatélites nucleares, y de herencia uniparental, microsatélites cloroplásticos.

Los ganglios basales son una cadena de núcleos subcorticales que facilitan la coordinación motora. Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra pars compacta modulan la actividad de de las neuronas GABAérgicas del estriado que son inervadas por la corteza motora. En el estriado conviven dos tipos de neuronas GABAérgicas. Las de la vía directa, que expresan los receptores dopaminérgicos D1 estimulando los movimientos y las de la vía indirecta, que expresan los receptores dopaminérgicos del tipo D2, cuya función es inhibir los movimientos. Para la iniciación de los movimientos se requiere la activación conjunta de ambas vías. La enfermedad de Parkinson es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común. Se caracteriza por la muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas, la cual genera fallas en la coordinación motora, defectos en la postura y problemas para el inicio de los movimientos. La enfermedad de parkinson está caracterizada patológicamente por el agregado intracelular de los cuerpos de Lewy (formados por α-synucleína) y los ovillos neurofibrilares (formados por la proteína tau en estado hiperfosforilado). Estas marcas de patología sugieren que defectos en el sistema de transporte axonal podrían estar involucrados en la enfermedad. Las neuronas dopaminérgicas son células con una alta polarización que les permite conectar con neuronas localizadas a grandes distancias. Esta polarización las hace depender de un complejo sistema de transporte compuesto por microtúbulos, motores moleculares y cargas. Kinesina-1 es un motor molecular anterógrado que lleva las cargas hacia el cono axonal. Es un heterotetrámero de dos subunidades pesadas (KHC) que interactúan con los microtúbulos y dos subunidades livianas (KLC) que interactúan con las cargas directamente o a través de proteínas adaptadoras. Existen tres genes que codifican para KHC, kif5a y kif5c que se expresan en el sistema nervioso y kif5b de expresión ubicua. Trabajos previos demostraron que ratones con defectos en la expresión del motor molecular KLC1 desarrollan patologías axonales con agregados de proteínas. Por otro lado, la deleción de kif5b resulta letal y los ratones knockout mueren en el día embrionario 11.5 sin embargo su rol específico en el sistema nervioso no está esclarecido. El objetivo de este trabajo es estudiar el rol específico de la subunidad Kif5b del motor molecular Kinesina-1 en la vía nigroestriatal. Se generaron ratones con deleción de la expresión del motor molecular kif5b de forma condicional en neuronas del sistema nervioso central, usando el sistema cre-loxp dirigido mediante el promotor de nestina (5b fl/fl nes cre/+) para cumplir este objetivo. Experimentos de análisis del movimiento en el campo abierto y en el rotarod determinaron que los ratones 5b fl/fl nes cre/+ presentan fallas en su actividad exploratoria y defectos en la coordinación motora. Por su parte, los niveles de dopamina no se habían visto afectados, sin embargo hubo una disminución en los niveles de degradación de dopamina, evidenciándose en una menor concentración del producto de degradación dopac. Estos resultados sugirieron un rol importante del motor kif5b en la vía nigroestriatal y en el metabolismo de dopamina. Para testear si los defectos en el metabolismo de dopamina eran la causa de los defectos en la locomoción se realizó una deleción condicional de kif5b específicamente en neuronas dopaminérgicas. Sorprendentemente, la deleción de Kif5b específica no indujo alteraciones en la respuesta locomotora sugiriendo que los defectos presinápticos no son suficientes para evidenciar defectos de coordinación o hipolocomoción. Para comprender si fallas en la locomoción se debían a problemas en la liberación de dopamina, esta se estimuló mediante la inyección de los ratones 5b fl/fl nes cre/+ con anfetamina. La estimulación con anfetamina, indujo un incremento en la distancia recorrida en ambos genotipos, permitiendo a los ratones 5b fl/fl nes cre/+ alcanzarla distancia obtenida por los ratones control estimulados. Para determinar si la actividad de las vías directa e indirectas del estriado se encontraban afectadas por la deleción de kif5b se analizó la motricidad de los ratones en el campo abierto, utilizando agonistas y antagonistas de los receptores D1 y D2. El antagonista de los receptores D1 (SCH 23390) y el agonista de los receptores D2 (quinpirole) disminuyeron la distancia recorrida en los ratones 5b fl/fl nes cre/+ y control. Sin embargo, bajo la estimulación con anfetamina, los ratones 5b fl/fl nes cre/+ resultaron insensibles al tratamiento con quinpirole o con un antagonista de los receptores D2 (risperidona), mientras que si se observó una respuesta en los animales control. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la expresión de kif5b es necesaria para el correcto recambio de dopamina y para la presentación de los receptores D2 en la membrana plasmática de las neuronas estriatales permitiendo el correcto desarrollo de la capacidad motora. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo, sugerimos que kif5b tiene un rol específico en el metabolismo de dopamina a la vez que su expresión es necesaria para la actividad de los receptores dopaminérgicos del tipo D2. Kif5b es imprescindible para el correcto funcionamiento de la vía nigroestriatal y la locomoción.

La superfamilia Romboide reúne un conjunto de genes que codifican para proteínas de transmembrana multipaso que se encuentran conservadas evolutivamente en todas las ramas del árbol filogenético. Estas proteínas se agrupan según su función en: serina-proteasas y pseudoproteasas. En los seres humanos se reconocen 14 genes romboides, los cuales se encuentran involucrados en diversos procesos biológicos tales como: respuesta al estrés del retículo endoplasmático, apoptosis, proliferación y migración celular. Además, han sido asociados con diversas patologías humanas como la enfermedad de Parkinson, la artritis reumatoidea y las neoplasias malignas. El presente trabajo se centró en el estudio de Rhomboid domain containing 2 (RHBDD2) a nivel génico, transcripcional y proteico, y su rol en el cáncer de mama. Para ello, se analizó su expresión a nivel transcripcional/proteica y se realizaron ensayos de silenciamiento post-transcripcional de RHBDD2 para determinar su rol funcional. Se emplearon líneas celulares de cáncer de mama, muestras de tejidos mamarios normales y neoplásicos malignos, así como un modelo de diferenciación celular de la glándula mamaria de ratón. Se demostró que RHBDD2 se sobreexpresa en carcinomas ductales infiltrantes humanos, tanto a nivel transcripcional como proteico (p<0,05), principalmente en el subtipo Luminal B de cáncer de mama (p=0,007). Su alta expresión se encontró asociada con estadíos avanzados de la enfermedad (p<0,05) y con la ausencia del receptor de progesterona (p=0,002). Además, se determinó que RHBDD2 se localiza en el aparato de Golgi en líneas celulares de cáncer de mama (Coef. de Pearson > 0,7). Por otra parte, se comprobó que el gen RHBDD2 codifica para dos variantes transcripcionales: la variante 1 (exones: I, III, IV, V) y la variante 2 (exones: I, II, III, IV, V) así como sus respectivos productos proteicos. Por su parte la variante 2 se expresa con mayor frecuencia y cantidad en los carcinomas mamarios respecto a los tejidos mamarios normales (p<0,05), encontrándose asociado a un pronóstico desfavorable de la enfermedad. Finalmente, el análisis de los datos de microarreglos de expresión génica diferencial en respuesta al silenciamiento de RHBDD2 así como los ensayos in vitro sobre líneas celulares humanas y murinas, sugirieron que RHBDD2 se encontraría involucrado en los procesos de proliferación y diferenciación celular.

La ghrelina es una hormona peptídica producida principalmente en el estómago que desempeña un papel fundamental en el control de la liberación de hormona de crecimiento, la homeostasis de glucosa, la actividad de ejes neuroendócrinos, el peso corporal, entre otros. La concentración plasmática de ghrelina aumenta en condiciones de balance energético negativo como el ayuno o la restricción calórica. El receptor de ghrelina (GHSR) está presente en varios sitios del hipotálamo importantes en el control del apetito o de los ejes neuroendocrinos. Una de las particularidades de GHSR es que posee una elevada actividad basal, la cual causa una elevada señalización intracelular constitutiva aún en ausencia de ghrelina. El hecho que el receptor de ghrelina esté presente en áreas del hipotálamo sin acceso inmediato a la hormona circulante y que su nivel de expresión génica aumente en condiciones de balance energético negativo, han llevado a sugerir que la actividad constitutiva del receptor poseería un rol fisiológico. Sin embargo, la regulación de la expresión de GHSR en el hipotálamo y sus implicancias fisiológicas no han sido sistemáticamente estudiadas hasta ahora. Por este motivo, el objetivo general del presente plan de Tesis Doctoral es investigar la regulación de la expresión del receptor de ghrelina a nivel hipotalámico en condiciones de balance energético negativo y sus implicancias en la regulación del apetito y del eje neuroendocrino hipotálamo-hipófiso-adrenal.

La ghrelina es una hormona peptídica producida principalmente en el estómago que desempeña un papel fundamental en el control de la liberación de hormona de crecimiento, la homeostasis de glucosa, la actividad de ejes neuroendócrinos, el peso corporal, entre otros. La concentración plasmática de ghrelina aumenta en condiciones de balance energético negativo como el ayuno o la restricción calórica. El receptor de ghrelina (GHSR) está presente en varios sitios del hipotálamo importantes en el control del apetito o de los ejes neuroendocrinos. Una de las particularidades de GHSR es que posee una elevada actividad basal, la cual causa una elevada señalización intracelular constitutiva aún en ausencia de ghrelina. El hecho que el receptor de ghrelina esté presente en áreas del hipotálamo sin acceso inmediato a la hormona circulante y que su nivel de expresión génica aumente en condiciones de balance energético negativo, han llevado a sugerir que la actividad constitutiva del receptor poseería un rol fisiológico. Sin embargo, la regulación de la expresión de GHSR en el hipotálamo y sus implicancias fisiológicas no han sido sistemáticamente estudiadas hasta ahora. Por este motivo, el objetivo general del presente plan de Tesis Doctoral es investigar la regulación de la expresión del receptor de ghrelina a nivel hipotalámico en condiciones de balance energético negativo y sus implicancias en la regulación del apetito y del eje neuroendocrino hipotálamo-hipófiso-adrenal.