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Las neoplasias de la glándula mamaria representan el tumor más frecuente en perras enteras, siendo la edad media de aparición entre los 8 y 10 años. Las hormonas esteroides sexuales, principalmente estrógenos y progesterona, representan el principal factor de riesgo para su desarrollo, y la castración antes del segundo celo reduce el riesgo de aparición de esta neoplasia. Se ha demostrado la presencia de receptores a estrógenos (RE) y progesterona (RP) en los tumores mamarios caninos, siendo esta expresión mayor en tumores benignos comparada con tumores malignos. Sin embargo, la asociación de los RE y RP con factores clínico - patológicos, así como su valor pronóstico, se encuentran en discusión. Por otra parte, algunos estudios en humanos han revelado que además de las clásicas hormonas sexuales, otras hormonas parecen estar involucradas en el desarrollo y/o progresión de esta neoplasia. Así, se ha demostrado la presencia de los péptidos oxitocina y vasopresina, así como de sus receptores en líneas celulares de cáncer mamario humano y en carcinomas primarios de mama humanos. En la perra, al momento se desconoce la presencia de receptores a estas hormonas en los tumores mamarios caninos. La extirpación quirúrgica del tumor representa el tratamiento de elección para todas aquellas perras con neoplasias mamarias. Sin embargo, existe un elevado número de pacientes en los que la cirugía no es suficiente para lograr la curación, o pacientes en los que la realización de la cirugía no es posible, por lo que se hace necesaria la búsqueda de terapias adyuvantes a la cirugía o paliativas. Trabajos sobre líneas celulares de cáncer mamario humano, así como estudios in vivo sobre modelos murinos de cáncer mamario, han demostrado que la oxitocina y la desmopresina (análogo sintético de la hormona vasopresina) tienen la capacidad de modular el crecimiento de las células tumorales. En la perra, al momento se desconocen los efectos de estos péptidos sobre líneas de cáncer mamario canino. Por lo tanto, la presente tesis de doctorado tuvo como objetivo general aportar conocimientos acerca de la influencia del componente hormonal sobre el desarrollo de los tumores mamarios caninos, mediante el estudio de la población de receptores a hormonas esteroideas, oxitocina y vasopresina en el tejido mamario tumoral canino y la evaluación de los posibles efectos antitumorales de péptidos en una línea celular de cáncer mamario canino. En la primera parte de la tesis doctoral se realizó una caracterización clínica y patológica de los tumores mamarios caninos recolectados. El estudio reveló una edad promedio de aparición de esta neoplasia de 9,4 años, indicando que ocurre mayormente en perras de edad media a adulta. Asimismo, la mayor parte de las perras se encontraban enteras al momento del diagnóstico, lo cual brinda mayor sustento al rol fundamental que tienen las hormonas esteroides sexuales en el desarrollo de los tumores mamarios. El análisis histológico mostró que el 60% de las neoplasias fue de naturaleza maligna, siendo el carcinoma túbulo-papilar el más frecuentemente diagnosticado. El restante 40% de los tumores fue de naturaleza benigna, siendo el adenoma (simple y complejo) el tipo más comúnmente hallado. El estudio inmunohistoquímico del receptor a estrógenos α (REα) permitió visualizar una mayor expresión en tumores benignos en comparación con malignos. Asimismo, en el grupo de tumores malignos, se observó una mayor expresión en carcinomas del tipo túbulo-papilar, así como en carcinomas de Grado Histológico de Malignidad (GHM) I. Estos resultados dan mayor sustento a la hipótesis de que la presencia del REα se pierde conforme el tumor progresa hacia la malignidad, y que su expresión en tumores malignos se relaciona con características de baja malignidad tumoral. También se estudió la expresión del receptor a estrógenos β (REβ), observándose que su expresión ocurrió de manera similar tanto en tumores mamarios benignos como malignos. Dado que no se observó asociación alguna con los factores de valor pronóstico analizados para tumores malignos, en la presente tesis no se pudo establecer su rol en las neoplasias mamarias en caninos. Además, se estudió la presencia del RP en tumores mamarios benignos y malignos, observándose una baja expresión en ambos tipos tumorales. Cuando se evaluó su asociación con los factores clínico-patológicos, se observó una mayor expresión del RP en perras que se encontraban en estadíos clínicos IV y V, permitiendo sugerir que los agentes antiprogestágenos podrían ser de utilidad en casos de cáncer mamario avanzado. Por otro lado, en la segunda parte de la presente tesis se demostró la presencia del receptor a oxitocina (ROT) en los tumores mamarios caninos analizados, hallazgo que representa el primer reporte acerca de la expresión de este receptor en esta neoplasia en la especia canina. El ROT se expresó tanto en tumores benignos como malignos, y en estos últimos, su expresión fue mayor en carcinomas de GHM I y II, y tendió a ser mayor en los tumores malignos positivos para el REα. Sin bien se necesitan mayores estudios al respecto, se podría especular que, al igual que ocurre con otros receptores a hormonas, la presencia del ROT en el tumor estaría asociada con factores indicadores de buen pronóstico. Del mismo modo, los resultados del estudio inmunohistoquímico para el receptor a vasopresina V2 (RAVP V2) revelaron que el total de los tumores mamarios caninos analizados resultaron positivos a este receptor, siendo su expresión elevada en todos los casos. Para nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se reporta la presencia de este receptor en las neoplasias mamarias en caninos, y reviste importancia a la hora de utilizar moléculas como la desmopresina, con efectos antitumorales y antimetastásicos conocidos, cuyas acciones se ejercen a través del RAVP V2. Considerando la necesidad de investigar nuevas y más eficaces alternativas terapéuticas para el tratamiento de los tumores mamarios en caninos, en la tercera parte de la presente tesis se evaluó la capacidad antitumoral de los péptidos oxitocina y desmopresina sobre una línea celular de cáncer mamario canino. De forma previa a la realización de los ensayos in vitro, se evaluó la presencia del receptor a oxitocina y vasopresina V2 en la línea celular CMT-U27 de cáncer mamario canino, ya que son los sitios de unión para ejercer su acción que utilizan la oxitocina y la desmopresina, respectivamente. Las células tumorales mostraron expresión para ambos receptores, lo cual demuestra que esta línea celular es óptima para evaluar el efecto de estos péptidos. En el ensayo in vitro se observó que la administración de oxitocina a dosis 1000 nM inhibió la proliferación de la línea CMT-U27, lo cual coincide con reportes previos en humanos, y permite sugerir que esta hormona ejerce efectos moduladores del crecimiento de las células tumorales. Por último, se demostró que la desmopresina (1000 nM) ejerció un efecto inhibidor del crecimiento de la línea celular CMT-U27. Por tanto, la observación de una alta expresión del ROT y RAVP V2 en los tumores mamarios caninos, sumado al efecto antiproliferativo que ejercieron la oxitocina y desmopresina en una línea celular de cáncer mamario canino, permiten recomendar que se considere a estos compuestos como una opción interesante para el tratamiento de los tumores mamarios caninos, y resulta de utilidad para continuar investigando péptidos análogos a ellos con mayor capacidad antiproliferativa.

La porfobilinógeno-deaminasa (PBG-D) cataliza la condensación de cuatro moléculas de porfobilinógeno (PBG) para formar el hidroximetilbilano, el cual en presencia de la enzima isomerasa, origina el uroporfirinógeno m, precursor fisiológico en la síntesis de hemos, clorofilas y corrinas. Dado que bajo ciertas condiciones, la PBG-D podría actuar como segundo sitio de regulación, se resolvió estudiar la PBG-D de hígado y de riñón de rata, con un enfoque cinético. Se purificaron ambas enzimas empleando las siguientes técnicas: fraccionamiento con sulfato de amonio, filtración molecular (Sephadex G-lOO), intercambio aniónico (Q-Sepharosa) y cromatografla de afinidad (Blue Sepharosa). La purificación a homogeneidad de la enzima renal se logró mediante una electroforesis preparativa, que mostró una sola banda proteica con actividad, confirmada a través de Western blots. La actividad máxima se detectó en incubaciones a 65°C, a pH’s 7,8 y 8,2 con una energía de activación calculada de 16,8 kcal/mol y 19,3 kcal/mol y se detemiinaron las masas moleculares relativas: 41,7 ± 4,2 kDa y 39,8 ± 4,0 kDa para las enzimas hepática y renal respectivamente. La PBG-D de hígado de rata presenta un comportamiento michaeliano, con valores aparentes de Km y Vm de 12 ± 1,4 μM y 17,0 ± l,4 pmoles/mg.min. respectivamente y un n de Hill de 1, determinados a pH 8,2 y a 37°C. Estudios cinéticos revelaron que los iones Mg2+ (0-80 mM) y fosfato (0-20 mM) actúan como inhibidores incompetitivos, mientras que el amonio (0-50 mM) y la sulfarnerazina (0-2,0 mM) son inhidores no competitivos. En cambio, el ácido fólico (0-2,0 mM) actúa como un activador no esencial de la reacción. Para la enzima renal, los estudios cinéticos mostraron un comportamiento complejo, con una primera zona de saturación comprendida entre 5,0 y 7,0 μM y una segunda a partir de 66-70 μM. Los gráficos de dobles recíprocas son no lineales y exhiben un carácter bimodal que se traduce en dos constantes aparentes de afinidad, Km1: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,5 ± 0,4 μM. Comparando estas constantes cinéticas con las correspondientes para médula (Km: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,3 ± 0,4 μM) y corteza renal (Km: 0,9 ± 0,1 μM y Km2: 5,1 ± 0,6 μM), se sugiere que no existirian dos poblaciones proteicas distintas confinadas en diferentes estructuras. Además, la banda única obtenida (pI: 4,9) mediante la técnica de isoelectroenfoque, permitió descartar la presencia de isofonnas en riñón. Estudios cinéticos revelaron que el ion sodio (0-2,0 M) produjo un desplazamiento del punto de inflexión hasta obtener gráficos de inversas con una sola pendiente. A altas concentraciones de sustrato (7-66 uM) los iones Mg2+ (0-50 mM), fosfato (0-40 mM) y amonio (0-300 mM) actúan como inhibidores no competitivos. A bajas concentraciones de sustrato (0,8-7,0 pM) el Mg2+ es un inhibidor incompetitivo, el fosfato presenta un efecto dual y el amonio desplaza el punto de inflexión conforme aumenta su concentración. Estudios de inhibición realizados con PCMB, NEMI y DTNB demostraron la presencia de aminoácidos cisteína en el sitio activo, lo cual fue confirmado a través de estudios de grupos ionizables en la enzima y en los complejos enzima-sustrato. Se propone para la enzima renal, la existencia de por lo menos dos estados confonnacionales diferentes inducidos en el mismo sitio catalítico, ya sea por la unión del sustrato PBG o la no liberación del producto amonio o de ambos. La presencia de tales cambios confonnacionales permitiría la continuidad en la unión de las otras moléculas de PBG al sitio S, en presencia de intermediarios ES1, ES2 o ES3 en el sitio C, lo que originaria una diferente afinidad y actividad catalítr'ca final. Estos reordenamientos podrian producir finalmente cambios en los pasos limitantes de la reacción, lo cual sucedería a diferentes concentraciones de sustrato y daría lugar entonces a distintas constantes cinéticas.

La fecundación involucra eventos de adhesión celular ovocitoespermatozoide dependientes de Ca2+. Cadherina epitelial (cadE) es una glicoproteína de membrana de 120 KDa, con 5 dominios extracelulares, 1 transmembrana y 1 citoplasmático. CadE se asocia al citoesqueleto de actina a través de moléculas adaptadoras como β-catenina y está involucrada en la adhesión celular dependiente de Ca2+. CadE participa en el desarrollo embrionario, la organogénesis y mantenimiento de tejidos y la tumorigénesis. El objetivo de este proyecto fue evaluar la expresión de cadE en tejidos reproductivos, su presencia y localización en ovocitos y espermatozoides y su participación en la fecundación. Se emplearon 2 modelos: humano y murino. Los estudios describen 1) la expresión del ARNm de cadE en testículo y epidídimo y 2) la presencia de la proteína en extractos de epidídimo y su localización en las células epiteliales 3) la presencia de cadE en estructuras membranosas del plasma seminal humano y del fluido epididimario murino 4) la presencia, formas proteicas y localización de cadE, β-catenina y actina en espermatozoides murinos epididimarios y humanos eyaculados 5) la localización de cadE en espermatozoides capacitados y reaccionados 6) la localización de cadE en ovocitos y formas proteicas en ovocitos murinos 7) la capacidad de anticuerpos bloqueantes de la función adhesiva de cadE de inhibir la interacción espermatozoide-ovocito 8) la evaluación de la presencia de cadE en pacientes en tratamiento por infertilidad e identificación de alteraciones en algunos casos. Este es el primer estudio que aborda de manera exhaustiva la detección de cadE en las gametas humanas y murinas y muestra evidencias de su rol en la fecundación.

Los microARNs (o miARNs) son ARN no codificantes que regulan la expresión génica en animales y plantas, y están implicados en procesos biológicos muy variables, como el desarrollo, la diferenciación y el metabolismo. Con un largo de aproximadamente 21 nucleótidos, los miARNs reconocen secuencias parcialmente complementarias en los ARNm blanco, provocando su corte o arresto de la traducción. Los miARNs han saltado rápidamente a la primera plana del interés de la comunidad científica como un nuevo nivel en el control de la expresión génica en eucariotas. Estudios recientes han puesto de manifiesto que los miARNs están implicados en distintas patologías de seres humanos. Los cálculos actuales consideran que cerca del 40% de los genes de humanos se encuentran regulados por miARNs. Está generalmente aceptado que los miARNs en plantas tienen una extensiva complementariedad con sus genes blanco y su predicción por lo general se basa en el uso de parámetros empíricos deducidos de interacciones conocidas y validadas experimentalmente. En este trabajo, primero desarrollamos una estrategia para la identificación de genes blanco regulados por miARNs en plantas, basado en la conservación evolutiva del par miARN-gen blanco. Además, pudimos encontrar genes blanco específicos de Solanaceae y demostrar que la estrategia se puede utilizar para la búsqueda de genes blanco pertenecientes a un grupo determinado de especies. Esta estrategia fue usada para predecir nuevas interacciones no conocidas anteriormente en Arabidopsis thaliana, que luego fueron validados experimentalmente. Algunos de los nuevos genes identificados podrían participar de las mismas vías que genes blanco conocidos anteriormente, sugiriendo que algunos miARNs pueden controlar diferentes aspectos de un proceso biológico. A partir de estos resultados, desarrollamos una herramienta bioinformática disponible en un servidor de acceso público para identificar genes blanco de miARNs basada principalmente en la conservación durante la evolución de la interacción del par miARN-gen blanco en distintas especies. La herramienta también brinda una descripción de varios parámetros de las interacciones miARN-gen blanco en distintas especies, que puede ser útil para mejorar los sistemas de predicción y describir la co-evolucion de los miARNs y los genes blanco. La biogénesis de los miARNs es un proceso clave porque determina la secuencia exacta de nucleótidos del ARN pequeño funcional, que luego determina los genes a ser regulados. Los precursores de miARNs de plantas son muy variables en forma y tamaño en comparación con los precursores de miARNs de plantas. Y por lo tanto, poco se sabía sobre el reconocimiento de los precursores por la maquinaria de procesamiento. En la segunda parte de este trabajo presentamos una estrategia para estudiar la conservación de los precursores de miARNs de plantas en distintas especies identificando regiones y dominios presentes en distintas especies. A partir de estos resultados, desarrollamos un herramienta de visualización para poder analizar fácilmente la conservación de la estructura primaria y secundaria de los precursores de miARNs. El análisis las mismas reveló que existe una marcada correlación entre la conservación de los precursores y el mecanismo de procesamiento. Los resultados muestran patrones de onservación en los dominios necesarios para el procesamiento, y permiten deducir un modelo general del reconocimiento del ARN durante la biogénesis de miARNs.

Fil:de Prat Gay, Gonzalo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Giacopello, Duilio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En este trabajo se estudia el aparato de síntesis de proteínas en el citoplasma de células eritroblásticas de médula ósea de conejos, y se demuestra la presencia de estructuras polirribosómicas y su actividad ”in vivo” e ”in vitro” en la síntesis de proteínas. La actividad de ribonucleasas en los extractos acelulares de este tejido dificultó estas observaciones, que solamente pudieron llevarse a cabo mediante el empleo del inhibidor de ribonucleasas presente en homogenados de hígado.

El plan de trabajo fijado consistió principalmente en efectuar la síntesis del núcleo fundamental de los alcaloides protopínicos (I), al que se denominó protoprotopina. Para realizar la síntesis de dicho compuesto (I), es necesario disponer de la tetrahidroprotoberberina (II), a la cual puede aplicarse cualquiera de los dos métodos ya conocidos de obtención de las bases de este grupo (método de Perkin y método de Bentley). *Ver figura en tesis* La preparación de la berberina (II), fue efectuada siguiendo sin mayores variantes la técnica de Leithe (1930). Se preparó primero la amida (III), por condensación del ácido fenil-acético y la β-fenil-etil-amina (Decker y Kropp, 1909). *Ver figura en tesis* La reacción de Bischler-Napieralski de la amida (III), condujo sin dificultad a la 1-bencil-3.4-dihidroisoquinolina (IV)(Pictet y Kay, 1909). Para la reducción de la dihidroisoquinolina (IV) a la tetrahidrobase (V), se resolvió sustituir el empleo de metales en medio ácido, por la hidrogenación catalítica y el uso del borohidruro de sodio. *Ver figura en tesis* Para la preparación de la 1-bencil-2-formil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (VI), se empleó la condensación de la base (V) con ácido fórmico (Chakravarti, Haworth y Perkin, 1927). Por destilación a alto vacío del producto aceitoso obtenido, se logró cristalizar por primera vez la amida (VI) (p.f. 80-81°). *Ver figura en tesis* El cierre del núcleo C de la berbina (II), se efectuó mediante el empleo de pentóxido de fósforo como agente condensante (Leithe, 1930). Es de señalar que el uso del derivado formlilado (VI) cristalino, no introduce mejoras en los rendimientos. El tratamiento de la berbina (II) con ioduro de metilo, condujo sin inconvenientes a la mezcla isomerica de los ioduros de N-metilberbina (VII), que pudieron ser separados sin dificultad en sus formas α y β (Chakravarti, Haworth y Perkin, 1927). *Ver figura en tesis* De la aplicación de la reacción de Hofmann a los iodometilatos de berbina (VII), se obtuvieron dos metinos. Uno de ellos resultó el metino vinílico o base B (VIII), que fue el único aislado por los investigadores mencionados y coincide con las propiedades señaladas por los mismos. Su hidrogenación catalítica condujo al dihidro derivado (IX) no descripto, caracterizado como picrato (p.f. 174.5 - 175°). *Ver figura en tesis* El metino cíclico o base A (X) que es el intermediario importante en este camino de síntesis, se obtiene con un rendimiento muy inferior al de la base B. Del mismo pudo prepararse un picrato de p.f. 158 - 159°. *Ver figura en tesis* Las estructuras de ambos metinos fueron confirmadas por reacciones características y por evidencias espectrales. El tratamiento con ácido perbenzoico de la base cíclica (X), condujo a la obtención del N-óxido (XI) en la base protopínica (I) buscada, por calentamiento con ácido, indicaron que era necesario proceder a 140°, temperatura superior a la que es habitual en este tipo de transposiciones. En estas condiciones se aisló la protoprotopina (I) (picrato, p.f. 232 - 233°), cuya estructura se confirmó por evidencias espectrales (espectros I.R y R.M.N.), como así también por su transformación en la berbina (II) original. Los bajos rendimientos en base cíclica (X) obtenidos, determinaron la imposibilidad de poder reunir cantidad suficiente de protoprotopina (I), como para poder etudiar su química. Para aplicar el método de Bentley se oxidó la berbina (II) con ácido perbenzoico, lo cual condujo a la obtención del N-óxido de la misma (XII) (picrato, p.f. 184 - 185°). *Ver figura en la tesis* Cuando el óxido (XII) fue sometido a la acción del cromato de potasio, se observó que la reacción era más compleja de lo descripto por Bentley para unos pocos casos. Mediante técnicas cromatográficas se caracterizaron el 79% de los productos de la reacción. Se identificaron: tetrahidroprotoberberina (II) (6%), protoberberina (XIII) (12%) y N-óxido de berbina (XII) (33%) sin reaccionar. *Ver figura en tesis*Es evidente que la carbinolamina (XV) necesaria para la síntesis de la base protopínica (I) siguiendo este método no se produce en cantidad apreciable y si lo hace se descompone con facilidad, lo cual no favorece su utilización en este caso. En la tesis se ha efectuado una discusión de las reacciones que pueden conducir a los productos aislados. *Ver figura en tesis*

La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir fotones interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), un FS muy eficiente. La quimioterapia administrada en altas dosis, seguida del transplante autólogo de médula ósea es una de las modalidades terapéuticas más utilizadas para el tratamiento de la leucemia. Sin embargo, una pequeña proporción de células leucémicas indiferenciadas que se encuentran en un estado quiescente, pueden resultar resistentes a la quimioterapia y ser reinsertadas en el paciente luego del transplante. Por este motivo actualmente se estudian métodos de purgado potencialmente efectivos para eliminar a las células malignas remanentes. Además, el uso de quimioterapia presenta otras limitaciones como el desarrollo de fenotipos celulares resistentes a drogas y efectos secundarios no deseados. En esta tesis hemos estudiado los efectos de la TFD basada en ALA (TFD-ALA) en tres líneas celulares leucémicas murinas, LBR-, sensible a drogas de quimioterapia, LBR-D160 y LBR-V160, resistentes a doxorubicina (DOX) y vincristina (DOX), respectivamente. Para ello evaluamos la síntesis y acumulación de PpIX sintetizada a partir de ALA, y observamos que en las tres líneas estudiadas esta síntesis aumentó en función de la concentración y del tiempo de incubación con ALA. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX. Mediante estudios de viabilidad celular demostramos la eficacia de la TFD-ALA en las tres líneas celulares, indicando la falta de resistencia cruzada en el caso de las líneas resistentes a drogas de quimioterapia. Por otra parte estudiamos los mecanismos involucrados en la muerte celular producida por la TFD, donde observamos un aumento en los parámetros de estrés oxidativo como la despolarización de la membrana mitocondrial, la producción de oxígeno singulete y de anión superóxido, indicando la importancia de las mitocondrias en los efectos de la TFD. El análisis de parámetros tanto morfológicos como bioquímicos demostró la predominancia de apoptosis como principal mecanismo de muerte, en particular a través de la vía intrínseca, lo que concuerda con el rol activo de las mitocondrias previamente mencionado. Evaluamos además los efectos al combinar la TFD-ALA con los agentes antineoplásicos DOX y VCR, en un modelo in vitro in vivo, utilizando la línea LBR-. En ambos casos observamos un beneficio significativo al utilizar las terapias combinadas, evidenciando la ventaja de esta modalidad frente a las terapias utilizadas en forma independiente. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran el beneficio potencial de utilizar la TFD-ALA como método de purgado de la médula ósea de pacientes con leucemia, especialmente para eliminar fenotipos resistentes a drogas. Además, los estudios utilizando las terapias combinadas indican la posibilidad de disminuir las dosis de drogas de quimioterapia, minimizando así las limitaciones ocasionadas por este tratamiento.

La miel es un alimento natural elaborado por las abejas melíferas y como tal, presenta una microbiota propia al igual que el resto de los alimentos. Las especies bacterianas formadoras de esporas de los géneros Bacillus y Paenibacillus aparecen en forma frecuente, y, dentro de ellas, se cita Bacillus cereus sensu stricto que está asociada a procesos infecciosos humanos como productora de enterotoxinas. En la miel también pueden encontrarse bacterias causantes de enfermedades de las abejas como la loque americana, ocasionada por Paenibacillus larvae, y la loque europea, producida por Melissococcus plutonius. Durante muchos años, estas enfermedades se trataron con el antibiótico oxitetraciclina, generando la aparición de resistencia de los agentes microbianos que se querían controlar con la consiguiente aplicación de dosis cada vez mayores, y la contaminación de la miel con residuos de estas sustancias. El aumento de la prevalencia de la resistencia antimicrobiana en bacterias patógenas, es el resultado de la evolución y la presión selectiva debido a la amplia implementación del uso de antibióticos en medicina humana, medicina veterinaria, alimentación animal y agricultura. Esta adaptación ocurre, no por la mutación de las poblaciones amenazadas, sino mayormente por la adquisición y diseminación de genes simples de resistencia a antibióticos mediante elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y transposones. Estos elementos móviles distribuyen eficientemente los determinantes de resistencia a antibióticos, individualmente o en grupos, entre muchos géneros y especies bacterianas. En el caso de las tetraciclinas, la resistencia se debe a la adquisión de genes tet (tetraciclina) y otr (oxitetraciclina); frecuentemente estos genes están asociados con plásmidos y/o transposones conjugativos. Con el objetivo de investigar la presencia de determinantes de resistencia a tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina en cepas de B. cereus y P. larvae aisladas de miel y materiales del apiario y su correlación con la presencia de plásmidos salvajes se aplicaron procedimientos de microbiología y biología molecular. Se analizó la presencia de los determinantes de resistencia a tetraciclina: Tet K, Tet L, Tet M, Tet O, Tet Q, Tet S, Tet A (P) y Otr A y se observó una alta correlación entre la presencia de plásmidos y fenotipos resistentes a tetraciclina. Mediante PCR, se detectó la presencia del determinante Tet L empleando como molde ADN plasmídico en un 76% de las cepas de B. cereus estudiadas y del determinante Tet M en la cepa B. cereus m383 con fenotipo resistente a tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina cuando se utilizó como molde ADN genómico total, pero no así cuando se utilizó ADN plasmídico. Con respecto al resto de los determinantes de resistencia analizados (Tet K, Tet O, Tet Q, Tet S, Tet A (P) y Otr A), no se observó producto de amplificación alguno en las cepas estudiadas, ni en ADN genómico total ni en ADN plasmídico. Se realizaron ensayos de conjugación entre cepas resistentes y sensibles, y de transformación por electroporación con ADN plasmídico obtenido de cepas resistentes, demostrando una transferencia horizontal de genes de resistencia a tetraciclina entre la cepa de B. cereus m401, resistente a tetraciclina, y las cepas de B. cereus ATCC 11778 NALR y B. pumilus m350 NALR, sensibles a tetraciclina. Se obtuvieron transconjugantes con fenotipo resistentes a tetraciclina para ambas cepas aceptoras, pero no se obtuvieron transformantes en los ensayos de electroporación. Mediante el análisis de los resultados de la secuenciación del genoma completo de la cepa de B. cereus m401 se confirmó la presencia de 3 plásmidos, a los cuales denominamos pBCm401a, pBCm401b y pBCm401, de 8.307 pb, 9.934 pb y 69.591 pb, respectivamente. Luego del análisis de las anotaciones funcionales de los genes codificantes de proteínas obtenidos en estos 3 plásmidos no se encontraron genes que codifiquen funciones relacionadas con resistencia a tetraciclina. Al no encontrar en ninguno de los tres plásmidos genes que codifiquen resistencia a tetraciclina, se efectuó la búsqueda de dichos genes en el resto de los contigs obtenidos del genoma (n=46). Luego del análisis de las anotaciones funcionales se detectó un contig (contig09) de 243.988 pb conteniendo un gen de resistencia a tetraciclina de 1.377 pb (contig09_orf00135) con alta homología a los genes tetK, tetL y tet45, que codifican para proteínas de eflujo. Según el análisis efectuado en la base de datos del servidor GenBank mediante la herramienta BLASTn, este contig se correspondería con secuencias similares pertenecientes a megaplásmidos de B. cereus y B. thuringiensis. Los resultados del análisis del alineamiento de la secuencia correspondiente al gen de resistencia a tetraciclina presente en el contig09 con secuencias correspondientes a los genes de resistencia tetK, tetL y tet45 permitieron concluir que el gen de resistencia a tetraciclina presente en la cepa m401 se correspondería con el gen tet45, ya que muestra mayor homología (93%) con la secuencia de dicho gen, con respecto a los genes tetL (80%) y tetK (64%). Por todo lo expuesto, se puede concluir que este trabajo es el primer registro de la presencia del gen de resistencia tet45 en un posible megaplásmido de B. cereus.