Catálogo de publicaciones

Siendo la enfermedad de Chagas es uno de los problemas endemicos mas importantes en Latinoamerica, el clonado de antígenos del agente causal, Trypanasoma cruzi, ya sea para el diagnostico o el desarrollo de una vacuna, fue uno de los objetivos mas importantes. Uno de los problemas que a menudo se presentan es la forma de obtener proteínas por tecnicas de ADN recombinante, en niveles que puedan ser llevados a escala industrial. En este caso particular, se ha estudiado la forma de expresar eficientemente y purificar cuatro antígenos clonados los que poseen un alto indice de reacción frente a sueros de pacientes con enfermedad de Chagas (Ibañez y col 1987). La expresión y purificación de estas proteinas estuvo basada en un sistema de fusión con la Proteina A de Staphylococcus aureus. Los vectores de expresion usados en este trabajo de tesis fueron los de la serie pRIT. (Nilsson y col, 1990) y sus hospedadores fueron Escherichia coli (E.coli) y Staphylococcus aureus (S.aureus) (Löwenadler y col 1986), siendo este último muy poco estudiado en la expresión de proteinas recombinantes (Nilsson y col, 1990). Una vez que las fusiones fueron expresadas, estas pudieron ser recuperadas y purificadas por cromatografía de afinidad IgG-Sepharosa en un solo paso. El esquema basico de expresión y purificación consistió en lo siguiente: 1) Expresión de la proteina fusión por la bacteria hospedadora ya sea S.aureus como E.coli. 2) Recuperación de la fusión en extractos celulares o en el medio de cultivo libre de celulas por cromatografía de afinidad IgG-Sepharosa. 3) Proteólisis enzimática especifica en el sitio de unión de la proteina A con el antigeno. 4) Eliminación de la proteina A liberada y de la fusión remanente por un segundo pasaje por la columna de cromatografia de afinidad, recuperandose el antigeno auténtico en el efluente. Los resultados en esta primera etapa permitieron extraer las siguientes conclusiones: 1) Las fusiones son principalmente encontradas dentro de la celula en E.coli, mientras que en S.aureus son excretadas al medio de cultivo. 2) Las proteinas de fusión son facilmente rescatadas y purificadas por cromatografía de afinidad. 3) Los niveles de expresión fueron de una magnitud tal que pueden ser llevados a escala industrial tanto en E.coli como en S.aureus. 4) S.aureus probó ser el hospedador de elección porque la degradación proteica fue menor y se evitó el proceso de ruptura celular. Esta ultima ventaja hace que sean procesables grandes volúmenes de cultivo en forma mucho mas rápida y menos costosa. 5) Salvo en un solo caso, la proteólisis especifica separo en forma eficiente, ambas mitades de las fusiones. 6) La ulterior purificación del antígeno auténtico postclivado por un segundo pasaje por la columna de cromatografía de afinidad, mostro una recuperacion de aproximadamente el 80%. En un primer paso, la producción de estos antígenos, por este sistema, para ser usados como reactivo de diagnostico, mostró que puede llevárselo a escala industrial, por los niveles de expresión la facilidad de su manejo y su rapidez. Las hidrofobicidad pareció influir en la degradación de algunas fusiones durante la expresión en este sistema, cuya forma de actuar fue discutida. La metodología empleada para cada antígeno en particular los que en principio serian cuatro, podria ser simplificada aún mas. Esto fue logrado a través de construcciones en la que dos o mas genes fueron fusionados para producir una única proteína que conservaría la misma capacidad de reaccionar con antisueros de pacientes como lo hacen cada uno de ellos por separado. La idea fue aproximarse a la obtención de una poliproteína única que represente a todos los antígenos a disposición de forma tal de expresar, recuperar y purificar todo el "repertorio" en un solo procedimiento. Los resultados obtenidos hasta aqui mostraron que además de ser posible la fusión de tres antíqenos distintos, la inmunoreactividad mostraron que cada antígeno en la molécula única, reaccionó con sus correspondientes antisueros especificos sin interferencia por los demas, demostrando, en primera instancia, que este tipo de quimera puede ser llevada a una prueba de campo. Además queda abierta la posibilidad de que quimeras como las que se construyeron en este trabajo, puedan contribuir a experimentos de protección.

El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos relevantes ha sido ampliamente evaluado dada la posibilidad de utilizar plantas modificadas genéticamente para la producción de vacunas. Las vacunas a base de plantas serían más baratas y más fáciles de elaborar en grandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sin necesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en la actualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarlanel riesgo de virus contaminantes que existe en las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos ya que los posibles vian de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre ni para los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos en sus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producciónde vacunas de administración oral. Hasta el momento, la mayoría de los antígenos expresados consisten en péptidos, proteínas únicas ó estructuras muy simples. Sin embargo, la producción de antígenos vacunales en sistemas heterólogos requiere, en muchos casos. ía expresión de estructuras antigénicas complejas. EIVirus de la Fiebre Aftosa (VFA)produce una de las enfermedades más temidas del ganado debido a su amplia distribucióngeográfica y por ser altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y a virus inactivado. El progreso en la producción de vacunas antiaftosas está dirigido hacia el logro de vacunas de elaboración más fácily económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades de virus. Una alternativa a las vacunas convencionales es la preparación de cápsides vacías expresando y procesando la poliproteína precursora en un sistema de expresión heterólogo. Se han obtenido cápsides vacías confonnacionalmente correctas de los serotipos A, 0 y C del VFA utilizando sistemas de expresion en E. CoIi, baculovirus o virus vaccinia. Los resultados obtenidos hasta ahora al expresar cápsides vacías del VFA en sistemas heterólogos, con relación a Ia conservación de epitopes protectivos, las convierten en antígenos candidatos para la formulaciónde vacunas. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de expresión masiva de un inmunógeno eficaz como para ser utilizado a campo, ya que los sistemas desarrollados hasta ahora resultan costosos y poco aplicables a nivel industrial. Como primer objetivo de este trabajo de tesis se propuso producir plantas de alfalfa transgénicas conteniendo el gen que codifica para la poliproteína P1 precursora de las proteínas estructurales del VFA. Las construcciones utilizadas involucran únicamente a P1 ó a P1 junto con la proteasa SC. La presencia del gen foráneo se detectó, en las plantas transgénicas, por PCR y su actividad transcripcional específica por RT-PCR y Northern blot. Fue posible visualizar por microscopía electrónica estructuras que por su tamaño y morfología podrían corresponder a cápsides vacías del VFA. La inmunogenicidad de los productos expresados fue evaluada en el modelo murino. Ratones adultos inmunizados intraperitonealmente desarrollaron una respuesta de anticuerpos detectada por su reactividad. en ELISA, frente a un péptido sintetico que representa la zona más inmunogénica de VP1 y partículas virales completas; y, en Western blot, frente a las proteínas estructurales del virus nativo. Además, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y resultaron completamente protegidos frente al desafío con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la factibilidad de expresar antígenos altamente complejos en plantas transgénicas y su utilizacióncomo efectivos inmunógenos experimentales. Los resultados obtenidos por nuestro y otros grupos de investigación demuestran la factibilidad de la utilización de plantas transgénicas como fuente de producción de antígenos vacunales. Sin embargo, uno de los principales problemas que posee este sistema de expresión es que los niveles de proteína expresada en las plantas transgénicas son relativamente escasos como para extrapolar su uso a una vacuna de aplicabilidad real. De modo que, el desarrollo de estrategias que generen una mayor concentración de la proteína recombinante es sumamente importante, especialmente cuando se desea utilizar los extractos de planta sin ningún proceso de enriquecimiento y/o purificación posterior. Dado que la inserción del transgen en el genoma vegetal es al azar, es altamente probable que los niveles de su expresión varíen entre los individuos producidos. Una alternativa posible, entonces, consiste en poder identificar aquellos individuos que presentan niveles excepcionalmente altos de la proteina foránea. Sin embargo, la identificación de aquellas plantas que expresen cantidades significativas de antígeno por métodos inmunológicos es un proceso lento y labioroso. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y como segunda parte de este trabajo de tesis, hemos desarrollado una metodologia que nos permite evaluar un gran número de individuos y seleccionar de un modo fácil y rápido aquéllos que presentan mayores niveles de expresión de la proteina recombinante. Esta metodologia se basa en la expresión de un gen de interés fusionado a un gen reportero, codificante para la enzima B-Glucuronidasa (B-GUS), cuya presencia puede ser detectada cuantitativamente por colorimetrla. A fin de evaluar el sistema de selección propuesto, utilizamos como antígeno un péptido que comprende los residuos 135 a 160 de la proteina VP1 del VFA para generar la proteina de fusión con la enzima B-GUS.Las plantas transgénicas obtenidas fueron primeramente evaluadas por su actividad enzimática de B-GUS. Fue posible detectar por Western blot la proteina de fusión en aquellas plantas que presentaron mayores niveles de B-GUS. Las plantas seleccionadas expresaron 0.5-1 pglmg de proteina soluble total. El péptido p135-160 expresado como proteina de fusión conservó sus caracteristicas inmunogénicas ya que ratones inmunizados parenteralmente con una vacuna elaborada con extracto foliar desarrollaron una respuesta de anticuerpos especificos detectada por su reactividad en ELISAfrente a p135-160, particulas virales completas y en Western blot frente a VP1. Además, se detectaron anticuerpos neutralizantes que resultaron protectores frente al desafio con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la posibilidad de utilizaruna metodologia simple para detectar las plantas que expresan altos niveles del péptido recombinante, el cual conserva sus propiedades antigénicas e inmunogénicas al ser expresado como proteina de fusión.

La fiebre aftosa es una enfermedad de gran importancia económica que afecta principalmente al ganado bovino. Esta enfermedad está causada por un picornavirus, el virus de la fiebre aftosa (VFA). El control de la enfermedad se lleva a cabo mediante eliminación de los animales infectados y vacunación con vacunas basadas en virus inactivado. Existen varias desventajas relacionadas con la producción y el uso de tales vacunas, entre las que están la reintroducción de la enfermedad debida a la manipulación de grandes masas virales o a la incorrecta inactivación del virus, por lo que el desarrollo de vacunas recombinantes más seguras aparece como una alternativa de gran interés. En el presente trabajo se estudió la posibilidad de expresar sitios antigénicos simples y complejos derivados del VFA en diferentes sistemas de expresión. La poliproteína P1, precursora de las proteínas estructurales del virus, pudo expresarse con éxito en un sistema bacteriano y en el sistema “baculovirus-células de insecto”. Sin embargo, las diferentes versiones de esta proteína no fueron capaces de montar una respuesta efectiva contra el VFA,probablemente debido a un incorrecto plegamiento espacial. Por otro lado, el sitio antigénico inmunodominante (sitio A) presente en el loop V-H de la proteína VP1 se expresó con éxito como fusión a la proteína transportadora core del virus de la hepatitis B (VHB) en células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes. Esta proteína quimérica no adoptó Ia estructura multimérica esperada, la que se consiguió mediante coinfecciones con un baculovirus que expresaba la proteína core. De todos modos, las partículas obtenidas resultaron pobres inmunógenos cuando se inyectaron en animales experimentales, hecho debido probablemente a la baja densidad de epitopes derivados del VFA en las preparaciones vacunales. Finalmente, tanto el sitio A como la poliproteína P1 pudieron expresarse como fusión a la glicoproteína gp64 del baculovirus AcNPV. Estas proteínas quiméricas se localizaron tanto en la membrana de células infectadas como en la superficie de los baculovirus recombinantes. Esta localización asegura una conformación particulada sobre un soporte fosfolipídico (características relacionadas con el aumento de inmunogenicidad de sitios antigénicos) y facilita la purificación de los inmunógenos. Cuando se vacunaron ratones con estas construcciones, los baculovirus llevando el sitio A y las células infectadas con éstos despertaron una respuesta inmune humoral neutralizante contra el VFA, aún en ausencia de adyuvantes. De nuevo, las construcciones llevando P1 fallaron para montar una respuesta inmune humoral neutralizante, probablemente debido a un incorrecto plegamiento espacial. La posibilidad de producir baculovirus recombinantes y células infectadas que lleven en sus superficies sitios antigénicos derivados de patógenos de interés veterinario mediante infección de larvas puede convertirse en una manera sencilla y económica de producción de vacunas de nueva generación.

La fiebre aftosa es una enfermedad de gran importancia económica que afecta principalmente al ganado bovino. Esta enfermedad está causada por un picornavirus, el virus de la fiebre aftosa (VFA). El control de la enfermedad se lleva a cabo mediante eliminación de los animales infectados y vacunación con vacunas basadas en virus inactivado. Existen varias desventajas relacionadas con la producción y el uso de tales vacunas, entre las que están la reintroducción de la enfermedad debida a la manipulación de grandes masas virales o a la incorrecta inactivación del virus, por lo que el desarrollo de vacunas recombinantes más seguras aparece como una alternativa de gran interés. En el presente trabajo se estudió la posibilidad de expresar sitios antigénicos simples y complejos derivados del VFA en diferentes sistemas de expresión. La poliproteína P1, precursora de las proteínas estructurales del virus, pudo expresarse con éxito en un sistema bacteriano y en el sistema “baculovirus-células de insecto”. Sin embargo, las diferentes versiones de esta proteína no fueron capaces de montar una respuesta efectiva contra el VFA,probablemente debido a un incorrecto plegamiento espacial. Por otro lado, el sitio antigénico inmunodominante (sitio A) presente en el loop V-H de la proteína VP1 se expresó con éxito como fusión a la proteína transportadora core del virus de la hepatitis B (VHB) en células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes. Esta proteína quimérica no adoptó Ia estructura multimérica esperada, la que se consiguió mediante coinfecciones con un baculovirus que expresaba la proteína core. De todos modos, las partículas obtenidas resultaron pobres inmunógenos cuando se inyectaron en animales experimentales, hecho debido probablemente a la baja densidad de epitopes derivados del VFA en las preparaciones vacunales. Finalmente, tanto el sitio A como la poliproteína P1 pudieron expresarse como fusión a la glicoproteína gp64 del baculovirus AcNPV. Estas proteínas quiméricas se localizaron tanto en la membrana de células infectadas como en la superficie de los baculovirus recombinantes. Esta localización asegura una conformación particulada sobre un soporte fosfolipídico (características relacionadas con el aumento de inmunogenicidad de sitios antigénicos) y facilita la purificación de los inmunógenos. Cuando se vacunaron ratones con estas construcciones, los baculovirus llevando el sitio A y las células infectadas con éstos despertaron una respuesta inmune humoral neutralizante contra el VFA, aún en ausencia de adyuvantes. De nuevo, las construcciones llevando P1 fallaron para montar una respuesta inmune humoral neutralizante, probablemente debido a un incorrecto plegamiento espacial. La posibilidad de producir baculovirus recombinantes y células infectadas que lleven en sus superficies sitios antigénicos derivados de patógenos de interés veterinario mediante infección de larvas puede convertirse en una manera sencilla y económica de producción de vacunas de nueva generación.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Cátedra de Diversidad Animal II. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba. 2013- 151 h. con Apéndices + CD. tabls.; ils.; grafs. Contiene Referencia Bibliográfica, y Copia de Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

CD44, receptor del acido hialurónico, es una glicoproteína de membrana con un dominio extracelular altamente glicosilado, una porción transmembrana y una cola citoplasmática que interactúa con el citoesqueleto. Originalmente fue descripta como receptor “homing” en células linfocitarias, pero luego se vio que también se expresa en otros tipos celulares. Existen múltiples formas de esta molécula, llamadas variantes, que se generan por splicing alternativo de 10 exones. La forma mas abundante es la llamada estándar ó hemopoyética (CD44s/ H), que carece de los diez exones alternativos y se expresa predominantemente en células hemopoyéticas y mesenquimaticas. Su peso molecular es de 80-90 kDa. Sus principales funciones son participar en la activación de linfocitos y en la adhesión y migración celular. Las formas variantes tienen un peso molecular de 120-150 kDa y se expresan con predominio en tejidos epiteliales. Las funciones precisas de estas isoformas aún no estan claras. En 1991, Gunthert y col., demostraron que la ísoforma v6 confería capacidad metastasica al ser transfectada en células tumorales no metastásicas de rata. Como consecuencia de este hallazgo ha surgido un gran interés por el estudio de CD44 en otros modelos tumorales. En el desarrollo de este plan de Tesis, hemos estudiado la función, expresión y distribución de CD44 en una línea celular tumoral mamaria murina, F3II, altamente invasiva y metastasica. El estudio de la expresión de CD44 en cortes histológicos de tumores F3II, mostró una alta expresión de esta molécula asociada al crecimiento subcutaneo de los mismos, mientras que dicha expresión fue prácticamente nula en tumores F3II crecidos en forma peritoneal. El analisis de la expresión de CD44, por Western blot e inmunohistoquímica, en cultivos de células tumorales FSII y normales NMuMG, mostró que las monocapas de células FSII expresan mayores niveles que las células normales. En ambas líneas se pudo detectar, por Western blot, una banda principal de 80 kDa, correspondiente a CD44s. También se observó la presencia de bandas de mayor peso molecular, que podrian corresponder a la expresión de variantes de CD44, aunque dicha expresión fue menos evidente en las células NMuMG. Mediante el uso de un anticuerpo monoclonal específico antíCD44 (KM201), hemos demostrado que los procesos de adhesión y spreadíng dc células FSII pueden ser inhibidos en forma significativa. El análisis de la expresión de CD44, por inmunocitoquímica durante el spreading, mostró que esta molécula se distribuye en forma contínua (no punctata) sobre la membrana plasmática, particularmente en los bordes anteriores o de avance y en la zona perinuclear de la membrana plasmática. CD44 no fue detectado en estructuras como filopodios o lamelipodios, pero sí entre dichas estructuras. Las células totalmente extendidas sobre el sustrato, presentaron una significativa disminución de la tinción de CD44 sobre la membrana plasmática, comparado con los estadios iniciales del spreading. Este descenso en la expresión a lo largo del spreading fue confirmado por Western Blot. En ensayos de migración e invasión de células F3II en cámaras Transwell, demostramos que el anticuerpo anti-CD44, fue también capaz de inhibir en forma significativa ambos procesos. Además, el tratamiento de células FSII con anti-CD44 conjuntamente con anti-uPA, la inhibición de la migración se incrementó en un 90%, sugiriendo una acción sinergíca entre CD44 y uPA en favor de la migración de estas células tumorales. Además de la asociación funcional entre CD44 y el uPA en el en el proceso de migración, los resultados de ensayos de inmunoprecipitación con anticuerpos específicos, indicaron que el receptor CD44 estaría físicamente asociado con el uPA, sugiriendo la participación conjunta de ambas moléculas en algunas etapas de la cascada metastasica de células tumorales mamarias murinas. En conjunto estos resultados demuestran que, en la línea celular tumoral F3II, CD44 cumple un rol activo en eventos críticos que tienen lugar durante la cascada metastásica, como la adhesión, spreading, migración e invasión celular. Mediante un enfoque farmacológico, se estudiaron las vías de señalización que participarían en la regulación de la expresión de CD44 en células FSII. El tratamiento de células F3II con PMA, activador de PKC, o ácido fosfatídico, producto de la degradación de fosfatídilcolina dependiente de PLD, aumentaron en forma significativa la expresión de CD44. Cuando los cultivos fueron tratados con H7, inhibidor específico de PKC,o con propranolol, inhibidor de la conversión de acido fosfatídico a DAG,se observó una sensible disminución de la expresión de CD44. Los resultados de estos experimentos sugieren la participación de PKC y PLD en las vias de señales que regulan la expresión de este receptor. Los tumores cerebrales raramente metastatizan pero son muy invasivos a nivel local. Dado que el AH es un componente abundante de la matriz extracelular del sistema nervioso central y que CD44 participa en su degradación, la sobreexpresión de este receptor podría facilitar el proceso invasivo de estos tumores. En un trabajo colaborativo con los Servicios de Oncología y Patología del Hospital Italiano, hemos analizado la expresión de CD44 en 57 tumores de cerebro (14 astrocitomas de bajo grado, 13 astrocitomas anaplásicos, 22 glioblastomas multiformes, 5 ependimomas y 3 meduloblastomas). Cuando se analizaron los glioblastomas de distintos estadios, se observó que la sobreexpresión de CD44s se correlaciona en forma lineal con el grado de agresividad de estos tumores (Clasificación de Burger). En cambio, el mismo analisis en ependimomas, tumores poco agresivos, mostró una alta expresión de CD44s, mientras que, en meduloblastomas, tumores altamente agresivos, la expresión de esta molécula, fue casi nula. No se detectó expresión de variantes de CD44 en ninguno de los tumores estudiados. Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de CD44s podria ser de importancia durante el desarrollo de tumores humanos de origen neuroglial.

La Fibrosis Quística es la más frecuente de las enfermedades humanas severas, de origen genético, en la población caucásica (Welsh MJ, 1995). Se produce por mutaciones en un único gen, que codifica para el canal de Cl- CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Aún no ha sido establecida una relación clara entre el defecto genético y los mecanismos que gobiernan esta enfermedad. Todas las citoquinas proinflamatorias que han sido estudiadas en el ambiente inflamatorio de los pulmones FQ [factor de necrosis tumoral (TNF-α), interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-6 (IL-6) e interleuquina-8 (IL-8)] están elevadas y la concentración de la citoquina antinflamatoria interleuquina-10 (IL-10) está considerablemente reducida (Khan et al., 1995). A su vez, la IL-1β regula la expresión del CFTR (Cafferata E G A, 2001; Cafferata et al., 2000). Por otro lado, las proteínas proinflamatorias TNF-α, IL-1β y IL-6 regulan positivamente los genes de las mucinas muc2 y muc5 (Dohrman et al., 1998) e incrementan la quimioatracción de neutrófilos (Ohishi, 2000) que liberan gran cantidad de proteínas, especies reactivas de oxígeno y NO, que pueden causar daño celular. Entonces, es posible que genes diferencialmente regulados por IL-1β tengan una participación en los mecanismos que llevan a la muerte celular, la exacerbación de los procesos inflamatorios o la acumulación de mucinas en el tracto respiratorio FQ. Con el fin de identificar nuevos intermediarios en la vía de señalización de IL-1β, o de identificar genes que tuviesen una regulación similar al CFTR, se realizó un "Differential Display" sobre las células T84 tratadas con distintas concentraciones de IL-1β. Se aisló un gen regulado por dicha citoquina, que poseía el mismo patrón de modulación que el CFTR. La banda aislada fue clonada y secuenciada. La misma mostró una homología del 99% con otras del banco de datos que codificaban para proteínas cuya actividad es desconocida. A este gen diferencial se lo denominó hsccl (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). Por el análisis de la secuencia completa del ARNm se determinó que hscc1 contiene dominios que se hallan conservados en la familia de las proteínas transportadoras. Mediante "Northern blots" se observó una doble banda correspondiente a 3,5 kb, que mostraba un máximo de activación cuando las células fueron tratadas con 0,5 ng/ ml de IL-1β. Por otro lado, la expresión de hscc1 se inhibió a concentraciones de IL-1β mayores a 1 ng/ml. La IL-1β induce al factor de transcripción NF-κB cuando se encuentra presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,5 ng/ml (Cafferata E G A, 2001), mientras que con 2,5 ng/ml de IL-1β se inducen los factores c-jun y c-fos, pero no NF-κB. Usando un virus que sobre-expresa a un dominante negativo de NF-κB, se determinó que la inducción de este factor es necesaria para que se produzca el aumento en la expresión de hscc1 por IL-1β, en forma similar a lo que ocurre con CFTR. Por otro lado, el inhibidor de proteína quinasa C, GF109203X (Battle et al., 1998) y los inhibidores de proteína quinasas de tirosina Genisteína (Rao et al., 1997) y Herbimicina A (Taylor et al., 1997), bloquearon la inducción mediada por IL-1β, sugiriendo que estas proteína quinasas estan también involucradas en el camino de transducción de la señal de IL-1β. Otro objetivo de este trabajo fue identificar genes cuya expresión fuese dependiente de la actividad del CFTR, con el fin de determinar cuales eran las funciones celulares dependientes del canal CFTR y de identificar factores que contribuyesen a la deficiencia pulmonar en fibrosis quística. Realizamos un "Differencial Display" usando células de epitelio de traquea fibroquística (CFDE) y las mismas células transfectadas con el CFTR normal (CFDE/6RepCFTR). Aislamos e identificamos un ARNm de expresión diferencial que codifica para la quinasa de tirosina c-Src. Este mensajero se encontró sobre-expresado en las células CFDE. Cuando las células CFDE/6RepCFTR fueron tratadas con el inhibidor del canal CFTR NPPB, los niveles del ARNm c-Src se elevaron. Es decir, la actividad del canal CFTR sería necesaria para la regulación de c-src. Asimismo, los análisis de la proteína c-Src por inmunohistoquímica mostraron que ésta se encuentra elevada en los pulmones FQ. La fibrosis quística se caracteriza por la acumulación de mucus que obstruye los conductos de distintos órganos (Hutchison and Govan, 1999). A su vez, este aumento en la producción de mucinas puede hacer a los enfermos más susceptibles de sufrir infecciones pulmonares por Pseudomonas aeruginosa (Parmley and Gendler, 1998). Se sabe que MUC1 se encuentra elevada en el colon de los ratones FQ, pero los ratones FQ que no producen MUC1 (ratones "knock out" para MUC1) tienen una obstrucción intestinal mucho menor. Además, a c-Src se la ha involucrado en la producción de mucinas en respuesta a diversas injurias (Bausbaum et al., 1999). Era posible entonces que el aumento de c-Src inducido por la falla en CFTR fuese responsable de la acumulación de mucus. Para corroborar esta hipótesis, se midió la expresión de la MUC1. Esta fue encontrada elevada en células CFDE respecto de las células CFDE/6RepCFTR. Además, cuando las células CFDE fueron tratadas con un dominante negativo o con un inhibidor de c-Src (PP2) los niveles de MUC1 disminuyeron. Estos resultados indican que c-Src estaría involucrada en el camino de señalización que lleva el aumento de MUC1. Estos datos sugieren, además, que la falla en el CFTR produciría un incremento en la expresión de MUC1 en el sistema respiratorio y que esto ocurre previamente a la infección pulmonar. En consecuencia, la quinasa c-Src podría ser el nexo entre la falla del CFTR y la acumulación de mucinas en fibrosis quística.

Fil:Ferraro, Marcela Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La enfermedad quística ovárica (COD) constituye uno de los principales desórdenes reproductivos en vacas lecheras. La etiopatogenia de la COD es un proceso complejo que involucra disfunción en la foliculogénesis y en la ovulación, postulándose un desequilibrio neuroendócrino a nivel del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal como hipótesis más aceptada, aunque en la persistencia folicular también intervienen factores intraováricos. En la presente Tesis nos propusimos examinar la localización y expresión de receptores de las hormonas gonadotróficas, de los receptores de hormonas esteroides y de las proteínas correguladoras en las estructuras foliculares del ovario de vacas con COD en comparación con las estructuras de los ovarios de las vacas controles. Los resultados evidenciaron una baja expresión del ARNm de RFSH y RLH en las células foliculares de los folículos quísticos espontáneos. Asimismo, dichas estructuras mostraron una mayor expresión del ARNm de RE alfa y una menor expresión del RE beta. Los quistes foliculares también mostraron una fuerte expresión del ARNm de RA en granulosa. Así, un incremento significativo fue observado en la isoforma b del RP en granulosa de los folículos quísticos. Además, la inmunomarcación de REA, SMRT y SRC-3 mostraron diferencias entre animales controles y animales con COD inducida. Un patrón diferencial del ARNm de SRC-1, SRC-2 y SRC-3 fue demostrado en los folículos quísticos. Los resultados obtenidos sugieren que pequeños cambios y/o alteraciones en los mecanismos de transcripción y/o regulación de los receptores de hormonas esteroides y gonadotrópicas; y de las proteínas correguladoras podrían ser cruciales en la patogenia de esta enfermedad.