Catálogo de publicaciones

Las hemofilias A (HA) y B (HB) son coagulopatías hereditarias, ligadas al cromosoma X (X), sufridas por varones (1:5000) y raramente por mujeres, causada por defectos génicos del factor VIII (F8) y IX (F9), respectivamente. Para caracterizar el espectro de mutaciones causales de HB en Argentina se aplicó un esquema original de 12 amplímeros para el F9, incluyendo un screening por CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis), en 49 familias, y se identificaron 29 cambios missense (60%), 7 nonsense (14%), 4 defectos de splicing (8%), 2 pequeñas inserciones‐deleciones (4%), 6 grandes deleciones (12%) y un cambio en región promotora del F9. Dos cambios missense no reportados mostraron, uno la disrupción de un puente disulfuro y otro la destrucción de un sitio de γ‐carboxilación condicionando el fenotipo de HB severa. Para mejorar la estrategia de detección de grandes rearreglos que involucran int22h e int1h en el F8, causales del 50% de las HA severas, se desarrolló un abordaje nuevo, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Mediante el uso de un test diagnóstico para la inversión del intron 22 (Inv22), los resultados de IS‐PCR fueron validados por perfecta concordancia en 32 y 43 casos previamente estudiados por Southern blot y PCR inversa, y en 34 casos nuevos. El uso conjunto del test diagnóstico y complementario sobre las series de nuestra población, no mostró las variantes estructurales, i.e., deleciones y duplicaciones hipotetizadas en la literatura. El test para la inversión del intrón 1 fue validado por perfecta concordancia en 21 casos estudiados por doble PCR y en 13 casos nuevos. Para investigar la utilidad de IS‐PCR en diagnóstico prenatal, muestras de vellosidades coriónicas de una madre portadora de la Inv22 y su feto nonato fueron diagnosticadas. Para estudiar la causa de la expresión de HA severa en mujeres portadoras heterocigotas se ajustó y validó el sistema del gen HUMARA para estimar el patrón de inactivación del X (XIP). Se estudiaron 6 mujeres con HA severa: una mostró la mutación c.3633delA en hemi‐homocigosis, 4, mostraron la mutación en heterocigosis y sesgo extremo en el XIP, y un caso, heterocigota para c.4388_4391delCTTT, mostró XIP no sesgado en leucocitos de sangre periférica (hipotetizando una inactivación hepática distinta). En una serie de 37 portadoras heterocigotas, y un grupo control de 20 no portadoras, se estudió la correlación XIP‐FVIII:C mediante análisis de contingencia y de errores respecto a un modelo teórico original (Obs.‐Esp.), obteniéndose modestas diferencias significativas (p menor a 0,05) asociadas a una gran dispersión de FVIII:C. Este trabajo presentó la primera serie molecular de mutaciones causales de HB en Argentina, el desarrollo de una nueva estrategia para el estudio de las grandes invers.

Fil:De Siervi, Adriana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Louis-Tisserand, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El parasitoide bracónido Diachasmimorpha longicaudata es ampliamente utilizado como controlador biológico de moscas de los frutos; sin embargo, es escaso el conocimiento disponible sobre su genética. A fin de aportar información y mejorar su cría masiva, se estudió su sistema de determinación del sexo mediante la realización de cruzamientos de alta y baja endogamia, utilizando herramientas de citogenética para determinar el nivel de ploidía de la descendencia. Asimismo, se analizó su espermatogénesis y su cariotipo en detalle, realizando aportes a la Teoría de Interacción Mínima, desarrollada para el estudio de la evolución del cariotipo en Hymenoptera. En este parasitoide el sexo se determina por haplodiploidía (machos haploides, hembras diploides), pero en condiciones de alta endogamia ocurre un sesgo significativo de la proporción de sexos hacia machos, debido a la generación de machos diploides. El sexo estaría determinado por el estado de un promedio de tres loci no ligados. Los individuos homocigotas para los loci sexuales se desarrollan en machos diploides. Esta información permitirá mejorar los protocolos de cría masiva de la especie, tratando de minimizar el nivel de endogamia a fin de evitar un incremento en la producción de machos. El estudio citogenético permitió corroborar el número cromosómico descripto previamente. Se analizó la cantidad, composición y distribución de la heterocromatina constitutiva, se mapearon los “clusters” de genes ribosomales y se determinó la cantidad de “clusters” activos. La información obtenida permitió aportar más evidencias a favor de la Teoría de Interacción Mínima.

El parasitoide bracónido Diachasmimorpha longicaudata es ampliamente utilizado como controlador biológico de moscas de los frutos; sin embargo, es escaso el conocimiento disponible sobre su genética. A fin de aportar información y mejorar su cría masiva, se estudió su sistema de determinación del sexo mediante la realización de cruzamientos de alta y baja endogamia, utilizando herramientas de citogenética para determinar el nivel de ploidía de la descendencia. Asimismo, se analizó su espermatogénesis y su cariotipo en detalle, realizando aportes a la Teoría de Interacción Mínima, desarrollada para el estudio de la evolución del cariotipo en Hymenoptera. En este parasitoide el sexo se determina por haplodiploidía (machos haploides, hembras diploides), pero en condiciones de alta endogamia ocurre un sesgo significativo de la proporción de sexos hacia machos, debido a la generación de machos diploides. El sexo estaría determinado por el estado de un promedio de tres loci no ligados. Los individuos homocigotas para los loci sexuales se desarrollan en machos diploides. Esta información permitirá mejorar los protocolos de cría masiva de la especie, tratando de minimizar el nivel de endogamia a fin de evitar un incremento en la producción de machos. El estudio citogenético permitió corroborar el número cromosómico descripto previamente. Se analizó la cantidad, composición y distribución de la heterocromatina constitutiva, se mapearon los “clusters” de genes ribosomales y se determinó la cantidad de “clusters” activos. La información obtenida permitió aportar más evidencias a favor de la Teoría de Interacción Mínima.

Apomixis is a mode of asexual reproduction through seeds that originate progeny that is genetically identical to the mother plant. It is significant in the subfamily Panicoideae and genera Paspalum and its importance is given by the evolutionary connotations and its implications in breeding plant. Paspalum (Poaceae) is a genus comprising between 330 and 400 natural species of tropical, subtropical and temperate regions, mainly from North America and South America. Plicatula group of Paspalum comprises many promising species as forage resources and several of them are typical on natural fields of northeastern Argentina. Most apomictic species are tetraploid and usually possess sexual diploid co-specific counterparts. Sexual tetraploid plants have not been found in nature so far. The objectives of this research were: to generate a segregating population for the reproductive mode by crossing Paspalum plicatulum 4PT (completely sexual, experimentally induced) and P. guenoarum GR19 (natural apomictic) at tetraploid level, to construct genetic linkage maps of both species, to localize the region responsible for apomixis on the male map, to investigate the mode of inheritance (tetrasomic or disomic) of both parental genotypes. An interspecific hybrid population of 211 F1 plants, segregating for reproductive mode, was generated. Classification of 206 hybrids showed that 127 of them were sexual and 79 apomictic. The progeny showed morphological characteristics intermediate compared to their parents but resembling more the male plant. Inheritance of apomixis in Plicatula species showed a segregation distortion of 1.6:1, favoring to sexual individuals. This proposed apomixis segregation model in Plicatula is a novelty for interspecific hybrids of Paspalum. P. guenoarum and P. plicatulum are autotetraploids and both species show tetrasomic inheritance, according to the DDA markers of both genotypes that fixed to the 5:1 ratio. Moreover, some regions of both parental genomes showed disomic inheritance (markers 3:1 and bivalent chromosome associations). Both species share the same basic genomic complement. Seventeen AFLP primer combinations were assayed in 89 F1 individuals (55 sexual and 34 apomictic). The female genetic linkage frame map consisted of 89 markers [39 maternal (1:1) and 50 biparental (3:1)] assigned to 11 cosegregation groups, covering a distance of 819 cM. The genetic male linkage frame map was formed by 127 markers [76 paternal (1:1 and 1:1.6) and 51 biparental (3:1)], that were distributed in 23 cosegregation groups, spanning 1393 cM. The linkage group carrying apomixis (apo group, M10) was identified on the male map. Seven markers mapped onto the M10 linkage group: the character apomixis, 5 paternal markers and a biparental marker. Paternal markers that mapped onto M10 and apomixis showed segregation distortion, thus confirming the distorted transmission of the character and its associated genomic region. Unlike the data for other aposporic Paspalum species and other grasses, markers completely linked to apomixis have not been detected in P. guenoarum. Two paternal markers mapped to 4 and 7 cM from apomixis locus. Results presented in this work indicated that Plicatula species may be different cases from those previously described in the genus. Probably, P. guenoarum represents a new model for studying apomixis in Paspalum.

En este estudio se realizaron dos análisis diferentes dentro del género Dichroplus. El primero involucra un análisis microevolutivo entre especies de Dichroplus elongatus. Se midió entonces la variabilidad intra e interpoblacional en siete poblaciones de Dichroplus elongatus localizadas en las Provincias de Tucumán y de Buenos Aires utilizando marcadores enzimáticos y de fragmentos de ADN amplificados al azar (RAPDs). Al estudiar la estructura poblacional por regiones (provincias) y globalmente se observó una tendencia hacia un exceso de homocigotas dentro de las poblaciones como se esperaría en poblaciones subestructuradas. La diferenciación entre poblaciones es significativa para tres loci enzimáticos, en concordancia con lo esperado para alelos que muestran una distribución clinal de sus frecuencias (Singh y Rhomberg, 1987). Hay cuatro lineas de evidencia que sugieren causas alternativas al "contacto secundario" (interacción entre deriva y migración) para explicar los patrones de variación direccional encontrados para dos loci en Dichroplus elongatus. En primer lugar, si se encuentran ejes concordantes para diferentes loci, el flujo génico en gran escala podría ser responsable de la variación clinal de las frecuencias alélicas; pero si, como en el caso de D. elongatus se encuentran diferentes variables en asociación con distintos loci entonces se debe invocar a la selección, excepto que estos loci se encuentren ligados (Barbujani 1988). Nuestros resultados apoyarían la hipótesis selectiva ya que Aat-1 y Pep-1 estan correlacionados con diferentes variables (Lat, Long, T.Min y T.Max: T.Max.Abs y T.Min.Abs respectivamente) sin mostrar ninguna correlación concordante con ninguna de las nueve variables estudiadas. En segundo lugar, el fenograma construido a partir de las distancias genéticas no se vinculan de acuerdo con lo esperado considerando las distancias geográficas. Concordantemente, la matriz de distancias geogróficas no esta correlacionada con la de distancias genéticas. En tercer lugar, el flujo génica estimado seria lo suficientemente elevado como para enmascarar las diferencias en las frecuencias alélicas si estas fueran originadas solamente por deriva genética. Por último, el patron de variación encontrado se mantiene incluso al incluir poblaciones muestreadas en distintos años. Esto sugiere que de alguna manera la variación clinal encontrada es estable en el tiempo. Un gradiente temporalmente estable debe ser mantenido por algún tipo de selección, de lo contrario el gradiente desaparecería. De esta manera, los resultados obtenidos sugieren la existencia de un probable efecto adaptativo de algunos loci alozímicos, que estaría determinado en última instancia por variables ambientales como la temperatura mínima, relacionadas con la latitud. A partir de los datos de variabilidad resultante del analisis de marcadores de ADN amplificados al azar se desprende que la variabilidad obtenida mediante isoenzimas no difiere significativamente de la obtenida mediante RAPDs. Si muchos de los productos de amplificación obtenidos mediante RAPDs representan ADN repetitivo deberíamos esperar niveles mas altos de variabilidad con marcadores RAPD que con isoenzimáticos. La ausencia de disparidad entre ambos estimadores es sugerida como una posible evidencia indirecta de la cantidad de ADN repetitivo presente en un genoma en particular. El valor de Fst calculado a partir de RAPDs es mucho mayor que el calculado a partir de datos alozímicos. Los primeros por ser considerados marcadores genéticos neutros daría más exactitud al valor de Fst comparado con uno que surge del calculo utilizando loci alozímicos que muestren alguna evidencia de no neutralidad. En los fenogramas construidos a partir de datos de RAPDs, las poblaciones se vinculan de acuerdo con lo esperado por las distancias geográficas. Este resultado no es consistente con los resultados alozímicos previos. Nuevamente esto podría deberse al uso de loci enzimóticos con una posible función selectiva y reforzaría la noción de neutralidad de los marcadores RAPD (que dan como resultado distancias genéticas y geográficas concordantes). Realizando un análisis macroevolutivo se llevaron a cabo también estudios sistemáticos dentro del género Díchroplus a través del análisis de los polimorfismos para fragmentos de restricción del ADN mitocondrialcon el finde llevar a cabo una reconstrucción filogenética dentro del género. Se desprende que a pesar que S. lemniscattase dispone naturalmente como grupo externo, tal como se esperaba de acuerdo a los datos morfológicos, el resto de los datos moleculares compilados no se corresponden con la clasificación taxonómica inferida para este grupo. La propuesta para un estudio mas exhaustivo sería la de incluir caracteres provenientes de genes nucleares y comparar las filogenias obtenidas con los tres métodos, construyendo matrices que incluyan todos los caracteres. A pesar de que los datos moleculares superan a los morfológicos en número generalmente son muy uniformes, dando como resultado pocos árboles. Se aplicaría entonces la combinación de caracteres, descartando la partición, ya que estudios que combinen ambos enfoques pueden maximizar la cantidad y utilidad de la información y darnos una visión mas comprensible de la evolución de los organismos.

El Complejo M tuberculosis (CMT) está formado por distintas especies de micobacterias entre las que se encuentra el agente causal de la tuberculosis en humanos, Mycobacterium tuberculosis y micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas como M. bovis, M. microti y M. pinnipedii. La genómica comparativa en micobacterias brinda una vasta información acerca de la relación entre los genomas de distintas micobacterias pertenecientes al CMT. En la primera parte de este trabajo se estudió la Región de Repeticiones Directas (DR). Esta región está compuesta por repeticiones directas conservadas de 36pb separadas por secuencias no repetitivas llamadas espaciadores (sps). El polimorfismo observado en esta región entre aislamientos de micobacterias pertenecientes al CMT dio origen a la técnica de tipificación, ampliamente aplicada en tuberculosis denominada Spoligotyping. La secuenciación y comparación de la región DR entre distintos aislamientos argentinos de M. bovis permitió encontrar 5 espaciadores nuevos. Estos espaciadores conjuntamente con una colección de otros descriptos previamente, fueron incluidos en una nueva membrana de spoligotyping obteniéndose un total de 104 espaciadores. La utilización del spoligotyping de lO4-sps. permitió la diferenciación de aislamientos del CMT en 174 spoligotipos, mientras que el uso de la membrana tradicional tipificó estos mismos aislamientos en 160 spoligotipos distintos. Particularmente para M. bovis se obtuvo un incremento de 17 a 26 spoligotipos respectivamente. El análisis comparativo in silico en micobacterias no pertenecientes al CMT como M. smegmatis, M. avium, M. marinum y M. leprae, permitió establecer que los marcos de lectura abiertos (MLAs) flanqueantes a la Región DR de M. tuberculosis, se encuentran adyacentes entre sí en estas otras micobacterias. En cambio en el genoma de M. tuberculosis esta región comprende 24kb. que incluyen 23 MLAs así como la región DR ausentes en las mencionadas micobacterias. Este resultado fue corroborado in vitro mediante amplificación por PCR. Debido a la ausencia del locus DR descripto y los MLAs adyacentes, en M. avium y M. smegmatis y debido a que estas micobacterias fueron descriptas como más antiguas que M. tuberculosis, se postula que esta región podría haber sido adquirida por las especies del CMT o por un ancestro común a ellas a lo largo del proceso evolutivo. La segunda parte de este trabajo implicó el estudio de la variabilidad genética entre distintos aislamientos de M. bovis, M. microti y M. pinnipedii, estas últimas responsables de tuberculosis en ratones de campo denominados “vole” y en mamíferos marinos respectivamente, mediante comparación de genomas completos. Se encontró una nueva deleción en M. microti denominada MiD4. Esta región remueve 5 genes que codifican para antígenos de la familia ESAT-6 y PE-PPE. En M. pinnipedii se encontraron dos nuevas deleciones, PiD1 que removió dos genes, uno de los cuales codifica para una oxidoreductasa (Rv3530c) involucrada en el metabolismo celular. La segunda deleción PiD2, fue denominada como RD2seal debido a estar superpuesta con la región de 10.7kb, RD2, ausente en algunas M. bovis BCG. Esta región abarca los genes Rv1977 y Rv1978. Los experimentos de Southern blot mostraron que MiD4 está también ausente en M pinnipedii, en cambio PiDl es una deleción específica para M. pinnipedii. Por otra parte mediante la comparación del genoma de M. bovis con el genoma de M. tuberculosis in silico, se pudieron identificar nuevos marcadores capaces de diferenciar entre estas dos especies y respecto de otras especies del CMT. Uno de estos nuevos marcadores denominado rpfA presentó polimorfismos en los aislamientos de M. bovis estudiados, lo que podría ser usado en la tipificación y diferenciación.

El desarrollo de nuevos y asequibles métodos para la secuenciación de genomas completos, sumado al diseño de grandes proyectos de anotación genómica producen una gran cantidad de información que debe convertirse en datos funcionales. Dentro de este contexto, el análisis comparativo contribuye a generar información clave tanto para comprender la evolución como para la simple identificación génica en organismos desconocidos hasta el momento. Rhodnius prolixus surgió como organismo modelo de estudio en un primer momento para estudios fisiológicos y bioquímicos, los cuales fueron llevados a cabo por Sir V. B. Wigglesworth. Pasados los años y con el advenimiento de las técnicas moleculares, así como también la disponibilidad y acceso a las tecnologías de secuenciación masiva de segunda generación, se re-direccionó el foco de investigación a estudios genéticos. Contando como base con los estudios llevados a cabo en la década del 70 por Erwin Huebner sobre la morfología y citología de la estructura del ovario en R. prolixus, en este trabajo se propuso profundizar su descripción con técnicas moleculares modernas y analizar el perfil transcripcional de los ARN mensajeros durante la oogénesis y embriogénesis, para determinar la expresión génica en las diferentes etapas del desarrollo y validar la función de los genes relacionados con la oogénesis y con su contribución materna al huevo. Se generó información sobre el genoma expresado de R. prolixus desde la etapa de la oogénesis hasta los primeros estadios embrionarios. El material crudo obtenido tras la secuenciación se procesó para efectuar el posterior ensamble. Los transcriptos reconstruidos fueron constatados contra la base de datos generada a partir de los genes conocidos que se expresan durante el desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster. De esta manera, se identificó un amplio repertorio de genes que se expresan durante los estadios estudiados, de los cuales se analizaron experimentalmente Bicaudal C, Bicaudal D y cornichon. Estos se validaron funcionalmente mediante la interferencia del ARN (ARNi) parental; en donde se evaluó analizando fertilidad y fenotipo a nivel de ovario, huevo y embrión. Se observó que Bicaudal C presenta un patrón de expresión materno y folicular en el ovario. Actúa manteniendo la estructura del epitelio folicular de manera organizada durante todo el proceso de oogénesis, dando lugar a una acumulación controlada de vitelo y a un correcto establecimiento del corion. Bicaudal D se vio que es necesario para la producción de huevos embrionados. Su silenciamiento génico llevó a la oviposición de huevos en los cuales no fue posible identificar ninguna estructura característica que permita inferir los ejes embrionarios que determinan el patrón corporal. Presenta una expresión génica materna y folicular a nivel del ovario; así como también expresión a nivel embrionario, exceptuando el estadio de cigoto, donde no se evidenció presencia alguna. cornichon no presentó función alguna durante la embriogénesis, aunque sí exhibió una activa expresión génica durante el desarrollo embrionario temprano, desde el estado de huevo no fertilizado hasta embrión gastrulante.

Objetivos generales de la tesis: Con el desarrollo de esta propuesta se espera contribuir al conocimiento que sirva de base para el diseño de una vacuna más efectiva contra pertussis, no sólo en términos generales, sino en lo que se refiere a su efectividad en Argentina, determinando la definición de la/s cepas / componentes a incluir en una nueva formulación. Objetivos específicos de la tesis: En este marco conceptual y tomando como hipótesis la divergencia de la población bacteriana circulante respecto a las cepas vacunales hoy en uso, se proponen los siguientes objetivos: 1-Caracterizar mediante la aplicación de técnicas de genómica funcional los aislamientos de B. pertussis locales. Identificar de nuevos inmunógenos. Los aislamientos clínicos de nuestra colección han sido previamente agrupados en base a sus divergencias a nivel de las secuencias que codifican para antígenos específicos, así como en su genoma completo a través de los ensayos de PFGE y los años en que fueron aislados. Proponemos abordar la búsqueda de diferencias específicas, a nivel de expresión génica, entre los aislamientos circulantes y las cepas que hoy se usan en la producción de vacunas. Para ello hemos emplearemos herramientas de genómica funcional, proteómica e inmunoblot; para identificar potenciales candidatos vacunales a incorporar en una formulación acelular. 2-Analizar la relevancia de la divergencia genética entre la Población Bacteriana Circulante (PBC) y las cepas vacunales respecto a la protección contra pertussis. Para abordar este punto emplearemos el modelo animal de desafío intranasal. Consideramos que la información obtenida marcará la necesidad o no de incluir determinadas variantes polimórficas para obtener una nueva vacuna más efectiva. El abordaje de este aspecto se espera también contribuya al conocimiento general de la adaptación y evolución bacteriana bajo la presión de selección ejercida por las diferentes estrategias de vacunación (celular/acelular).