Catálogo de publicaciones

El trabajo en el que se basa esta tesis representa un aporte al conocimiento de nuevos elementos del metabolismo del parásito Trypanosoma cruzi. En particular, describe genes encargados de transportar metabolitos esenciales para este organismo. Pero, más que nada, es un aporte para una futura sistematización en el estudio de moléculas transportadoras. Acerca del organismo estudiado podemos describir al Trypanosoma cruzi como el agente causal de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica en Argentina y en toda América Latina. Este parásito presenta numerosas características metabólicas diferenciales respecto a sus hospedadores insectos y mamíferos, siendo incapaz de sintetizar numerosos componentes celulares. Sin embargo, esta incapacidad metabólica es compensada mediante sistemas transportadores de múltiples metabolitos desde el hospedador. Luego de la reciente secuenciación del genoma de T.cruzi, se estima que existen al menos 374 genes que codifican para distintos transportadores distribuidos en tres grupos principales: canales iónicos, transportadores dependientes de ATP y transportadores secundarios. En este trabajo se estudio con énfasis a la familia de transportadores de aminoácidos denominada AAAP (Amino Acid Auxin Permease) de T. cruzi (TcAAAP). El estudio bioinformático de esta familia demostró que todos sus miembros poseen diferencias en sus extremos amino terminales pero tienen un alto nivel de identidad en el resto de sus secuencias, llegando hasta el 75% de similitud. Luego de evaluar diferentes estrategias para la correcta expresión heteróloga de estas moléculas, se encontraron exitosas las llevadas a cabos en ovocitos de Xenopus laevis y células de Saccharomyces cerevisiae. El modelo de ovocitos de Xenopus permitió identificar y caracterizar a un transportador con afinidad para la poliamina espermidina, la cual T. cruzi es incapaz de sintetizar de novo. En cuanto al estudio en diferentes modelos de levaduras, se logró expresar funcionalmente tres transportadores específicos para los aminoácidos prolina, arginina y lisina. En el caso de los dos primeros, estos pudieron ser caracterizados desde el punto de vista molecular y relacionados con datos bioquímicos previos, que integran el transporte de estos aminoácidos con el metabolismo energético del parásito. Finalmente, la permeasa de lisina fue extensamente estudiada. Se realizó una caracterización bioquímica del transporte de este aminoácido en epimastigotes en cultivo y se produjeron numerosas construcciones para su manipulación génica. Esta metodología se utilizó para comprobar la actividad y especificidad de la permeasa, además de su localización subcelular en el bolsillo flagelar, donde, probablemente, ocurre el ingreso de diversos metabolitos a la célula a través de transportadores. Por lo tanto y como se mencionó anteriormente, en este trabajo se identificaron y estudiaron por primera vez moléculas involucradas en el transporte de aminoácidos y poliaminas en Trypanosoma cruzi, nutrientes esenciales para la vida de este parásito.

Comprender la relación entre la variación fenotípica y la genotípica ha sido y sigue siendo uno de los mayores desafíos de la biología moderna, ya que implica alcanzar una interpretación holística de la descripción de caracteres complejos y sus relaciones evolutivas utilizando de manera conjunta herramientas de la genómica funcional, la genética cuantitativa, la bioinformática y la genética ecológica. En insectos fitófagos el comportamiento de oviposición constituye un componente importante de la elección de hábitat. Dada la multiplicidad de factores genéticos y ambientales que parecen afectar su expresión fenotípica, el mismo puede definirse como un carácter complejo resultante de la participación de varios caracteres interdependientes. En esta tesis nos proponemos contribuir al conocimiento de la arquitectura genética del comportamiento de oviposición por medio del estudio genómico poblacional de dos caracteres complejos relacionados, la preferencia por el sitio de oviposición (PO) y la aceptación de recursos de oviposición (AO) en la especie modelo Drosophila melanogaster. Para cumplir con nuestros objetivos, cuantificamos la PO y la AO utilizando recursos que las moscas explotan como sustratos de cría en su hábitat natural: uva, tomate y naranja. Los resultados mostraron amplia variación fenotípica tanto de la AO como de la PO en todos los recursos y combinaciones de recursos ofrecidos. Para ambos caracteres, encontramos que la variación tiene una base genética y que su expresión depende del recurso (o combinación de recursos) ofrecido. En otras palabras se trata de caracteres cuya expresión depende del ambiente (plasticidad fenotípica). Posteriormente, realizamos análisis de asociación entre la variación fenotípica y la variación genética con el objetivo de establecer la arquitectura genética de la AO y la PO. Encontramos que la arquitectura genética de ambos caracteres es poligénica y que los genes que participan de su expresión se encuentran interactuando en redes génicas relacionadas con el desarrollo del sistema nervioso y del sistema visual. Finalmente, identificamos genes que actúan a través de los distintos niveles que conforman el mapa genotipo – fenotipo, presentando evidencia de su accionar en cada nivel por medio de los análisis de asociación entre la variación fenotípica y la variación a nivel transcriptómico. Podemos concluir, que a lo largo de la presente tesis hemos contribuido al estudio del comportamiento de oviposición, aportando evidencia de cómo se compone la arquitectura genética del mismo a través de los distintos niveles del mapa fenotipo-genotipo e infiriendo la importancia del comportamiento de oviposición en la historia evolutiva de D. melanogaster.

Sterkel, M. (2011). Genómica y proteómica de neuropéptidos en Rhodnius prolixus (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

En Argentina existen aproximadamente 2.300.000 infectados de Chagas. El control del insecto vector continúa siendo la opción más viable como control y prevención de la enfermedad. En las últimas dos décadas se detectó la existencia de poblaciones de triatominos resistentes a insecticidas (Triatoma infestans), en las provincias de Chaco, Salta, y en el Sur de Bolivia. Esto representa un grave riesgo para el control de la enfermedad de Chagas en Argentina y la región. El presente trabajo utiliza como organismo modelo al triatomino R. prolixus. Este insecto reúne una serie de características favorables para su uso como modelo en fisiología de insectos: es el segundo vector más importante de la enfermedad de Chagas; posee características favorables para su cría; se conoce su secuencia genómica; los resultados obtenidos en R. prolixus potencialmente pueden aplicarse a otros triatominos, en incluso otros insectos. Particularmente, para estudios de desarrollo post-embrionario como los realizados en este trabajo, una ventaja del modelo es que el ciclo de muda se desencadena de manera predecible tras la ingesta de sangre, lo que permite sincronizar los experimentos. Este trabajo de Tesis se inscribe en el marco de alcanzar alternativas de control de insectos perjudiciales, que resulten más eficientes, selectivas y seguras para el medio ambiente respecto a los insecticidas neurotóxicos en uso. En éste sentido, se estudian los neuropéptidos, hormonas peptídicas que regulan todos los procesos vitales en organismos multicelulares. El estudio de estas moléculas tiene potencial aplicabilidad para el diseño de insecticidas. Podría permitir el diseño de pseudo-péptidos o péptido-miméticos capaces de interferir con la fisiología de insectos de importancia sanitaria o económica, constituyendo una vía novedosa hacia la obtención de nuevos insecticidas.

En Argentina existen aproximadamente 2.300.000 infectados de Chagas. El control del insecto vector continúa siendo la opción más viable como control y prevención de la enfermedad. En las últimas dos décadas se detectó la existencia de poblaciones de triatominos resistentes a insecticidas (Triatoma infestans), en las provincias de Chaco, Salta, y en el Sur de Bolivia. Esto representa un grave riesgo para el control de la enfermedad de Chagas en Argentina y la región. El presente trabajo utiliza como organismo modelo al triatomino R. prolixus. Este insecto reúne una serie de características favorables para su uso como modelo en fisiología de insectos: es el segundo vector más importante de la enfermedad de Chagas; posee características favorables para su cría; se conoce su secuencia genómica; los resultados obtenidos en R. prolixus potencialmente pueden aplicarse a otros triatominos, en incluso otros insectos. Particularmente, para estudios de desarrollo post-embrionario como los realizados en este trabajo, una ventaja del modelo es que el ciclo de muda se desencadena de manera predecible tras la ingesta de sangre, lo que permite sincronizar los experimentos. Este trabajo de Tesis se inscribe en el marco de alcanzar alternativas de control de insectos perjudiciales, que resulten más eficientes, selectivas y seguras para el medio ambiente respecto a los insecticidas neurotóxicos en uso. En éste sentido, se estudian los neuropéptidos, hormonas peptídicas que regulan todos los procesos vitales en organismos multicelulares. El estudio de estas moléculas tiene potencial aplicabilidad para el diseño de insecticidas. Podría permitir el diseño de pseudo-péptidos o péptido-miméticos capaces de interferir con la fisiología de insectos de importancia sanitaria o económica, constituyendo una vía novedosa hacia la obtención de nuevos insecticidas.

Según el último informe (diciembre de 2010) del Programa Conjunto de las aciones Unidas sobre el VIH / sida y la Organización Mundial de la Salud, 34 millones de personas en todo el mundo sufren de la infección por VIH / sida. 2,7 millones personas se infectan cada año con el virus, y 1,8 millones de personas mueren por causas relacionadas con el sida. Entre 70 y 90% de los enfermos con infección por VIH presentan compromiso del SNC. El complejo C.neoformans/C. gattii es el grupo de levaduras más frecuentemente recuperado de muestras clínicas después de las del género Candida, (32,9% de 8.717 aislamientos). Además, la criptococosis es la segunda infección fúngica grave más común en ciertas regiones del mundo. Las infecciones causadas por C. neoformans var. grubii (serotipo A) y en menor grado, por C. neoformans var. neoformans (serotipo D) se ven en todo el mundo entre los huéspedes inmunocomprometidos. En Honduras se realizó un estudio en el año 1999 en el Hospital Escuela Universitario y el Instituto Cardiopulmonar (INCP) y se detectó que las micosis predominantes por orden de frecuencia fueron: candidiasis 63%, criptococosis 29% e histoplasmosis 8%; con predominio del sexo masculino con una relación de 1,7:1 en pacientes con VIH. El propósito de este estudio fue demostrar la presencia de Cryptococcus en nuestras ambientales y de pacientes, identificar las especies mediante pruebas bioquímicas y el medio CGB (canavanina, glicina, azul de bromotimol) que permite diferenciar C. neoformans de C. gattii. En la actualidad con el empleo de diversas técnicas moleculares como la PCR huella digital y el RFLP del gen URA5, se han reconocido ocho grandes tipos moleculares: VNI, VNII, VNIII y VNIV de C. neoformans y VGI, VGII, VGIII y VGIV para C. gattii (1). Mediante las técnicas moleculares ALFP y MSLT se identificó a VNB (2). La vigilancia molecular de los aislamientos del complejo C. neoformans/C. gattii es una herramienta epidemiológica de gran valor, teniendo en cuenta que la criptococosis ha adquirido un gran interés debido al número creciente de pacientes inmunocomprometidos en los últimos años y además al aumento de criptococosis debidas a C. gattii en individuos inmunocompetentes. Materiales y métodos. El enfoque del presente estudio fue cuantitativo, descriptivo, diseño no experimental. La población objeto de estudio fueron las levaduras de Cryptococcus, aisladas de muestras clínicas (principalmente LCR y esputo) a las que se les realizó un examen directo con tinta china y cultivos a 25 ºC y 37 ºC. Además se llevó a cabo la recolección de muestras ambientales: excretas de aves, detritos de árboles, hojas y flores en las áreas verdes del INCP. El muestreo se realizó mensualmente en un período de 3 meses, las muestras se procesaron según la técnica de Shields y Ajello, se sembraron en medio agar Níger, se incubaron a 28 °C y se observaron durante siete días. Se identificaron las colonias levaduriformes, mucoides con pigmentación marrón, estas fueron reaisladas en medio de Sabouraud para obtener cultivo puro y luego se realizó montaje con azul de lactofenol y con tinta china, prueba de ureasa en medio de Christensen y por micrométodo. Además se les realizaron las siguientes pruebas; crecimiento a 37 °C, prueba de asimilación de nitrato de potasio, sensibilidad a la cicloheximida, producción de tubo germinal y seudohifas. Luego se identificaron con las galerías API 20C Aux y se diferenciaron, el complejo C. neoformans del complejo C. gattii de acuerdo con los resultados en el medio CGB, según la metodología descrita por Meyer y Escandón. Resultados: Se analizaron 300 muestras ambientales, El 100% presentaban las características coloniales y celulares del género Cryptococcus, todas presentaban cápsula, eran ureasa positiva, crecieron a 37 ºC, fueron negativas a los nitratos, no formaron seudohifas y mostraron sensibilidad a la cicloheximida. Las 42 cepas de Cryptococcus aisladas en muestras ambientales y clínicas se identificaron mediante API 20C AUX de las cuales 34 (80,95%) fueron identificadas como C. neoformans, 7 (16,66 %) C. laurentii y 1 (2.38%) C.uniguttulatus. Según resultados en el medio de CGB: 10/42 (23.8%) pertenecen a C. gat- tii, 29/42 (69%) aislamientos C. neoformans, y las tres restantes: 1/42 (2.4%) C. unigutullatus y 2/42 (4.8%) C. laurentii. Los 29 aislamientos de C. neoformans y los de 10 C. gattii se genotipificaron por la técnica molecular RFLP del gen URA5. De los 29 de C. neoformans; 19 (65,5%) presentaron patrón molecular VNI de estas 12 (63,2%) aislamientos eran de origen ambiental (P0,0001) y 7 (36,8%) clínicos (P0,0001): 10 (34,5%) aislamientos presentaron patrón molecular VNII, 8 (80%) de origen ambiental (P = 0.0031) y 2 (20%) clínicos (P0,005) De los 29 (69,04%) aislamientos de C. neoformans, 19 fueron VNI y 10 VNII: 15 (51,7%)(12 VNI y 3 VNII) aislamientos, se obtuvieron en excretas de aves, 5 (17,24%) (5 VNII), en el ambiente y 9 (31,03%) (7 VNI y 2 VNII) en muestras de LCR. Se analizaron 10 aislamientos de C. gattii: 3 de origen clínico y 7 ambientales, de los 10 (23.81%) 7 fueron VGI y 3 VGII; 7 (70%) (6 VGI y 1 VG II), en muestras ambientales: 6 aislamientos (42,85%) en Eucalyptus camandulenses y 1 (7,14%) en hojas de Enterolobium cyclocarpum, y 3 (30 %) (1 VGI y 2 VGII) de origen clínico: 2 (20%) (2 VGII) en LCR y 1 (10%) (VGI) en esputo. 1(7,14%) de C. laurentii se encontró en ambiente y 1(7,14%) en LCR, y 1 (7,14%) de C. uniguttulatus en hojas de Eucalyptus camalduliensis. Con este estudio se demostró la presencia de C. neoformans / C.gattii en las muestras de origen clínico y ambiental, y la estrecha relación de C. neoformans con las excretas de aves Columba livia que construyen sus nidos en el espacio del cielorraso que cubre las salas de internación de pacientes con VIH-sida y pacientes con tuberculosis. Por otra parte, los aislamientos de C. gattii estarían en relación con los árboles de E. camalduliensis presentes en el área verde del INCP. Se evidenció la presencia de C. laurentii y de C. uniguttulatus especies que ocasionalmente pueden llegar a producir cuadros clínicos en individuos inmunocomprometidos. Se evaluó la capacidad de formación de cápsula en las cepas de origen clínico y ambientales. El tamaño inicial de la cápsula fue entre 0,5 a 2 micras y el tamaño de las células de 1 a 3 micras. Después de la inducción, el tamaño de la cápsula fue de 2 a 6 micras y el de las célula entre 6 y 14 micras, este último dato, lo presentó una cepa de C. gattii (VGI) de origen ambiental. C. neoformas (VNI y VNII), fueron capaces de desarrollar una cápsula de 6 a 12 micras. La morfología colonial de los 42 aislamientos fue: 6 (14,3%) lisas, 6 (14,3%) rugosas y 30 (71,4%) mucoides, de los aislamientos mucoides: 23 (54,7%) pertenecen a C. neoformans, 4 (13,3%) a C. gattii , 2 (6,6%) a C. laurentii y 1 (3,33%) a C. uniguttulatus. Se observó que de los aislamientos mucoides: 23 (54,7 %) pertenecen a C. neoformans (18 VNI y 5 VNII), 7 VNI de origen clínico y 11 ambientales: de los 5 slamientos VNII,fueron 2 clínicos y 3 ambientales. 4 (13,3%) aislamientos de C. gattii (4 VGI), 2 (6,6%) a C. laurentii y 1 (3,33%) C. uniguttulatus. De las 6 (14.3%) colonias rugosas, 5 (83,3%) eran de C. gattii (3 VGII y 2 VGI) y 1 (16,6%) de C. neoformans (VNI). De las 6 colonias lisas 5 (83,3%) eran aislamientos de C.neoformans (5 VNII) y 1 (16,6%) C. gattii (1 VGI). El aspecto mucoide, así como la presencia de colonias rugosas y el tamaño de la cápsula son indicadores de la capacidad patogénica. Se evaluó la producción de fenoloxidasa en diferentes medios de cultivo, utilizando varias semillas con propiedades bioquímicas similares a Helianthus annus (HA), agar semilla girasol. Se utilizó: Dioclea megacarpa (DM), Canavalia ensiformis (CE), Moringa oleífera (MO), Phaseolus vulgaris (PV), Mucuna pruriens (MP) y Linun usitatissimum (LU). Se estandarizaron con cepas de referencia de Cryptococcus, y se usó como control negativo una cepa de Candida albicans. El 50% de las cepas antes mencionadas, presentaron pigmento café de 3-6 horas en el medio MP, el 100% de las cepas presentaron pigmento café a las 48 horas de evidenciarse la colonia en todos los medios de cultivo. En cuanto a las cepas de C. neoformans y C. gattii, clínicas y ambientales: en el medio de cultivo MP: 29 (69%) de las cepas presentaron pigmento a las seis horas, entre estas están: 15 VNI, (10 de origen ambiental y 5 clínicos), 6 VNII (4 ambientales y 2 clínicos), 5 VGI (4 ambientales y 1 clínico) 3 VGII (1 ambiental y de origen 1 clínico). Diez (24%) a las doce horas: 4 VNI (2 ambientales y 2 clínicos), 4 VNII (ambientales) y 2 VGI (ambientales) y el 100% a las 24 horas después de evidenciada la colonia. En los medios de cultivo MD, CE y MO presentaron pigmento después de las 24 horas: 36 (85,7%), 35 (83,3%) y 36 (85,7%) respectivamente. Las 3 (7%) cepas: 1 C. uniguttulatus y 2 C. laurentii presentaron a una coloración tenue a las 72 horas. Aunque todos los medios de cultivo mostraron producción de pigmento, fue el medio (MP) Mucuna pruriens el que presentó cambio de color a partir de las tres horas de haberse evidenciado la colonia, además fue el más intenso. Se utilizaron cepas de referencia de Cryptococcus en la producción de la ureasa, los valores de las absorbancias fueron de 0,297 a 0,462. La valoración de la producción de ureasa en cepas de Cryptococcus de origen ambiental y clínico fue entre 0,179 y 0,458 de absorbancia. Las cepas de C. gattii, (VGI) de origen ambiental presentaron los niveles de absorbancia mas bajos, entre 0,179 y 0,218. Las cepas que presentaron las absorbancias mas elevadas, 0,389 y 0,458 fue C. neoformans (VNI) 7 cepas de origen ambiental y 4 de origen clínico. Dos cepas de C. gattii VGII de origen ambiental presentaron valores elevados, 0,373 y 0,376 de absorbancia. C. gattii aunque presente valores más bajos con respecto a C. neoformans u otras especies la producción de ureasa siempre juega un papel importante en su virulencia. Se estudiaron 13 aislamientos clínicos, 12 (92,3%) de LCR y 1(7,3%) de esputo. Nueve fueron C. neoformans, 7 VNI y 2 VNII. Tres fueron C. gattii, 1 VGI y 2 VGII. 1 aislamiento de C. laurentii en LCR. Las muestras fueron obtenidas de pacientes con un rango de edad entre 23 y 77 años con una media de 44,6 años. Los pacientes analizados durante este período 5 (38%) eran del sexo femenino y 8 (62%) del sexo masculino con una razón hombre/mujer de 1,5:1. Esto se explica porque en Honduras el VIH tiene una relación hombre/mujer de 1,1:1, por lo que la criptococosis afectaría más al sexo masculino. De 13 pacientes estudiados 2 (15,4%) presentaron recurrencia; 1 paciente presentó tres episodios a lo largo de 9 meses y otro falla de respuesta al tratamiento. Doce pacientes eran VIH positivos y 1 era VIH negativo con hipertensión e hiperlipidemia como enfermedad de base. Todos los pacientes fueron tratados con fluconazol y anfotericina B. Los pacientes que presentaron recurrencia tenían como antecedente abandono de tratamiento antirretroviral. En este estudio se demostró que la relación de C. neoformans / C. gattii es de 2,9:1, aunque en Centro y Sur América se han reportado una relación de 3,5:1, nuestros datos mantienen la misma tendencia de que la especie predominante es C. neoformans. En Oceanía y América del Norte, 1,5:1, donde C. gattii es la especie aislada predominante. En relación a C. gattii de las 10 cepas: 7 (70%) presentaron patrón molecular VGI (6 de origen ambiental y 1 de origen clínico), 3 (30%) patrón molecular VGII (1 de origen ambiental y 2 de origen clínico). Se encontró diferencias en el patrón predominante de C. gattii que, en nuestros resultados fue VGI mientras que los aislamientos del serotipo B son agrupados en su mayoría en el patrón VGII.

Monteserin, J. (2016) Genotipos de Mycobacterium tuberculosis prevalentes en Argentina y su relación con mutaciones de resistencia a isoniacida (Tesis de posgrado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina

Los estudios llevados a cabo en el presente trabajo de Tesis Doctoral, tuvieron como objetivo general, evaluar la capacidad deletérea del herbicida flurocloridona y de dos de sus formulaciones comerciales Twin Pack Gold® y Rainbow® empleadas en el agro de nuestro país conteniendo un 25% del principio activo. Estos formulados se emplean en el tratamiento de cultivos agrícolas como algodón, apio, arveja, avena, cebada, centeno, lenteja, perejil, zanahoria, caña de azúcar, girasol, papa y trigo, entre otros. Para evaluar la toxicidad del mencionado herbicida y de sus formulaciones comerciales, se emplearon como modelo de estudio in vitro dos líneas celulares de mamífero (CHO-K1 y HepG2) y como modelo in vivo larvas del anfibio anuro Rhinella arenarum. Los efectos genotóxicos de dichos herbicidas, fueron investigados mediante el estudio de biomarcadores de efecto, analizando la frecuencia de intercambios de cromátidas hermanas (ICHs) y los ensayos cometa (EC) y de micronúcleos (MN). En la línea celular CHO-K1 todos los compuestos ensayados fueron capaces de inducir ICHs con concentraciones de 0,25-15 μg/ml. La capacidad de los compuestos para inducir ICHs fue: Twin Pack Gold® > FLC > Rainbow®. El formulado comercial Twin Pack Gold® fue el único compuesto capaz de incrementar la frecuencia de MN con la concentración de 5 μg/ml. Además, las mayores concentraciones ensayadas de ambos formulados (10-15 μg/ml) resultaron ser citotóxicas tal cual fue evidenciado a través de cambios morfológicos, pérdidas de la integridad de la membrana plasmática y alteraciones nucleares que no permitieron monitorear la frecuencia de MN. Todos los compuestos fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN, evidenciado mediante la variante alcalina del EC con todas las concentraciones ensayadas. En células HepG2, al igual que en las células CHO-K1, sólo el formulado Twin Pack Gold® fue capaz de incrementar la frecuencia de MN a la concentración de 5 μg/ml, no pudiéndose monitorear la frecuencia de MN con las concentraciones de 10-15 μg/ml de ambos formulados comerciales debido a la aparición de alteraciones celulares como ocurrió en el sistema celular CHO-K1. El análisis de los compuestos estudiados evidenció que fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN con todas las concentraciones ensayadas lo cual fue evidenciado mediante el análisis de los nucleoides obtenidos en el EC. Los efectos citotóxicos fueron evaluados mediante el análisis del índice de proliferación celular (IPC), el índice mitótico (IM), el índice de división nuclear (IDN), los ensayos colorimétricos de captación de Rojo Neutro y MTT (RN y MTT, respectivamente) y el estudio de muerte celular programada o apoptosis. En la línea celular CHO-K1 los resultados revelaron que el IPC decrece en función de la concentración empleada de todos los compuestos ensayados y para una concentración dada, la capacidad de ambas formulaciones comerciales de inducir un retraso en la progresión del ciclo celular siempre fue mayor que la inducción producida por el principio activo FLC. Asimismo, se observó actividad mitodepresiva ejercida tanto por el principio activo como por los formulados comerciales. Asimismo, se observó una marcada reducción de la actividad mitocondrial con las mayores concentraciones ensayadas de todos los compuestos. Cuando se realizó el ensayo de RN únicamente la formulación comercial Rainbow® ejerció efecto citotóxico a nivel lisosomal. El estudio de la viabilidad celular evidenció que los formulados comerciales resultaron ser más citotóxicos que el principio activo FLC. En células HepG2 se observó que solamente los formulados comerciales fueron capaces de inducir una alteración de la actividad mitocondrial y lisosomal. Además, se observó inducción de apoptosis cuando las células fueron expuestas durante 24 h a todos los compuestos. En sistemas in vivo, de larvas de R. arenarum, se determinó una CL5096 h con valores de 2,96 mg/L para Twin Pack Gold® y de 2,85 mg/L para Rainbow®. Sólo el formulado Rainbow® fue capaz de incrementar a las 48 h de exposición la frecuencia de MN en eritrocitos circulantes con la concentración de 0,71 mg/L. Por el contrario, ambos formulados fueron capaces de inducir efecto genotóxico con todas las concentraciones empleadas tanto a las 48 como a las 96 h de exposición evaluadas mediante el EC. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se propuso que la respuesta diferencial encontrada en cada modelo de estudio frente a los compuestos podría deberse a la presencia de xenobióticos de naturaleza desconocida presentes en el excipiente de las formulaciones comerciales, así como a variaciones en la sensibilidad diferencial de los modelos en estudio. Los resultados de los estudios de mortalidad, genotoxicidad y citotoxicidad de FLC, Twin Pack Gold® y Rainbow® obtenidos en el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, representan una evidencia concreta de que el herbicida FLC debe ser tenido en cuenta como un agente inductor de daño genotóxico y citotóxico, y debería ser clasificado, según los valores de toxicidad aguda CL5096 h obtenidos mediante la exposición de larvas de R. arenarum a Twin Pack Gold® y Rainbow®, como compuesto tóxico (categoría II), siguiendo la clasificación propuesta por Instituciones reguladoras tales como OECD y UN. Asimismo, se sugiere la necesidad de una correcta evaluación toxicológica de FLC y de las formulaciones comerciales existentes del herbicida antes que continúen siendo aplicadas masivamente en nuestro país y en el mundo, representando un factor de riesgo para los organismos expuestos, incluyendo al ser humano.

Los estudios llevados a cabo en el presente trabajo de Tesis Doctoral, tuvieron como objetivo general, evaluar la capacidad deletérea del herbicida flurocloridona y de dos de sus formulaciones comerciales Twin Pack Gold® y Rainbow® empleadas en el agro de nuestro país conteniendo un 25% del principio activo. Estos formulados se emplean en el tratamiento de cultivos agrícolas como algodón, apio, arveja, avena, cebada, centeno, lenteja, perejil, zanahoria, caña de azúcar, girasol, papa y trigo, entre otros. Para evaluar la toxicidad del mencionado herbicida y de sus formulaciones comerciales, se emplearon como modelo de estudio in vitro dos líneas celulares de mamífero (CHO-K1 y HepG2) y como modelo in vivo larvas del anfibio anuro Rhinella arenarum. Los efectos genotóxicos de dichos herbicidas, fueron investigados mediante el estudio de biomarcadores de efecto, analizando la frecuencia de intercambios de cromátidas hermanas (ICHs) y los ensayos cometa (EC) y de micronúcleos (MN). En la línea celular CHO-K1 todos los compuestos ensayados fueron capaces de inducir ICHs con concentraciones de 0,25-15 μg/ml. La capacidad de los compuestos para inducir ICHs fue: Twin Pack Gold® > FLC > Rainbow®. El formulado comercial Twin Pack Gold® fue el único compuesto capaz de incrementar la frecuencia de MN con la concentración de 5 μg/ml. Además, las mayores concentraciones ensayadas de ambos formulados (10-15 μg/ml) resultaron ser citotóxicas tal cual fue evidenciado a través de cambios morfológicos, pérdidas de la integridad de la membrana plasmática y alteraciones nucleares que no permitieron monitorear la frecuencia de MN. Todos los compuestos fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN, evidenciado mediante la variante alcalina del EC con todas las concentraciones ensayadas. En células HepG2, al igual que en las células CHO-K1, sólo el formulado Twin Pack Gold® fue capaz de incrementar la frecuencia de MN a la concentración de 5 μg/ml, no pudiéndose monitorear la frecuencia de MN con las concentraciones de 10-15 μg/ml de ambos formulados comerciales debido a la aparición de alteraciones celulares como ocurrió en el sistema celular CHO-K1. El análisis de los compuestos estudiados evidenció que fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN con todas las concentraciones ensayadas lo cual fue evidenciado mediante el análisis de los nucleoides obtenidos en el EC. Los efectos citotóxicos fueron evaluados mediante el análisis del índice de proliferación celular (IPC), el índice mitótico (IM), el índice de división nuclear (IDN), los ensayos colorimétricos de captación de Rojo Neutro y MTT (RN y MTT, respectivamente) y el estudio de muerte celular programada o apoptosis. En la línea celular CHO-K1 los resultados revelaron que el IPC decrece en función de la concentración empleada de todos los compuestos ensayados y para una concentración dada, la capacidad de ambas formulaciones comerciales de inducir un retraso en la progresión del ciclo celular siempre fue mayor que la inducción producida por el principio activo FLC. Asimismo, se observó actividad mitodepresiva ejercida tanto por el principio activo como por los formulados comerciales. Asimismo, se observó una marcada reducción de la actividad mitocondrial con las mayores concentraciones ensayadas de todos los compuestos. Cuando se realizó el ensayo de RN únicamente la formulación comercial Rainbow® ejerció efecto citotóxico a nivel lisosomal. El estudio de la viabilidad celular evidenció que los formulados comerciales resultaron ser más citotóxicos que el principio activo FLC. En células HepG2 se observó que solamente los formulados comerciales fueron capaces de inducir una alteración de la actividad mitocondrial y lisosomal. Además, se observó inducción de apoptosis cuando las células fueron expuestas durante 24 h a todos los compuestos. En sistemas in vivo, de larvas de R. arenarum, se determinó una CL5096 h con valores de 2,96 mg/L para Twin Pack Gold® y de 2,85 mg/L para Rainbow®. Sólo el formulado Rainbow® fue capaz de incrementar a las 48 h de exposición la frecuencia de MN en eritrocitos circulantes con la concentración de 0,71 mg/L. Por el contrario, ambos formulados fueron capaces de inducir efecto genotóxico con todas las concentraciones empleadas tanto a las 48 como a las 96 h de exposición evaluadas mediante el EC. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se propuso que la respuesta diferencial encontrada en cada modelo de estudio frente a los compuestos podría deberse a la presencia de xenobióticos de naturaleza desconocida presentes en el excipiente de las formulaciones comerciales, así como a variaciones en la sensibilidad diferencial de los modelos en estudio. Los resultados de los estudios de mortalidad, genotoxicidad y citotoxicidad de FLC, Twin Pack Gold® y Rainbow® obtenidos en el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, representan una evidencia concreta de que el herbicida FLC debe ser tenido en cuenta como un agente inductor de daño genotóxico y citotóxico, y debería ser clasificado, según los valores de toxicidad aguda CL5096 h obtenidos mediante la exposición de larvas de R. arenarum a Twin Pack Gold® y Rainbow®, como compuesto tóxico (categoría II), siguiendo la clasificación propuesta por Instituciones reguladoras tales como OECD y UN. Asimismo, se sugiere la necesidad de una correcta evaluación toxicológica de FLC y de las formulaciones comerciales existentes del herbicida antes que continúen siendo aplicadas masivamente en nuestro país y en el mundo, representando un factor de riesgo para los organismos expuestos, incluyendo al ser humano.

Esta tesis aborda el estudio geoarqueológico de sitios arqueológicos en cuevas y de geoformas asociadas con la finalidad de aportar nuevos enfoques a la problemática del poblamiento de la región y las decisiones culturales de los cazadores recolectores que habitaron el área de estudio. Consideramos a la geoarqueología como un marco que nos permite abordar tres temáticas principales: cronología, procesos de formación de sitio y reconstrucción paleoambiental. El objetivo principal de esta Tesis consiste en analizar los ambientes de depositación y los procesos de formación que influyeron a los sitios en cuevas del Macizo del Deseado y al entorno de los mismos, con el fin de discutir los cambios y discontinuidades en el registro arqueológico, en las dinámicas sociales del pasado y en los ambientes de la región a través el tiempo. El ámbito geográfico seleccionado corresponde al Macizo del Deseado que es una provincia geológica que abarca una superficie de 60.000 km2, ubicada en el área de la Patagonia extra-andina de la Provincia de Santa Cruz. Dentro de esta macro área de estudio, se reconocen numerosas cuencas endorreicas de diferentes tamaños. Para la realización de este trabajo, el área de estudio seleccionada corresponde a la cuenca del Zanjón Blanco que corre a lo largo de 100 km en sentido E-O, y que comparte su cuenca baja con el Zanjón Rojo. Los sitios que se analizan son Cueva Maripe ubicada en la cuenca alta, la cueva Tito del Valle en el sector de cuenca media y Alero El Puesto 1 (AEP-1) en el sector de la cuenca baja. Por otro lado, se tomaron como base los fechados radiocarbónicos publicados para la región con el fin de establecer el marco cronológico de análisis. Esto permitió ordenar los datos y las discusiones en cuatro bloques temporales: Pleistoceno final, Holoceno temprano, Holoceno medio y Holoceno tardío. La mayor parte de los conjuntos arqueológicos en estratigrafía y las secuencias ocupacionales más amplias de la región provienen de sitios en cue vas y abrigos rocosos. A partir de este estado del arte es que aportamos información sobre la conformación sedimentológica de estos sitios, evaluando su capacidad de contener registros de cambios ambientales y el rol de los humanos que los habitaron como agente geomorfológico. Asimismo, hemos realizado estudios sedimentológicos y de otros proxies ambientales (polen y fitolitos) de geoformas asociadas a las cuevas seleccionadas, como son mallines, cauces secos y paleolagos. Los resultados obtenidos dieron cuenta de la variabilidad estratigráfica de los sitios en cuevas de la región, así como también de los procesos postdepositacionales que los han afectado. También pudimos por un lado conocer la conformación sedimentaria de las geoformas mencionadas que han sido poco estudiadas como fuente de información paleoambiental en el Macizo del Deseado. Mediante el análisis sedimentológico y estratigráfico hemos reconocido que algunos cambios ambientales y climáticos de escala regional y suprarregional tienen su correlato en los depósitos sedimentarios de las cuevas analizadas, y han influido en las tasas de acumulación sedimentaria calculadas para diferentes momentos desde el Pleistoceno. Además, a partir del análisis de dataciones radiocarbónicas recuperadas en nuestra área de estudio y en escalas mayores hemos definido la presencia de un hiato de casi 1400 años calendáricos en cuanto a las dataciones cronológicas de sitios arqueológicos durante el Holoceno medio, lo que marca una discontinuidad en el uso del área. En este sentido nuestros registros polínicos muestran un momento de disminución en la húmedad en los mallines dentro del periodo abarcado por el hiato cronológico. Asimismo, hay casos de estudio que aportan información en la dirección de un sesgo metodológico que contribuiría a la conformación de esa falta de dataciones en nuestra área de estudio. La combinación de nuestros datos con los provenientes de los conjuntos arqueológicos de la región nos ha permitido relacionar aspectos de índole paleoambiental con subsistencia y dinámica de los cazadores-recolectores. Este nuevo estado del conocimientos, abre muchas líneas de investigación nuevas, como son la importancia de los mallines como fuente de agua y recursos vegetales, su importancia como reservorio de información paleoambiental, la discontinuidad de uso del espacio estudiado durante el Holoceno medio, y las estrategias utilizadas por los cazadores recolectores de la región ante situaciones climático/ambientales cambiantes.