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El presente trabajo de tesis tuvo por objetivo principal, la identificación y caracterización de glicoconjugados, en especial sialoglicolípidos del trypanosomatideo Trypanosoma cruzi. Este protozoario es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Se presentan: 1) Una introducción referida a la clasificación general de los protozoarios, y en particular a los de la familia Trypanasomatidae. Se reseñan las características morfológicas del T. cruzi y su ciclo de vida, así como la forma en que se cultiva axénicamente el parásito. 2) Un resumen sobre la estructura, ocurrencia, función y biosíntesis de los glicoesfingolípidos y gangliósidos de animales vertebrados y una referencia sobre los que se han encontrado últimamente en invertebrados. 3) Los estudios realizados sobre los glicoconjugados componentes de membrana de formas epimastigote de T. cruzi. 4) Los antecedentes que evidenciaban la presencia de ácido siálico en T. cruzi. 5) La interpretación y discusión de los resultados que incluye A) La diferenciación de las distintas fracciones subcelulares de epimastigotes de T. cruzi (cepa Tulahuén) en base a: i) el análisis por electroforesis en geles de poliacrilamida de los glicoconjugados presentes en las mismas. ii) Las características químicas, que incluyen la determinación de proteína y azúcar, la composicion de monosacáridos y la determinación de la ausencia de glucógeno en las mismas, el cual se ha descripto como material de reserva para otros protozoarios. B) La marcación exógena de la membrana plasmática de dos líneas de la cepa Tulahuén (Tul Ø y Tul 2). Se determinó la diferente composición de glicoconjugados de membrana para las dos líneas, la cual difiere también de la cepa Y. En Tul Ø la marca se incorpora principalmente en la glicoproteína de 45 kDa (Gp45) mientras que en Tul 2, se incorpora también en una glicoproteína de 25 kDa. C) Estudios estructurales comparativos realizados sobre Gp45 de Tul Ø y el complejo glicoproteico ABC, de cepa Y. Para ello se aislaron las glicoproteínas de extractos fenol-agua y se determinaron los monosacáridos componentes . Se realizó una hidrólisis alcalina en condiciones de β- eliminación, de las glicoproteínas previamente marcadas con galactosa oxidasa NaBͽH4, y se determinó que en Gp45 y en el complejo ABC, existen oligosacáridos de 4 a 7 unidades de azúcar unidos a través de unión O-glicosídica a la proteína, y que poseen galactosa como uno de sus componentes. Además se determinó la presencia de cadenas unidas a la proteína por otro tipo de unión, aunque no se confirmó la naturaleza de la misma. D) Se realizó un extracto lipídico de las células epimastigote de T. cruzi, el cual se reextrajo con KCl. En este último extracto se determinó la presencia de por lo menos dos componentes que revelaban con reactivo de gangliósidos. Se dosaron 1ع²/² moléculas de ácido siálico / célula, que se liberan del extracto por acción de neuraminidasa. Se determinó también la presencia de azúcar, esfingosina y ácidos grasos en la misma. E) El análisis por EGPA, de epimastigotes marcados con la técnica de NaIO4- NaBͽH4, mostró la incorporación de la radioactividad en dos glicoconjugados, el LPPG (Banda D) y en una banda de alta movilidad (Banda E). Esta última se extrajo con solvente para lípidos, y con KCl. Por fraccionamiento con columna de sílica gel H, de un extracto C:M (2:1) marcado, se obtuvieron dos fracciones A y B. En la fracción A se liberó un 35% de la radioactividad por la acción de la neuraminidasa, mientras que en la B, la marca se incorporaba como arabinosa, lo que sugiere la presencia de galactofuranosa en la misma. F) Se llevó a cabo una incorporación metabólica de (ͽH) ácido palmítico y (ͽH)-galactosa a las células. Se aislaron dos glicolípidos que incorporan ambos precursores (G1Tc y G2Tc). El ácido palmítico se incorporó en una esfinganina en G1Tc y en una esfingenina en G2Tc. Ambos glicolípidos cambiaban su movilidad en c.c.d. por la acción de la neuraminidasa, por lo que se trata de sialoglicoesfingolípidos. Se demostró la naturaleza endógena de los mismos así como también la de los glicoconjugados A, B, C y D. 6) Se aislaron los glicoesfingolípidos G1Tc y G2Tc de un extracto C:M (2:l) de 1ع² células. Para ello se utilizó en primer lugar una resina DEAE-Sephadex en la que se separaron los lípidos neutros de los acídicos. Estos últimos se fraccionaron por columna de Unisil, recogiendo las fracciones que eluían con C:M (8:2) y C:M (1:1). Esta última se recromatografió en una columna de características similares, obteniéndose los dos gangliósidos. H) En la fracción C:M (8:2), se analizaron los ácidos grasos, los azúcares, y las esfingosinas presentes. No se detectó ácido siálico. Del análisis de las distintas c.c.d realizadas sobre extractos provenientes de las marcaciones con ácido palmítico, galactosa, IO4- NaBͽH4 y de las reveladas con reactivos para fósforo y glicolípidos se dedujo que en la misma están presentes por lo menos un glicolípido que se marca con IO4-NaBͽH4 por poseer galactofuranosa, un fosfoglicolípido y fosfolípidos. I) Se analizó la composición de los gangliósidos. Para G1Tc se determina que la relación azúcares neutros: aminoazúcares: ácido siálico: esfingosina es: 4:1:1:1, mientras que para G2Tc la relacion es Azúcares neutros: ácido siálico: esfingosina 5:1:1. Se realizaron hidrólisis ácidas específicas sobre la cadena del oligosacárido de G1Tc. Se determinó que está compuesta por Glucosa:manosa:arabinosa:galactosamina:ácido siálico en relación 2:1:1:1:1. Esta composición es distinta a la de todos los gangliósidos conocidos. Por otra parte éste es el primer informe sobre la presencia de galactosamina en T. cruzi. Los componentes de la ceramida de G1Tc se aislaron por metanólisis y extracción de los ácidos grasos y las esfingosinas, las que se analizaron por c.g.l-e.m. Se determinó que la base de cadena larga presente en G1Tc es una metil esfinganina ramificada de 19 átomos de carbono, la cual se halla esterificada por ácidos grasos en cuya composición se encuentran principalmente ácido 2-metil esteárico (44%), Ac. esteárico (31%), ac. 2-metil palmítico (6,3%), Ac. palmítico (7,3%) y ac. oleico (4,6%). Los ácidos 2-metil ramificados no habían sido informados como componentes de extractos lipídicos de T. cruzi. Por marcación con galactosa oxidasa NaBͽH4, se determinó que la radioactividad se incorpora en galactosamina en G1Tc y en galactosa en G2Tc, lo que descarta también la unión de ambos monosacáridos por el C-6 al oligosacárido respectivo. Asimismo se marcaron los dos gangliósidos con IO4- NaBͽH4. La radioactividad liberada por hidrólisis acida y enzimática, fue la misma en ambos casos, por lo que se concluye que el ácido siálico se encuentra terminal. La movilidad de los gangliósidos marcados es similar a la del gangliósido GM1, lo cual confirma que son monosialilgangliósidos. También se ratificó el cambio en el Rf de los mismos, cuando son tratados con neuraminidasa. Se llevó a cabo una oxidación con periodato de G1Tc. Por c.g.l. se determinó la presencia de sorbitol: glicerol y treitol en relación 2,1:Ø,25, lo que indica que la glucosa no fué oxidada. La presencia de treitol podría deberse a residuos de galactosamina no N-acetilada unida en posición 4. Por metilacidn de G1Tc se determinó que la manosa se halla 2-O-sustituida, confirmando la relación en que se encuentran el glicerol con el sorbitol (1:2), en el análisis de los productos de la oxidación con periodato. Se analizó la composición de la ceramida de G2Tc, utilizando las mismas técnicas que para G1Tc. Se determinó la presencia de esfingosina unida a ácidos grasos en cuya composición se encuentran principalmente ácido 2-metil palmítico (27,1%), ac. 2-metil esteárico (22,6%), Ac. 2-metil araquídico (9,6%), Ac. esteárico (13,3%) y ac. palmítico (9,7%). Los monosacáridos componentes de G2Tc son arabinosa, manosa, galactosa y glucosa. El tratamiento con β-galactosidasa de G2Tc desialidado liberó galactosa, indicando que el ácido siálico terminal se encuentra unido a galactosa, como es común en gangliósidos animales. J) Del extracto lipídico total se aisló un plasmalógeno, por pasaje a través de columna de Unisil y posterior separación de los lípidos más polares por c.c.d. preparativa. El plasmalógeno (PLTc) se hidrolizó con ac. acético y se separó el aldehído del lisofosfolípido por columna de Unisil. Por c.g.l.-e.m. del aldehído reducido al alcohol se determinó la presencia de hexadecanal. El lisofosfolípido se saponificó y se analizaron los ácidos grasos. Por hidrólisis fuerte del plasmalógeno y análisis por c.p. se determinó la presencia de etanolamina. A su vez se dosó el contenido de fosfato en PLTc, que corresponde a un mol de fosfato por mol de plasmalógeno. La movilidad en c.c.d. es similar a la informada para plasmalógenos derivados de fosfatidiletanolamina, por lo que se concluyó que la estructura de PLTc es la representada en la fig 47.

El objetiVo de la presente Tesis fue la purificación, identificación y caracterización de glicoinositolfosfolípidos de formas epimastigote de Trypanosoma cruzi, cepa Y. Uno de ellos, el lipopéptidofosfoglicano (LPPG) es una glicoinositolfosfoceramida, cuya estructura parcial ya habia sido determinada por los grupos de Lederkremer, Ferguson y Previato (27,28,185,236,237,239,240,241). Este glicoconjugado es uno de los principales componentes de la membrana plasmática de formas epimastigote de T. cruzi. En ésta Tesis se logró purificar a homogeneidad este glicoconjugado y se elucidó la estructura del glicano constituyente del mismo, lo cual estableció su analogía con los glicoinositolfosfolipidos (GIPLs) que actúan de ancla de proteinas a membranasde células eucariote. Por extracción de células del segundo día de cultivo, en iguales condiciones en las que se extrajo el LPPG,se detectaron dos glicoinositolfosfolipidos en cantidades equiparables. El LPPG A, que es un glicoinositolfosfolipido que posee alquilglicerol y el LPPG B que es una glicoinositolfosfoceramida. Se presentan en esta Tesis: 1. Una reseña acerca de las principales caracteristicas de los glicoinositolfosfolipidos (GIPLs). El mecanismo de anclaje de macromoléculas a la membrana plasmática a través de GIPL se ha descripto a lo largo de la última década. Son muchas las proteinas en las que se detectó este tipo de unión covalente, pero sólo se sabe hasta el momento la estructura completa de tres anclas glicolipidicas. 2. Un resumen de las caracteristicas morfológicas y biológicas de nuestro sistema. experimental: el .Trypanosoma cruzi, agente causante de la enfermedad de Chagas. 3. Una actualización de los estudios realizados sobre los diferentes glicoconjugados de membranadel T. cruzi. 4. Un detalle de los resultados previos obtenidos sobre el LPPG por nuestro grupo de trabajo y los grupos de Ferguson y Previato. 5. Los resultados obtenidos a lo largo de esta Tesis. Los mismos se dividen en dos partes: A- La determinación de la estructura completa del glicano del LPPG. B- El estudio de los glicoinositolfosfolipidos en células del segundo dia de cultivo de formas epimastigote de T. cruzi, cepa Y. Estos Capitulos incluyen: A a) La purificación del LPPG. b) La liberación de la fracción lipidica por acción de la enzima PI-PLC y por métodos quimicos. c) El análisis del glicano del LPPG por métodos enzimáticos y por análisis de metilación. d) El estudio espectroscópico de distintos productos de hidrólisis obtenidos a partir del LPPG. e) La determinación de la presencia de CRD sobre el LPPG tratado con PI-PLC. B f) La purificación y separación de dos glicoinositolfosfolipidos de células de T. cruzi del segundo dia de cultivo (LPPG A y B). h) La determinación de la estructura lipidica de los LPPGA y B. i) El análisis estructural del glicano constituyente de los mismos: composición de azúcares, análisis de metilación y determinación de la configuración de la galactosa. j) Determinación de aminoácidos y ácidos aminofosfónicos presentes en ambos compuestos. A a) Purificación del LPPG. Se modificó el esquema de purificación utilizado por Lederkremer y col.(236), introduciendo un paso de extracción con agua saturada en n-butanol (297) y un último paso de purificación por cromatografía de hidrofobicidad en columna de Octyl-Sepharose, obteniendose el LPPG homogeneo. b) Liberación de la fraccion lipidica del LPPG. Acción de la enzima PI-PLC. La enzima fosfatidilinositolfosfolipasa C cliva especificamente la unión inositol-fosfato-lipido en glicoinositolfosfolipidos, obteniéndose el glicoinositolfosfato 1,2 cíclico. Esta reacción se ha utilizado como herramienta para identificar anclas glicolipidicas (17). La acción de ésta enzima sobre el LPPG liberó la ceramida del glicano indicando que el LPPG posee una estructura análoga a las anclas estudiadas hasta el momento. La unión fosfato entre el inositol y el lipido resultó labil a la hidrólisis con HF 50% y con NaOH 1 M o KOH 0,25 M en metanol. c) Análisis del glicano del LPPG. La reacción de desaminación con HNO2 es una reacción caracteristica de las anclas glicolipidicas ya que las mismas poseen glucosamina sin acilar, unida al inositol (28). La obtención de oligosacáridos con 2,5-anhidromanitol en su extremo reductor luego del tratamiento del LPPG con HNO; y reducción con NaBH4 nos indicó la presencia de glucosamina sin acilar en el mismo. Estos oligosacáridos poseen 1 ó 2 galactosas terminales en configuración furanósica, unidas fi(1-3) a dos Man-α(1-2). Las mismas fueron determinadas en el estudio de metilación. El tratamiento de los oligosacáridos con α-manosidasas de distinta especificidad, luego de hidrolizar las galactosas, indicó que los mismos poseen una cadena de α-Man formada por 3 ó 4 unidades. Por el estudio de metilación de determinaron, además de las dos manosas unidas (1-2), una tercera unida (1-6) y la manosa unida a la glucosamina en posición 4. Se determinó también que la GlcNH2 se une a la posición 6 del inositol. d) Estudio espectroscópico del LPPG. Por 31P-RMN se determinó la presencia de la unión fosfonato correspondiente al ácido 2-aminoetilfosfónico. Por el análisis de metilación habiamos determinado que el mismo se une al HO-6 de la glucosamina. La formación del fosfato 1,2-ciclico sobre el inositol luego de la acción de la enzima PI-PLC fue puesta de manifiesto en estos espectros. En el análisis del 1H-RMN se determinó que la Gal se une β(1—3) a las Man-α(l-2), que la glucosamina está en configuración α, corroborándose también los datos obtenidos en el estudio de degradación con α-manosidasas y de metilación. El análisis por FAB-MS de los glicanos del LPPG mostró la microheterogeneidad existente por la diferente sustitución por las galactosas y por el número de manosas. Se observó también la ramificación en la posición H0-3 de la penúltima manosa por Galf. e) Análisis del determinante de reactividad cruzada. Al tratar las anclas glicolipidicas con PI-PLCse expone un epitope llamado CRD o determinante de reactividad cruzada (98). El mismo se localiza sobre el glicano de las anclas y son los epitopes reconocidos en todas las glicoproteinas con ancla glicolipidica. Esta reacción se utiliza como criterio de reconocimiento de proteinas ancladas a membranapor GPI. El CRD se detectó sobre el LPPG por ensayo de ELISA luego del tratamiento con PI-PLC, indicando que éstas moléculas poseen una estructura análoga a las anclas de glicoproteinas a membranas. B f) Purificación de otros glicoinositolfosfolipidos . Utilizando el mismo esquema de purificación del LPPG se obtuvieron, en células epimastigote del segundo dia de cultivo, dos glicoinositolfosfolipidos en cantidades equiparables. Los mismos se separaron en columna de Octyl-Sepharose. Por SDS-PAGE ambos compuestos mostraron un peso molecular semejante entre 7000-12000 Da. g) Estructura lípidica de los LPPGA y B. Los lípidos de ambos compuestos se liberaron con PI-PLC de Bacillus thuringiensis. y Bacillurens, indicando una estructura análoga a los GIPL. Por análisis por c.c.d. y por cgl-em se determinó que el LPPGA posee 1-0-hexadecilglicerol parcialmente acilado con ácido palmitico y el LPPG B posee una ceramida formada principalmente por C18-esfinganina y ácidos palmitico y lignocérico, es decir es semejante al aislado de células de cuatro dias de cultivo. h) Análisis del glicano de los LPPG A y B. Se determinó que en ambos compuestos los azúcares principales eran manosa y galactosa en una relación aproximada de 2,7/1. La glucosamina presente se encuentra unida al inositol y posee AEP unido a uno de sus OH. La galactosa presente se encuentra terminal y en su mayor parte furanósica, pero a diferencia del LPPG del cuarto dia de cultivo también se determinó una cierta proporción de galactosa piranósica. Según el ensayo de metilación, las manosas se encuentran principalmente involucradas en uniones (1-2) y (1-6) y las galactosas sustituyen los H0-3 de las manosas unidas (1-2) ya que se determinó la presencia de 4,6-di-O-metil-manosa. A diferencia del LPPGn de células del cuarto dia de cultivo los LPPG A y B poseen manosa terminal, por lo que no todas las cadenas se encontrarian sustituidas por galactosas. j) Análisis de aminoácidos y ácidos aminofosfónicos. Se determinó en ambos compuestos la presencia de ácido 2-aminoetilfosfónico luego de la hidrólisis con HCl 6 M, 24 h a 100°c. El LPPGA posee un porcentaje mayor de aminoácidos ácidos, como el glutámico y el aspártico, que aminoácidos hidroxilados. En el LPPGB esta relación se invierte al igual que en el LPPG de células del cuarto dia de cultivo. En el LPPGA el 100% de los aminoácidos son saponificables, mientras que en el LPPGB sólo el 66% de los mismos se liberan en condiciones de saponificación. Todos estos resultados nos permitieron determinar que las formas epimastigote de T. cruzi poseen estructuras análogas a los anclas de glicoproteinas a membranas y que las mismas varian en su estructura dependiendo del tiempo de crecimiento de los cultivos. Esta variabilidad se deberia a que los mismos podrian unirse a glicoproteinas en forma selectiva o remodelar sus lípidos a medida que avanza el tiempo de crecimiento y se llega al estado estacionario, detectándose sólo la glicoinositolfosfoceramida en los cultivos de mayor tiempo.

Fil:Maggese, María Cristina Irene. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Un estudio de “glicómica” sobre un sistema biológico en particular, intenta determinar los hidratos de carbono que una célula u organismo en particular es capaz de sintetizar bajo condiciones fisiológicas específicas. Este tipo de estudio por lo tanto, refleja el perfil de expresión de genes que codifican glicosiltransferasas, glicosidasas y otros componentes dentro de un camino biosintético. La glicómica es un nuevo campo de investigación que permitirá determinar nuevos blancos para diseñar drogas que tendrán un impacto sobre problemas relevantes. La inherente complejidad de los hidratos de carbono exige la utilización de un gran número de técnicas para ese fin. En los últimos años, la espectrometría de masa de alta resolución UV-MALDI-TOF ha sido una de las herramientas más útiles. El presente trabajo presenta un estudio glicómico en la vía biosintética de glicoesfingolípidos de Plasmodium falciparum y Trypanosoma cruzi. Además de la caracterización estructural de los productos de dicha vía, se ha aislado y caracterizado la UDP-glucosa:ceramida glucosiltransferasa, enzima clave de este camino biosintético de ambos hemoparásitos y posible blanco quimioterapéutico. Por otra parte el presente trabajo ha contribuido con el desarrollo de dos metodologías de análisis por espectrometría de masa que trascienden el campo de la química de parásitos: 1- La utilización de esfingolípidos unidos covalentemente a un grupo fluorescente donde el mismo actúa como fotosensibilizador permitiendo el análisis directo por EM. 2- Siendo conocido que los hidratos de carbono pueden ser responsables de la antigenicidad de un glicoconjugado, se llevó a cabo la síntesis de diferentes conjugados carbohidrato-proteína y su caracterización por EM como herramienta para su utilización en ensayos biológicos.

Fil:Padula, Paula Julieta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Mentaberry, Alejandro Néstor. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Como contribución al estudio del rol de los N-glicanos en la fertilización de mamíferos, estudiamos su presencia en la superficie del espermatozoide humano normal y en plasma seminal bovino. Usando lectinas específicas fluorescentes como sondas moleculares localizamos los dominios de glicoproteínas conteniendo oligosacáridos oligomanosídicos, híbridos y complejos en el espermatozoide humano. Con neoglicoproteínas demostramos que los receptores especificos para manosa, fucosa y galactosa, localizan respectivamente en las zonas de dichas glicoproteínas. Esto concuerda con la complementariedad molecular de la interacción espermatozoide-zona (por receptores de doble unión). Por cromatografía lectina-agarosa, demostramos la presencia de glicoproteínas conteniendo oligosacáridos oligomanosídicos, híbridos y complejos en plasma seminal bovino. Aislamos en microescala las proteínas BSP, demostramos que éstas y aSFP, participan (quizás junto con lípidos) en la modulación de la actividad "in vitro" de las proteasas espermáticas. Dicha actividad es incrementada cuando los oligosacáridos fucosilados conteniendo el antígeno Lex está presente. Además cada BSP sola es menos activa que el conjunto de ellas sugiriendo que potenciarían su actividad por efecto sinérgico. Dado que las BSP unen a lípidos, sugerimos que la modulación de la capacitación y reacción acrosomal por parte de las BSP (BSP-HDL)estaría relacionada con la actividad inhibitoriade proteasas acrosomales.

La N-glicosilación de proteínas comienza en la mayoría de las células eucariotes por la transferencia en bloque al resto amida de una asparagina, de un oligosacárido de composición Glc3Mar9GlcNAc2, preformado sobre dolicol-P-P. La enzima responsable se denomina oligosacariltransferasa y fue estudiada en numerosos sistemas. Se constató que existe una secuencia aminoacídica consenso para la glicosilación (Asn-Xaa-Ser/Thr), y una señal en el oligosacarido: la presencia de los tres residuos glucosa, para efectuar la transferencia. Una vez transferido a proteínas, el oligosacárido sufre una serie de modificaciones (por sustracción y adición de unidades sacarídicas y no sacarídicas) que en conjunto se denominan procesamiento. Los oligosacáridos adquieren distintas composiciones finales, según las cuales se denomina, a los que están en celulas de mamífero, tipo polimanosa, tipo complejo o tipo híbrido. Trypanosomatidae es una familia de protozoarios parásitos, algunos de los cuales producen enfermedades en el hombre y en el ganado. El agente causal de mal de Chagas, el Trypanosoma cruzi, pertenece a esta familia. El estudio de la N-glicosilación "in vivo" de proteínas en tripanosomátidos demostró que estos son los únicos eucariotes tipo salvaje, capaces de sintetizar sobre dolico-P-P y transferir a proteínas oligosacáridos no glucosilados. Además, en algunos estadíos, T. cruzi es capaz de transferir simultáneamente dos oligosacáridos diferentes. Se ha estudiado el procesamiento en organismos de la familia Trypanosomatidae y se han encontrado características comunes a otros eucariotes (reacciones de demanosilación y glucosilación transitoria). Se observó además adición de residuos galactosa en configuración furanósica, en extremos no reductores de oligosacáridos tipo polimanosa. Se estudió la especificidad de la oligosacariltransferasa de tripanosomátidos "in vitro", frente a sustratos oligosacarídicos de diferente composición, y se la comparó con la de mamíferos y hongos. Por otro lado se estudió 1a estructura de varios oligosacáridos conteniendo residuos galactofuranosa existentes en glicoproteínas de Leptomonas samueli. Resultados: - Se diseñó un sistema de ensayo "in vitro" que permite estudiar la especificidad de la oligosacariltransferasa frente al sustrato oligosacarídico. Este ensayo contiene como sustrato dador una serie de oligosacáridos radioactivos (de diferente tamaño: Glc3-1Man9GlcNAc2 y Man9-7GlcNAc2) unidos a dolicol-P-P y un péptido sintético aceptor con la secuencia consenso de glicosilación. — La oligosacariltransferasa de hígado de rata y de Saccharomyces cerevisiae demostraron en este sistema tener la misma especificidad por el sustrato oligosacarídico ya conocida anteriormente, es decir transfieren preferentemente Glc3Man9GlcNAc2. - La actividad de transferasa de T. cruzi (parásito digenético que "in vivo" transfiere Man9GlcNAc2), fue inespecífica respecto del sustrato, transfiriendo todos los oligosacáridos presentes en el mismo a la misma velocidad. - Los tripanosomátidos monogenéticos Leptomonas samueli, Crithidia fasciculata y Blastocrithidia culicis, "in vivo" sintetizan y transfieren a proteinas oligosacaridos no glucosilados y con nueve, siete y seis unidades de manosa respectivamente. Membranas de éstos parásitos con actividad de oligosacariltransferasa fueron capaces de transferir con este sistema tanto unidades no glucosiladas como las glucosiladas, (con las cuales fisiológicamente nunca se encuentran), con la misma eficiencia. Por lo tanto se concluye que la oligosacariltransferasa de tripanosomátidos difiere de la de todos los demás eucariotes en que no presenta especificidad frente al sustrato oligosacarídico (y por lo tanto no requiere la presencia de residuos de glucosa en el oligosacárido para catalizar una transferencia eficaz). - Células de teratocarcinoma de ratón, transfieren "in vivo" a proteínas los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 y Man7GlcNAc2. "In vitro", membranas de estas células fueron capaces de transferir preferentemente Glc3Man9GlcNAc2, igual que la enzima normal de mamíferos, constatando que la inespecificidad frente al sustrato oligosacarídico es una característica exclusiva de la familia Trypanosomatidae. Esto sugiere la posible modulación "in vivo" de la especificidad de la oligosacariltransferasa de células de teratocarcinoma por factores desconocidos. - La síntesis y transferencia a proteínas de unidades no glucosiladas en L. samueli, se debe a, por lo menos, la incapacidad de estas cédulas de sintetizar dolicol-P-Glc, el dador de glucosa en el ciclo del dolicol de otros eucariotes. - El procesamiento de oligosacáridos en proteínas de L. samueli involucra la demanosilación parcial de la unidad transferida (Man9GlcNAc2) y el agregado de residuos galactofuranosa. - Se describen las estructuras de varios ofigosacáridos tipo polimanosa que contienen o no residuos galactofuranosa, presentes en glicoproteínas de L. samueli. - A diferencia de lo observado en C. fasciculata, el oligosacárido originalmente transferido sufre una elongación por agregado de restos galactofuranosa. - Durante el curso del presente trabajo se ha desarrollado un método de conservación de éstos parásitos a -70°C, que se ha utflizado con éxito con todas las cepas monogenéticas del laboratorio.

Los glicales, éteres vinílicos polihidroxilados, se han empleado frecuente- mente en la síntesis de azúcares modificados y de una gran variedad de otros productos naturales, debido a la versatilidad que les confiere la función enol-éter y por tratarse además de moléculas con varios centros quirales. En el presente trabajo de Tesis se han estudiado reacciones de glicosidación con nucleófilos oxigenados (alcoholes) o nitrogenados (bases pirimidínicas) de derivados acilados de un tipo particular de glicales sustituidos en C-2: 2-aciloxiglicales acilados. La presencia del sustituyente aciloxi en C-2 modifica la reactividad respecto de los análogos no sustituidos. Los derivados acilados de 2-aciloxiglicales se prepararon modificando el procedimiento descripto en la literatura. Por tratamiento de los bromuros de glicosilo peracilados con 1,8-diazobiciclo |5.4.0|undec-7-eno (DBU) en 1,2-dicloroetano se obtuvieron los derivados de 2-aciloxiglicales de configuración D-arabino | 3,4,6- trin-O-acetil-2-acetoxi-D-glucal (2b) y 3,4,6-tri-O-benzoil—2-benzoiloxi-D-glucal (11)|, D-lixo | 3,4,6-tri-O-aceti1-2-acetoxi-D-galactal (49) y 3,4,6-tri-O-benzoil-2- benzoiloxi-D-galactal (97)| y 6-desoxi-L-lixo |2,4-di-0-acetil-2-acetoxi-L-fucal (96)| con excelentes rendimientos. Los glicales 96 y 97 no habían sido descriptos en la literatura. Se estudió primeramente la reacción de los 2-aciloxiglicales acetilados con alcoholes en presencia de N-iodosuccinimida (NIS). Así, a partir de 2b y un alcohol primario, en acetonitrilo y en presencia de NIS, se observaba por cromatografía en capa delgada, la formación rápida de un producto de mayor movilidad. Se optimizaron las condiciones de reacción (solvente, concentración de NIS, concentración de alcohol configuración del glical, etc.). Se observó que los alcoholes secundarios y terciarios también reaccionaban, aunque estos últimos más lentamente. Al extender la reacción a escala preparativa, usando cantidades equimolares de NIS y del glical 2b, y un ligero exceso de 2-propanol se obtuvo un único producto con 91% de rendimiento que se identificó como 2-propil 2,4,6-tri-O-acetil-3-desoxi- -α-D-eritro-hex-2-enopiranósido (98) en base a sus datos espectroscópicos. La configuración del centro anomérico fue confirmada preparando dos derivados cristalinos de hex-2-enopiranósidos descriptos en la literatura (el ter-butil glicósido 42 y el colesteril glicósido 99) y comparando sus propiedades físicas. Se encontró que la reacción es altamente estereoselectiva y no se detectaron trazas de anómero β. En este aspecto, esta ruta sintética aventaja al método clásico de Ferrier, que conduce a una mezcla anomérica de glicósidos y con menores rendimientos. Al disminuir las cantidades de NIS respecto al glical 2b, la reacción era má lenta pero el compuesto gg se obtenía siempre con buenos rendimientos, lo cual indicaría que la NIS actúa en forma catalítica en la glicosidación. Cuando se trabajó con exceso de 2-propanol, el compuesto 98 fue el producto principal independientemente de la concentración de NIS usada y se formaba también un producto secundario en cantidades apreciables que se identificó posteriormente como 2-propil 6-O-acetil-3,4-didesoxi-α-D-glicero-hex—3-enopiranosid-2-ulosa (101). También se estudió la reaccióncon derivados acetilados de glicales con configuración D-lixo (49) y L-lixo (96), observándose que con éstos las alquil hex-3- enopiranosid-2-ulosas (101, 102, 104) se obtenían con mejores rendimientos que cuando se partía del glical de configuración D-arabino (2b). El derivado benzoilado del 2-aciloxi-D-glucal (33) reaccionaba más lentamente con alcoholes en presencia de NIS, y afin luego de 20 h la reacción no se completaba. El 2-propil 2,4,6-tri-0-benzoil-3-desoxi-α-D-eritro-hex—2-enopiranósido (106) se obtuvo con 49% de rendimiento luego de su purificación cromatográfica. Los alquil hex-2-enopiranósidos se formaban por un reordenamiento alílico del 2-aciloxi-glical catalizado por ácidos, mediante un mecanismoque involucra la formación de un carbonio intermedio producido por eliminación del sustituyente del C-3. El hecho que la NIS no reacciona con los 2-hidroxiglicales en ausencia de un alcohol, sugeriría que el reordenamiento alílico es promovidopor el ácido iodhídrico producido por oxidación del alcohol por la NIS. La estereoselectividad de la reacción estaría regulada por factores estereoelectrónicos (anoméricoy alílico) los cuales favorecerían el ataque axial del nucleófilo al C-l del catión alílico formado. También sería factible la participación anquimérica del sustituyente de C-2 en la estabilización de la carga positiva de C-l. Aunque la formación del cación aciloxonio podría ocurrir por la cara α o β de la molécula, en virtud del efecto anomérico reverso el de configuración β sería preferencial, induciendo el ataque del alcohol por la cara opuesta, es decir la α. La formación de las alquil 3-hexen-2-ulosas involucraría el reordenamiento alílico de los 2-enopiranósidos (98 y 103) intermediarios, por ataque del alcohol al éster enólico. Este reordenamiento generaría el carbonilo de C-2 e induciría la eliminación del grupo aciloxi en C-4. Cuando en lugar de NIS se empleó como catalizador de la reacción tetracloruro de estaño(IV) (SnCl4) se favorecían las condiciones para la obtención de alquil 3-enopiranosid-2-ulosas. Así por ejemplo, la reacción de derivados acilados de 2-aciloxi- glicales con alcoholes, en presencia de SnCl4 y usando cloruro de metileno como solvente, condujo a alquil 3-enopiranosid-2-ulósidos (101, 102, 114, 116, 117, 118 y 119) como productos principales, junto con cantidades variables de un subproducto, identificado como 5-aciloximetil-2-furaldehído (113 ó 115). Se observó que la composición de la mezcla de reacción dependía de la concentración de SnCl4, de la configuración del glical de partida y fundamentalmente de la temperatura. Así por ejemplo, a partir de 2-aciloxiglicales con configuración D-arabino (2b y 33) se minimizaba la concentración de los subproductos ll3 y 115 cuando se trabajaba en un intervalo de temperatura entre -5°-0°C. Cuando se disminuía afin más la temperatura o se usaban cantidades de SnCl4 menores que las estequiométricas, no ocurría la reacción. En el caso de 2-aciloxiglicales de configuración lixo (42 y 97) la formación de los derivados acilados de 5-aciloximetil-2-furaldehído se encontraba muy afectada por la temperatura y a -20°C no se detectaba su formación. El di-O-acetil-2- acetoxi-L-fucal (96) con configuración L-lizo presentó un comportamiento similar obteniéndose a —20°Cla enona 116 con rendimientos casi cuantitativos. El procedimiento desarrollado para la preparación de glicósidos de 3-hexen-2- -ulosas a partir de 2-aciloxiglicales acilados y alcoholes en presencia de SnCl4 presenta importantes ventajas respecto a otros métodos, como por ejemplo: a) Permite preparar 3-hexen-2-ulosas en un solo paso y con muy buenos rendimientos. b) El método es esteroselectivo, formándose el anómero α. La única excepción se encontró en la reacción del tri-O-benzoil-2-benzoiloxi-D-galactal (97) con metanol, la cual condujo a una mezcla anomérica de enulosas. c) Los derivados benzoilados de 2-aciloxiglicales (33 y 97) se reordenan facilmente con SnCl4 a las correspondientes enonas, mientras que en presencia de NIS no era posible esta transformación. Los glicósidos de hex-2-enopiranosilo o de hex-3-enopiranosid-2-ulosas son intermediarios útiles en síntesis debido a los variados grupos funcionales presentes en la moléula. En este trabajo hemos obtenido a partir de dichos compuestos y mediante reacciones sencillas, derivados de desoxiazúcares, azúcares halogenados y 2-ulosas. Así por ejemplo, la hidrogenación del doble enlace de los alquil 2-enósidos 98 y 105 condujo estereoselectivamente a los glicósidos de la 3-desoxiglucosa 120 y 121. Por otra parte, por reducción catalítica del doble enlace C=C de la enulosa 101 se obtuvo el 2-ulósido 124. Se estudió también la reducción del grupo carbonilo de las enulosas 101 y 118 con NaBH4 en solución metanólica, obteniéndose los alcoholes alílicos correspondientes. En el caso particular de la glicosilulosa del colestanilo (118) el alcohol obtenido por reducción se caracterizó por preparación del derivado acetilado 125. Por posterior hidrogenación de estos intermediarios insaturados se obtuvieron los alquil 3,4-didesoxi-hexopiranósidos (127) y sus derivados acetilados (126 y 128). El análisis de los espectros de RMN-1H de estos compuestos mostraban valores de constantes de acoplamiento que definían claramente una configuración D-eritro, lo cual indicaba que la reducción del carbonilo con NaBH4 había ocurrido estereoselectivamente. Por último, por tratamiento de 101 con Br2/Cl3CH se obtuvo la 3-bromo-enulosa 133. Aparentemente, la halogenación de 101 ocurriría mediante una reacción de adición de Br2, seguida por eliminación de bromuro de hidrógeno, para reestablecer la conjugación. Los resultados de la reacción de glicosidación de 2-aciloxiglicales con alcoholes catalizada por SnCl4 nos llevaron a considerar la posibilidad de reemplazar los alcoholes por derivados nitrogenados como agentes nucleofílicos con la finalidad de obtener N-glicósidos de enulosas. Empleando como compuesto nitrogenado una base purínica o pirimidínica, esta reacción permitiría sintetizar cetonucleósidosa, α,β-insaturados en un solo paso. Los cetonucleósidos son moléculas de interés en bioquímica y en medicina, y particularmente los α,β-insaturados han mostrado actividad antitumoral. El uso de cetonucleósidos insaturados como agentes antitumorales ha potenciado el desarrollo de métodos sintéticos, que en general involucran numerosos pasos. Por tratamiento del tri-O-acetil-2-acetoxi-D-galactal (49) con el 2,4-bis (trimetilsililoxi)uracilo (135), en presencia de SnCl4 , se obtuvieron dos compuestos principales de distinta movilidad cromatográfica. El :e menormovilidad (¿21) se aisló puro por cromatografía en columna con 63% de rendimiento y se identificó como 3-(6'-0-acetil-3'4'-didesoxi-α-D-glicero-hex-3'-enopiranosid-2'-ulosa)uracilo. El producto de mayor movilidad (136) se caracterizó como el derivado N-acetilado de 137. El compuesto 136 se convertía en 137 por calentamiento en solución metanólica. La glicosidación había ocurrido a través del N-3 por lo cual los compuestos 136 y 137 son en realidad cetoisonucleósidos, de los cuales no se encontró ejemplos en la literatura. El compuesto 137 se preparó también a partir de 2-aciloxi-D-glucal acetilado (2b), en las mismas condiciones descriptas para el acetato de 2-acetoxi-D-galactal (49), obteniéndose el cetosionucleósido insaturado 137 con un rendimiento menor (44%). La reacción de N-glicosidación se extendió a otros glicales y a otras bases Pirimidínicas. Así por ejemplo, el di-O-acetil-2-acetoxi-L-fucal (96) reaccionó con el derivado trimetilsililado del uracilo (135) para dar el 3-(3',4',6'-tridesoxia-α- L-glicero-hex-3'-enopiranosid-2'-ulosa)uracilo (138) con 40% de rendimiento. Se efectuó también la N-glicosidación del derivado trimetilsililado de la timina (139) con tri-O-acetil-2-acetoxi-D-galactal (49), en presencia de SnCl4, reacción que condujo a 3-(6'-O—aceti1—3',4'-didesoxi-α-D-glícero -hex-3'-enopiranosid-2'-ulosa) timina (140) con 40% de rendimiento. Por reducción del sistema carbonílico α,β-insaturado de los cetoisonucleósidos se confirmó la estructura de los mismos mediante un método químico. Por tratamiento del compuesto 137 con exceso de NaBH4 en solución metanólica se obtuvo el 3-(3',4'-didesoxi-α-Q?ritro-hexopiranósil)uracilo (144), y por posterior acetilación con Ac2O/Py el derivado diacetilado 145. La configuración D-eritro de la porción didesoxihexosa se asignó por análisis de los espectros de RMN-1H y -13C de 145. Por otra parte, para demostrar las configuraciones de C-l y C-2 de 144 por un método químico, se realizó la acetólisis de 144 con la finalidad de obtener el derivado peracetilado de una 3,4-didesoxihexosa. Por tratamiento de 144 con una mezcla anhídrido acético-ácido sulfúrico-ácido acético (72 h, 4°C) se obtuvo la mezcla anomérica de la l,2,6-tri-O-acetil-3,4-didesoxi-D-eritro-hexopiranosa (147). Los anómeros 147α y 147β se separaron por CLAR. El mismo tratamiento aplicado al 2-propil 3,4-didesoxi-α-D-eritro-hexopiranósido (127), condujo a una mezcla de productos, de la cual luego de separaciones por columna cromatográfica y CLAR, se aislaron entre otros, los anómeros α y β de la triacetil didesoxihexosa(147α y 147β). Estas secuencias de reacciones permiten concluir que tanto el didesoxisonucleósido 144, como el O-glicósido análogo 127, tienen la misma configuración en C-2. Además, con este dato se pudo reconfirmar, indirectamente, la configuración anomérica de 144 y 137. En ambos casos, la reducción del sistema carbonílico α,β-insaturado de 137 y 101; resultó estereoselectiva, con ataque del ión hidruro por la cara β de la molécula, opuesta al sustituyente anomérico. Con el propósito de estudiar la influencia de la sustitución por un grupo aciloxi en el C-2 de los glicales sobre la reacción de condensación con bases pirimidínicas en presencia de SnCl4, se extendió el estudio de la reacción a glicales acilados comunes, en particular el 3,4-di-0-acetil-L-ramnal (26). Así, por tratamiento del glical 26 con el derivado trimetilsililado de la timina 139 en presencia de SnCl4, se aislaron, luego de la cromatografía en columna, los anómeros α y β de la 1-(4'-0-acetil-2',3',6'-tridesoxi-L-erítro-hex-2'-enopiranosil)timina, 155 y 154 respectivamente. Las estructuras se determinaron en base a sus datos espectroscópicos y constantes físicas que coincidían con las descriptas en la literatura. La misma reacción, con el derivado trimetilsililado del uracilo (135) condujo a resultados similares, aislándose los anómeros α y β de l-(4'-0-acetil-2',3',6‘- tridesoxi-L-eritro-hex-2'-enopiranosil)uracilo (157 y 156 respectivamente). Las reacciones de N-glicosidación del derivado acetilado del L-ramnal (26) en presencia se SnCl4, condujeron pues a mezclas anoméricas de N-l nucleósidos de hexen-2'-enósidos. La diferencia observada en cuanto a estereo y regioselectividad en las reacciones de los 2-aciloxiglica1es acilados respecto a los glicales normales, ponen de manifiesto la influcencia del sustituyente del C-2 del glical, el cual afectaría el curso estereoquímico de 1a reacción de N-glicosidación. Los compuestos 96, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 114, 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 133, 136, 137, 138, 140, 144, 145, 147α, 147β, 156 y 157, no se encontraban descriptos en la literatura.

Las α- y ,β-D-galactosidasas (α- y ,β-Gal)y α-L-arabinofuranosidasas (α-Af) son enzimas capaces de liberar restos galactosilos y arabinofuranosilos de polímeros pécticos y hemicelulósicos como así también de diferentes glicoconjugados. Algunas de estas glicosidasas han sido vinculadas al ablandamiento de los frutos. En esta Tesis, se desarrollaron métodos de separación de la β-Gal II y de 3 isoformas de la α-Af. Se demostró que la ,β-Gal II es la única ,β-Gal involucrada en la maduración. Asimismo, mediante el uso de frutos de tomate antisentido para la enzima 1-aminociclopropano-l-carboxílico sintasa (ACC-S[—])se determinó que la actividad de β-Gal lI responde a muy bajas concentraciones de etileno. Los frutos ACC-S[—] presentan una disolución incipiente de los polímeros pécticos de la lámina media, la cual puede ser atribuirse, entre otras causas, a hidrolasas de pared celular capaces de responder a muy bajas concentraciones de etileno. Las isoformas α-Af I y II mostraron actividad durante toda la ontogenia del fruto. α-Af I es la primera enzima de pared dependiente de zinc extraída del pericarpo de fruto de tomate, y sugiere la participación del catión en el metabolismo de la pared celular de los frutos. La actividad de α-Af II es superior al 80% de la actividad arabinofuranosidásica total en frutos de 10 días, pero disminuye durante la maduración. La isoforma α-Af III, en cambio, es específicamente activa durante la maduración y sensible al etileno, aún a muy bajas concentraciones. Se obtuvieron diferentes respuestas de las α-Af al ácido giberélico, auxinas sintéticas y etileno, mediante un nuevo sistema de discos de pericarpo de tomate ACCS[—]. Las isofonnas I y II mostraron incrementos significativos de actividad por la aplicación de ácido giberélico o ácido 2,4-diclorofenoxiacético, mientras que la aplicación de etileno exógeno sólo incrementó la actividad de la isoforma III. Estos y otros resultados sugieren que las enzimas α-Afs están codificadas por una familia multigénica sujeta a distintos comroles hormonales, cuyos miembros desempeñan diferentes funciones in vivo. Esto último se sustenta en la capacidad de extractos de las isoformas de α-Af para liberar arabinosa de diferentes fracciones de la pared celular. Se discuten además los resultados de la influencia de atmósferas controladas y estrés por altas temperaturas in vivo sobre la actividad de α- y β-Gal y α-Af. El sistema in vitro que utiliza pericarpo ACC-S[—] permitirá por vez primera la realización de estudios completos referidos a los efectos fisiológicos de diferentes reguladores sobre la expresión génica y la actividad de diversas enzimas, sin interferencia del etileno generado por heridas al tejido.