Catálogo de publicaciones

Barrios, Marcelo

A partir del trabajo de campo etnográfico, la principal contribución que propone esta investigación es dar cuenta de las formas de producción, circulación y efectos del conocimiento científico asociado a prácticas interdisciplinarias en el caso de un laboratorio de ciencias cognitivas dedicado al estudio del desarrollo infantil en contextos de pobreza. Sobre esta base se deriva un problema central de investigación que es guía de la tesis doctoral: cómo se produce ciencia desde un enfoque interdisciplinario cuando dicha producción científica se genera en el marco de instituciones y lógicas académicas que responden al modelo de disciplina tradicional y cuando el objeto sobre el cual se investiga es híbrido, al combinar saberes del mundo social y natural. Y en particular, cuáles son los efectos de esta propuesta que no solo se proyecta desafiando las fronteras disciplinares (psicología, neurociencia, educación) y las dicotomías clásicas sobre las cuales las mismas se erigieron (naturaleza-cultura, individuo-sociedad), sino que desafía asimismo las propias fronteras del laboratorio definiendo como ámbito de experimentación un universo social como la escuela. Se busca profundizar en las dinámicas y tensiones que esa proyección produce en marcos institucionales y académicos que se encuadran en estructuras disciplinares, que nos advierten que el conocimiento interdisciplinario es una apuesta que presenta distintas complejidades, más allá que sea ponderada favorablemente en los programas que incentivan la producción científica. En este sentido resalta la necesidad de incorporar al análisis la dimensión institucional y política en la discusión sobre la producción de conocimiento interdisciplinario.

Los polímeros inteligentes han mostrado grandes avances en diferentes áreas de interés como la agronomía, la medicina y la farmacia, debido a su capacidad de modificar sus características estructurales o conformacionales a partir de un estímulo específico adecuado. En ese sentido, los polímeros pH responsivos son de gran utilidad y han sido utilizados en base a la posibilidad de emplearlos en medios o entornos donde el estímulo viene dado por una modificación del pH. Entre las posibles áreas de aplicación, la farmacéutica y el medioambiente surgen como dos ramas de marcado interés y de potenciales aplicaciones para polímeros pH responsivos. Dentro de los polímeros que pueden ser sensibles al cambio de pH, se encuentran los acrílicos con grupos funcionales en sus cadenas, como por ejemplo los derivados de los acrílicos metacrilato de 2-(dietilamino)etilo (DEA) y metacrilato de 2-(diisopropilamino)etilo (DPA), que han sido los seleccionados en el presente trabajo. Estos polímeros, sin embargo, al ser utilizados en forma de películas en sistemas acuosos, no presentan una buena estabilidad física por lo cual su vida útil es limitada. La posibilidad de combinarlos con un polímero como el poliuretano (PU), mecánicamente estable con buenas propiedades de película, permite superar el mencionado inconveniente de forma de obtener un sistema más completo. En ese sentido, se propone la síntesis de un sistema híbrido poliuretano/acrílico (PU/A), unidos mediante enlaces químicos, con el objetivo de obtener un polímero formador de películas, que sea estable en medios acuosos, y que a su vez posea propiedades pH responsivas. En este caso, a partir de los componentes seleccionados, se espera obtener un sistema híbrido polimérico que responda al pH en medios ácidos y que pueda ser potencialmente aplicable en dos áreas específicas: en la farmacéutica, como sistema de transporte y liberación de fármacos; en el saneamiento ambiental, como medio para remover metales pesados de efluentes acuosos. En primer lugar, dado que ciertas patologías generan un entorno ácido dentro del organismo y que en el cuerpo humano, dependiendo de la región o tejido, el pH varía, se espera que los sistemas sintetizados sean aptos para incorporar un principio activo (PA) determinado y puedan liberarlo al modificar el pH del medio. De este modo, resultaría una interesante aplicación el hecho de que la síntesis de un polímero pH responsivo sea capaz de transportar un PA de interés y que ante variaciones de pH pueda liberarlo en una zona específica del cuerpo humano, evitando de esa forma la sobredosis y la aparición de posibles efectos secundarios. En segundo lugar, una problemática que afecta la calidad del agua es la presencia en exceso de metales pesados. En la búsqueda de tratamientos eficaces que resuelvan ese inconveniente, los sistemas híbridos sintetizados pueden resultar de utilidad. A partir de la presencia de los grupos amino en la cadena polimérica, aportados por los monómeros DEA y DPA, que pueden interaccionar con los mencionados metales, se propone utilizar los híbridos PU/DEA y PU/DPA como sistemas captadores de metales pesados en medios acuosos. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron que es posible sintetizar polímeros híbridos pH-responsivos, empleando poliuretano como polímero base y los acrílicos metacrilato de 2-(dietilamino)etilo o metacrilato de 2-(diisopropilamino)etilo como monómeros responsivos, para ser utilizados en forma de películas inteligentes, que pueden ser aplicados tanto en la liberación controlada de principios activos como también en la captación de metales pesados contaminantes. Teniendo en cuenta que los sistemas sintetizados presentan una propiedad pH-responsiva en condiciones de pH y temperatura fisilógicos, se dispone entonces de un sistema que potencialmente puede transportar y liberar el principio activo de acuerdo a las necesidades farmacológicas específicas. Por otro lado, la posibilidad que poseen los híbridos responsivos sintetizados de coordinarse con cobre y zinc y extraer dichos metales de soluciones acuosas ácidas, permite considerar la utilización de estos sistemas como polímeros que pueden colaborar con la descontaminación de diferentes efluentes acuosos.

El objeto de este estudio fué determinar las condiciones de acidez, concentración y temperatura más apropiadas para realizar la hidratación. del óxido de mesitilo a diacetonalcohol. (CH3)2CCHCOCH3 + H2O --(H2SO4)--> (CH3)2CHOHCH2COCH3 Problema analítico: Se estudió un método de dosaje para el óxido de mesitilo, la interferencia del diacetonalcohol en el mismo y el modo de identificar el diacetonalcohol tomado en el curso de las experiencias de hidratación. Para la determinación del óxido de mesitilo se adoptó el método basado en la absorción, por la unión etilénica, del bromo liberado por un sistema bromuro-bromato en medio ácido. El bromo en exceso oxida ioduro a iodo y éste es titulado con solución de tiosulfato. Se estudió el método observando la influencia del tiempo durante el cual se dejaba reaccionar el bromo con el ácido de mesitilo, del exceso de la solución bromato-bromuro y de la acidez. Fijadas estas variables se realizaron numerosas determinaciones encontrándose aplicable el método con un coeficiente de variación igual a 1,04%. El diacetonalcohol, por su grupo acetilo, puede fijar halógeno. Por lo tanto, se estudiaron las condiciones para reducir a un mínimo esta absorción, modificando la acidez y dando tiempo para alcanzar el equilibrio. Se encontró que el halógeno absorbido equivalía a un 0,2% del diacetonalcohol presente. El método adoptado para el dosaje del óxido de mesitilo en presencia de diacetonalcohol resultó el siguiente: se toma una muestra que contenga aproximadamente 100 mg de óxido de mesitilo, se agrega solución bromato-bromuro 0,1 N de tal modo que haya un exceso de la misma del 10% respecto a lo que se espera consumir. Debe desarrollarse color amarillo neto. Se introduce rápidamente el ácido sulfúrico 6 N necesario para que, al llevar a volumen final con agua destilada, resulte una normalidad de 0,4. Se deja reaccionar durante 20 minutos y se agregan 5 ml. de solución de ioduro de potasio al 20%, empleándose engrudo de almidón cerca del punto final. Con mezclas de óxido de mesitilo y diacetonalcohol dosadas con este método se obtuvieron los resultados provistos. Se encontró un modo de precipitar fraccionadamente las 2,4-dinitrofenilhidrazonas de ambas cetonas. El óxido de mesitilo reacciona con la 2,4-dinitrofenilhidrazina en frío mientras que el diacetonalcohol sólo lo hace en caliente o muy lentamente a la temperatura ambiente. Experiencias de hidratación: En distintas experiencias se fué observando la desaparición del óxido de mesitilo en función del tiempo por dosajes sucesivos y la formación de diacetonalcohol por su 2,4-dinitrofenilhidrazona. Así se estudió la influencia de la acidez, la temperatura y la concentración del óxido de mesitilo sobre la velocidad y la expansión de la hidratación. A partir de soluciones casi saturadas a temperatura ambiente (3% en volumen), se obtuvieron los mejores resultados con solución sulfúrica 7 N a 50°C. En estas condiciones se produce un 90% de hidratación en 1 hora, aproximadamente. Experiencias realizadas a partir de sistemas bifásicos (óxido de mesitilo sin disolver) mostraron que una mayor concentración de óxido de mesitilo disminuía notablemente la velocidad y la extensión de la hidratación.

Fil:Rodriguez, María Cecilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El presente trabajo tuvo por objeto el estudio de los polioles, azúcares simples y la estructura de un polisacárido de Cyttaria johowii. En relación con la misma se llevó a cabo la síntesis de la 3-O-β-D-glucopiranosil-D-fructosa producto de hidrólisis ácida parcial del polisacárido. Se presentan: 1) Una descripción de los hongos del género Cyttaria, su ubicación geográfica, clasificación sistemática y caracteres morfológicos. Se detallan los trabajos químicos realizados sobre Cyttaria harioti Fischer que era la única especie estudiada hasta el momento. 2) Un resúmen de los estudios sobre polioles y azúcares simples en hongos, su rol fisiológico y enzimología. 3) Las características estructurales de los β-glucanos encontrados en hongos. 4) Una descripción de los estudios realizados sobre polisacáridos con acción antitumor; las características estructurales y su relación con la actividad. 5) Los estudios realizados sobre glucosilfructosas, sus orígenes características y métodos de obtención. 6) Una descripción de la síntesis de disacáridos por el método de Koenigs-Knorr: características de la reacción, mecanismo y estereoquímica. 7) La interpretación y discusión de los resultados obtenidos que incluye: a) la caracterización y cuantificación de glicerol (3), D-arabinitol(6), D-manitol(10), eritritol (4), D-glucosa, sacarosa y trehalosa (2) como componentes del extracto acuoso. b) los métodos estructurales empleados en la elucidación de la estructura del polisacárido aislado de Cyttaria johowii c) su actividad antitumor en ratones. d) la síntesis de la 3-O-β-D-glucopiranosil-D-fructosa. El polisacárido se aisló de un extracto acuoso de estromas de Cyttaria johowii por precipitación con etanol hasta una concentración del 28%. Se purificó por redisolución en agua y reprecipitación con etanol hasta que su poder rotatorio permaneció constante [α]²º,D-34°(DMSO). El polisacárido así obtenido daba un solo pico por filtración en geles y dado que precipitaba en un ranqo estrecho de concentración etanólica se consideró homogéneo para su estudio. Se encontraron como componentes del polisacárido D-glucosa y D-fructosa en una relación 9:1. La presencia de fructoglucanos es rara en hongos. El grado de polimerización dió un valor de 235, considerando que la unidad terminal está unida a través de su O-3, lo cual está de acuerdo con el peso molecular de aproximadamente 40000 determinado por filtración en geles y comparación con patrones. Los estudios de metilación e hidrólisis del polisacárido metilado permitieron la identificación de 2,3,4,6-tetra-O-metil glucosa (unidades terminales); 2,4,6-tri-O-metil-D-glucosa (unión (1→3)); 2,3,4-tri-O-metil-D-glucosa (unión 1→6) y 2,3,6-tri—O—metil-D-glucosa (unión 1→4) y 2,4-di-O-metil-D-glucosa (ramificaciones en O-3 y O-6) en una relación tetra:tri:di de 30:34:31 lo que indica una estructura muy ramificada. Se determinó que la unión (1→3) es la que predomina en el polisacárido por la mayor proporción de 2,4,6-tri-O-metil glucosa con respecto a los otros derivados trimetilados. Los estudios de oxidación con periodato y determinación del consumo de oxidante y producción de ácido fórmico sugirieron la presencia de ramificaciones alternadas y los productos de hidrólisis del polialcohol indican predominio de uniones (l→3) con ramificaciones en O-6. La ausencia de glucosilglicerol en la degradación por el método de Smith indica que no hay uniones (1→3) y (1→6) alternadas. La fructosa no se ataca en la oxidación por lo tanto no es una unidad terminal y su unión debería ser a través de O-3 u O-4. La determinación de 3-O-β-D-glucopiranosil-D-fructosa como producto de hidrólisis ácida parcial y su confirmación por síntesis indicó que la fructosa estaría también con unión (1→3). La 3-O-β-D-glucopiranosil-D-fructosa (laminaribiulosa) no había sido descripta en la literatura por lo cual se sintetizó por el método de Koenigs-Knorr a partir de 1,2:4,5 di-O-isopropiliden-β-D-fructopiranosa (32) y 1-Br 2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-D-glucopiranosa (33). Se analizaron los espectros de RMN-13C del disacárido sustituído formado en la condensación, su producto de condensación y de la 3-O-β-D—glucopiranosil-D-fructosa (31). El poder rotatorio negativo y la presencia de laminaribiosa (26) y genciobiosa (27) como productos de hidrólisis parcial indican la configuración β del polisacárido. Se postula una posible unidad repetitiva para el polisacárido (A) consistente con los resultados experimentales. Se describen los resultados de los ensayos realizados sobre la acción del polisacárido en la inhibición del crecimiento de Sarcoma 180 en ratones.

El presente trabajo tuvo por objeto continuar con el estudio de la composición en Hidratos de Carbono de Cyttaria hariati Fischer. Se encuentra dividido en varias partes: 1) Una descripción de los hongos del género Cyttaria, así como un detalle de los trabajos químicos realizados sobre la única especie hasta el momento estudiada: Cyttaria harioti Fischer. 2) Se mencionan los distintos tipos de glucanos aislados de hongos y levaduras, clasificando los mismos de acuerdo al tipo y configuracidn de sus uniones glucosídicas. 3) Se resumen los principales métodos enzimáticos usados para el análisis de polisacaridos, haciendo especial mención de las enzimas amilolíticas. 4) Se menciona brevemente la química y bioquímica de la trehalosa así como sus fuentes de extracción. 5) Se describe la identificación y determinación cuantitativa de alfa,alfa-D-trehalosa y ácido D-arabino hexulosónico en un extracto acuoso del hongo. Se caracterizó la trehalosa por sus propiedades físicas (punto de fusión y poder rotatorio), por las propiedades físicas de su octaacetato y por el Tr en c.g.l. Por hidrólisis cuantitativa con trehalasa se calculó que su porcentaje en el hongo está entre 0.22 y 0.30%. El cetoácido se caracterizó a través de los productos resultantes de su reducción y posterior lactonización. Se determinó que su porcentaje en Cyttaria harioti Fischer es del 1%. Cabe aclarar que es esta la primera vez que se aisla ácido D-arabino hexulosónico libre de un producto natural. 6) Se detallan los métodos empleados en la elucidación de la estructura de un polisacárido aislados de Cyttaria harioti Fischer junto con una discusión de los resultados obtenidos. Dicho polisacárido se aisló por precipitación con etanol de un extracto acuoso de Cyttaria harioti Fischer, luego de eliminar el heteropolisacárido estudiado anteriormente. El producto obtenido entre 41 y 46% de etanol se purificó hasta constancia de poder rotatorio [α] + 171 ( H2O). Se observaba un solo pico simétrico por ultracentrifugación y precipitaba de su solución acuosa en un estrecho rango de concentración etanólica, evidencias ambas de su homogeneidad. El grado de polimerización era 246 considerando que la unidad terminal está unida a través del 0 al C-4. Por hidrólisis ácida total se obtuvo solamente glucosa y con amiloglucosidasa la hidrólisis fue cuantitativa. La hidrólisis ácida parcial daba principalmente isomaltosa junto con maltosa, maltotriosa y oligosacáridos mayores. La acetólisis proporcionaba mayor proporción de maltosa y maltotriosa. Esto confirmaba la presencia de uniones alfa-D-( 1→4) y alfa-D-( 1→6) en el glucano. El polisacárido se hidrolizaba sólo un 8% con alfa amilasa, mientras que con pululanasa se obtenía un poder rotatorio correspondiente a 32- 33%. La cromatografía en papel del hidrolizado con pululanasa mostraba un único componente de Rg= maltotriosa. Esta fue posteriormente caracterizada por sus propiedades físicas (punto de fusión, poder rotatorio, espectro de resonancia magnética nuclear) y las de su acetato. Cuando la hidrólisis con pululanasa se detuvo en un paso intermedio, se aislaron oligosacáridos consistentes en residuos de maltotriosas unidas a través del 0-6. Por estos resultados se postuló que el glucano era estructuralmente similar al "pululano" aislado de varias cepas de Pullularia pullulans y de Tremella mesenterica y que contenía una cadena principal consistente en residuos de maltotriosas unidas por el 0 del C-6 (unión alfa). Los estudios de oxidación con IO4- permitieron confirmar estas suposiciones, si bien se encontró 3 - 7% de glucosa sin oxidar lo cual sugiere la posibilidad de que existan uniones 1→3 o ramificaciones. La metilación del glucano dio un producto con 43.8% de OCH3. La hidrólisis del producto metilado permitió identificar 2,3,4,6-tetra-O-Metil-glucosa; 2,3,4 y 2,3,6-tri-O-Metil-glucosa (Cromatografía en papel, c.g.l. y espectros de masas); 2,3-di-O-Metil-glucosa. La determinación cuantitativa de los productos metilados demostró que hay dos puntos de ramificación cada 100 unidades de glucosa y que el exceso de glucosa dimetiladas respecto de la tetrametilglucosa (7%) se puede deber a una submetilación. No se encontró 2,4,6-tri-O-Metil-glucosa que permitiría confirmar la presencia de uniones 1→3. También en el pululano aislado de Pullularia pullulans se encontraron uniones 1→3, así como 2,3-dimetil glucosa entre los productos de metilación e hidrólisis. Es esta la primera vez que se encuentra un pululano intracelular. En la Tabla siguiente se resumen las propiedades de los "pululanos" aislados de Pullularia pullulans, Tremella mesenterica y Cyttaria harioti Fischer.

El presente trabajo tuvo por objeto el estudio de la estructura de un polisacárido aislado de estromas de Cyttaria harioti Fischer. En él se presentan: 1) Una descripción de los hongos del género Cyttaria: su ubicación geográfica, clasificación sistemática y caracteres morfológicos. Se detallan los trabajos químicos realizados sobre Cyttaria harioti Fischer, que es la única especie que ha sido estudiada. 2) Un resumen de los principales métodos empleados en la determinación de estructuras de polisacáridos y del tipo de información que ellos aportan. En particular, se discuten: a) aislamiento y purificación; b) determinación de pesos moleculares; c) identificación de los azúcares componentes; d) estudios de hidrólisis; e) estudios de acetólisis; f) oxidación con periodato; g) estudios de metilación. 3) Las características estructurales de los polisacárídos aislados de hongos, en particular de los glucanos; su aplicación en taxonomía química y su actividad biológica. 4) La relación del ácido D-arabino-hexulosónico con los ácidos ascórbicos; los métodos de síntesis del primero, propiedades y distribución. 5) Una descripción detallada de los métodos estructurales empleados en la elucidación de la estructura del polisacárido aislado de Cyttaria harioti Fischer y la interpretación y discusión de los resultados obtenidos, que permiten postular una unidad repetitiva. El polisacárido se aisló de un extracto acuoso de estromas de Cyttaria harioti F., por precipitación con etanol hasta una concentración del 50%. Se purificó por redisolución en agua y reprecipitación con etanol hasta que su poder rotatorio permaneció constante, [α]|D +95,8° (KOH 1 N). El polisacárido así obtenido daba un solo pico por ultracentrifugación y, dado que precipitaba en un rango estrecho de concentración etanólica, se consideró homogéneo para su estudio. Se encontraron como componentes del polisacárido D-glucosa, ácido D-arabinohexulosónico y D-fructosa en la relación molar 98:6:1. La presencia del cetoácido es rara en productos naturales. Esta es la primera vez que se aisló como componente de un polisacárido de hongo. El grado de polimerización, dio un valor de 230, considerando que la unidad terminal está unida a través de su O-3. Los estudios de oxidación con periodato, reducción e hidrólisis indican una relación molar de glucosa, glicerol, eritritol (12:6:1), lo que sugiere la presencia de uniones (1→3)-, (1→6)- y (1→4)-. La ausencia de glucosil-glicerol en la degradación del polialcohol por el método de Smith, indica que no hay uniones (1→3)- y (1→6)- alternadas. El ácido D-arabino-hexulosónico no se ataca en la oxidación y, por lo tanto, no es una unidad terminal y su unión debería ser a través de su O-3 ú O-4. Por metilación, hidrólisis del polisacárido metilado y separación de los éteres metílicos monoméricos, se identificaron: 2,3,4,6-tetra-O-metil-D-glucosa (unidades terminales); 2,4,6-tri-O-metil-D-glucosa (unión(1→3)-); 2,3,4-tri-O-metil-D-glucosa (unión (1→6)-) y 2,4-di-O-metil-D-glucosa (ramificaciones en O-3 y O-6). Se detectó cromatográficamente 2,3,6-tri-O-metil-D-glucosa (unión (1→4)-) y se aisló un derivado metilado del ácido D-arabino-hexulosónico. Las determinaciones cuantitativas indican una estructura ramificada, ya que la proporción molar de tetra-O-metil-, tri-O-metil, di-O-metil-glucosa es 1:4:1. La unión (1→3)- es la que predomina en el polisacárido pues la proporción molar de 2,4,6-tri-O-metil- (unión (1→3)-); 2,3,4-tri-O-metil- (unión (1→6)-); 2,3,6-tri-O-metil-glucosa (unión (1→4)-) es de 36:12:1. Los resultados obtenidos por metilación concuerdan con los de oxidación con periodato. Por hidrólisis ácida parcial se aislaron y caracterizaron laminaribiosa (3-O-β-D-Glp-D-Glp), celobiosa (4-O-β-D-Glp-D-Glp), isomaltosa (6-O-α-D-Glp-D-Glp) y un trisacárido que sería 3-O-β-isomaltosil-glucosa (O-α-D-Glp-(1→6)-O-β-D-Glp-(1→3)-D-Glp), probando que la configuración de las uniones es α-(1→6)-, β-(1→3)- y β-(1→4)-. Por acetólisis del polisacárido y posterior desacetilación de la mezcla de acetatos se aislaron y caracterizaron laminaribiosa, laminaritriosa y se detectaron, por cromatografía en papel, oligosacáridos mayores de glucosa con unión β-(1→3)-, que cumplían la relación de French, hasta un grado de polimerización de 8. Se aisló un disacárido de ácido D-araboascórbico y glucosa, que se originaria por isomerización en el medio alcalino de desacetilación de un disacárido del ácido D-arabino-hexulosónico, que confirma que la unión glicosídica al ácido es (1→4)- y cuyo poder rotatorio, [α]D +92,3° indica que dicha unión tendría la configuración α. Los estudios estructurales realizados sobre el polísacárido degradado ([α]D +13,5° (KOH)), obtenido por hidrólisis con ácido sulfúrico 0,05 N, indican una cadena de glucosa unida β-(1→3)-, con algunas ramificaciones en O-6, cuya unidad terminal reductora sería una molécula de D-fructosa. Algunas de las ramificaciones comenzarían con una unidad de ácido D-arabino-hexulosónico. Se postula una posible unidad repetitiva para el polisacárido (XX) consistente con los resultados experimentales obtenidos.

El presente trabajo de Tesis tuvo por objeto la determinación de la estructura del lipopeptidofosfoglicano (LPPG) de células epimastigote de Trypanosoma cruzi (cepa Y), agente causante de la enfermedad de Chagas. El LPPB es un componente mayoritario de la membrana de la forma epimastigote, y su rol en el ciclo de vida del parásito no es aún conocido. Se Presentan: 1) Una introducción referida a la enfermedad de Chagas. Se reseñan las características del parásito, la respuesta inmunológica del organismo frente a la infección aguda y crónica, y los modelos experimentales. 2) Un resumen de los distintos estudios químicos realizados sobre la superficie celular del parásito. 3) Los estudios realizados sobre estructura y distribución de glicofosfoceramidas. 4) Un resumen acerca de la importancia de la unión carbono-fósforo como estructura de moléculas complejas, la biosíntesis de ácidos aminofosfónicos, y su identificación por métodos espectroscópicos. 5) Un resumen de los resultados previos sobre el LPPG. 6) La interpretación y discusión de los resultados obtenidos, que incluye: a) Purificacidn y antecedentes del LPPG. Lederkremer y col. [146] aislaron por extracción de células epimastigote de Trypanosoma cruzi con fenol 44%, un complejo de glicoconjugados que se precipitaba con etanol de la fase acuosa. Este complejo estaba compuesto por cuatro bandas (A, B, C y D o LPPG), que se coloreaban con PAS, y se purificaban a través de una columna de Bio Gel P-150. En esas condiciones el LPPG quedaba impurificado con el componente C y se extraía selectivamente con cloroformo:metanol:agua (10:10:3). En este trabajo de Tesis, se obvió la purificación a través de columna, y se extrajo el complejo de glicoconjugados primero con cloroformo:metanol (2:1) para eliminar lipidos contaminantes, luego directamente con cloroformo:metanol:agua (10:10:3). El LPPG se solubiliza en esta mezcla y se precipita por agregado de metanol. Para comprobar la pureza de este producto se lo cromatografió a través de Bio Gel P-150 usando buffer fosfato de sodio 0,1 M (pH=7,2) en presencia de SDS 0,1%, y se obtuvo un único pico. Se había descripto la presencia de un 60% de azúcares en el LPPG, compuestos por manosa, galactosa y glucosa (35:22:1), 1% de glucosamina, 2,1% de fosfato, 12,6% de ácidos grasos ligados como amida y como ester, y 9,5% de péptido. Con estos datos se comenzó el estudio de la estructura del LPPG. b) Estudio de la composición de bases de cadena larga. El hecho de que el ácido lignocérico, que se encuentra ligado como amida en el LPPG, sea un componente común de unidades ceramida; y que un extracto clorofórmico de un hidrolizado ácido total tuviese compuestos ninhidrina positivos [146] llevó a iniciar el análisis de las bases esfingosínicas en la macromolécula. Las bases se cuantificaron luego de hidrólisis alcalina a 100°C y se determinó que en el LPPG había 14,2 mmol% de bases. Al analizar la composición por CGL y CGL-EM se determinó la presencia de 17-metilesfinganina y esfinganina en relación 3:1. Se observo una variación en la composición de bases al analizar otras muestras del LPPG; se identificaron esfingosina y esfinganina. Esta microheterogeneidad en la molécula se encontró también en el LPG de Acanthamoeba castellanii [170]. c) Estudios comparativos realizados en cepa Tulahuen. Los estudios se realizaron para determinar la influencia del medio de cultivo en la composición de bases. Se utilizó una cepa de colección (Tul 0), y se aislaron los complejos de glicoconjugados con fenol 44%, a partir de células epimastigote cultivadas en medio Lit, Boné y bifásico. En todos los casos se encontró 17-metil-esfinganina, esfinganina y esfingosina en una relación aproximada de 88:9:2. Se compararon además los complejos de glicoconjugados de dos líneas de la cepa Tulahuén, una no virulenta (Tul 0), y otra que mantenía su infectividad (Tul 2). En Tul 2 se encontró 17-metilesfinganina como componente minoritario, y esfinganina como mayoritario, en relación 3:17 aproximadamente. Se concluyó que las bases esfingosínicas variarían en las distintas líneas de una misma cepa, y dicha variación no sería dependiente del medio de cultivo. d) Análisis de la ceramida. La ceramida se liberó por hidrólisis alcalina (NaOH 1 N, 2 h, 100°C) y se analizó por RMN H-1. Se observó el doblete a δ=1.1 con J=7 Hz, característico de un grupo isopropilo, lo cual confirmó la presencia de 17-metilesfinganina. Por la proporción de ceramida aislada, se pudo calcular un peso molecular aproximado de 6500 para el LPPG, considerando un mol de ceramida por mol de LPPG. Si se toma el dato cuantitativo de las bases el peso molecular sería de 7100. La ceramida se pudo separar por tratamiento con fosfolipasa C, por lo tanto se deduce que la porción lipídica se encuentra ligada a través de fosfato a la porción hidrofílica. Se determinó además que el hidroxilo de C-3 de la base esfingosínica en la ceramida se encuentra esterificado por ácido palmítico, mayoritariamente. e) Determinación de la presencia de inositol. Se cuantificó el inositol presente en la molécula por CGL y se encontraron 13,8 mmol%. Además se pudo separar un producto de hidrólisis ácida parcial, que al ser rehidrolizado liberaba inositol y glucosamina. f) Caracterización de las distintas uniones de fósforo en el LPPG, lo cual incluye el espectro de RMN P-31. La presencia de fosfato monoéster no se detectó por tratamiento con fosfatasa alcalina del LPPG original. Sin embargo, condiciones alcalinas suaves determinan la ruptura de ciertas uniones fosfodiéster, con la consiguiente formación de monoéster. El tratamiento con ácido dilupido también dio como resultado la formación de fosfato monoéster, que se liberaba por tratamiento con fosfatasa alcalina. El espectro de RMN P-31 a pH=10,5 mostraba un pico principal a δ=+0.67 correspondiente al fosfato diéster y dos señales a δ=+5.29 y +4.83, que se pueden asignar a pirofosfato, comparando con datos de literatura. Las señales de fosfato monoéster aparecen debido al medio alcalino, y podría tratarse de fosfato de serina. Una faceta interesante del espectro fueron las señales a campos bajos, δ=-25.06 y -21.00, características de la unión C-P, las cuales se asignaron como ácido 2-aminoetilfosfónico y ácido 2-amino-3-fosfonopropiónico. En el espectro a pH neutro se observaba una señal ancha y compleja para fosfodiéster centrada a -0.75 ppm, y la señal para unión C-P a -22.08 ppm. g) Estudio de los aminoácidos y ácidos aminofosfónicos en el LPPG. Cuando se trató el LPPG en medio alcalino suave, se observó la liberación de compuestos ninhidrina positivos. Se liberaba el 50% de los aminoácidos, principalmente glicina, serina, treonina, ácido aspártico, que se encontrarían ligados como éster en el LPPG. Se encontró también fosfato de serina, y un aminoácido con tiempo de retención igual al de hidroxilina. Sin embargo, no todos los aminoácidos del LPPG se liberan en esas condiciones, por lo tanto habría una estructura peptídica en la molécula. Se caracterizaron ácido aminofosfonopropiónico como componente mayoritario, y ácido aminoetilfosfónico como minoritario. Por electroforesis en papel, y análisis automático de aminoácidos, además del RMN P-31. La presencia de aminoácidos ligados como éster fue descripta para ácidos teicoicos donde la D-alaina se encuentra esterificando un poliol o un azúcar [246]. h) Caracterización de galactosa furanósica en el LPPG. La hidrólisis ácida parcial del LPPG dio como resultado la liberación diferencial de galactosa con respecto a la manosa. Por oxidación controlada con periodato de la macromolécula, se determinó que esa hexosa se encuentra mayoritariamente en configuración furanósica, y con los hidroxilos de C-5 y C-6 libres. Se caracterizó el azúcar obtenido por oxidación y reducción con NaBH4 del LPPG, como arabinosa. Utilizando NaB3H4 se desarrolló un método para marcar LPPG en forma exógena. i) Identificación de ribosa como constituyente de la macromolécula. La ribosa se caracterizó como azúcar constituyente del LPPG, cuando se sometió a hidrólisis ácida parcial una cantidad apreciable de LPPG. Se descartó la hipótesis de que la ribosa pudiese provenir de contaminación con ácidos nucleicos, pues en esas condiciones se hubiera liberado ribosa-fosfato. La cuantificación luego de una hidrólisis total dió una relación de ribosa, manosa, galactosa y glucosa de 1:14:7:3. Estas proporciones no eran constantes en el análisis de distintas muestras, aunque la manosa, seguida de galactosa, eran siempre los azúcares mayoritarios. j) Determinación de azúcares ligados por fosfato glicosídico. Cuando una muestra de LPPG se sometió a hidrólisis ácida muy suave, se liberó un disacárido sustituído que revelaba con reactivos de ninhidrina y fosfato. Al ser rehidrolizado en condiciones alcalinas, se separaban dos fracciones por cromatografía en una resina catiónica. El análisis por CLAR y CGL indicó que la fracción neutra estaba compuesta por una manobiosa. La fracción ácida contenia diversos componentes ninhidrina positivos; uno de ellos coincidente con el ácido aminofosfonopropiónico, detectados por electroforesis. Por lo tanto la manobiosa se encuentra ligada a la cadena a traves de fosfato glicosídico y sustituída por el ácido fosfónico. k) Estudios de metilación de la cadena de hidratos de carbono. Los resultados de los estudios de metilación del LPPG indican que la galactosa se encuentra presente fundamentalmente en la configuración furanósica, como extremo terminal no reductor. En efecto, no se detectó el 2,3,5,6-tetra-O-metilgalactitol en los estudios realizados en el LPPG degradado por hidrólisis ácida suave. Tampoco se observa en el mismo el 4,6-di-O-metilmanitol, verificando así la ramificación en el hidroxilo de C-3 de manosas unidas (1→2). El hecho de que en el LPPG degradado no se encuentre el 2,4,6-tri-O-metilmanitol indicaría que las unidades de manopiranosa ligadas (1→3) son parte de una cadena externa. Esta correspondería a la manobiosa ligada por fosfato glicosídico y sustituida con ácido aminofosfónico. Las manosas ligadas (1→2) y (1→6) se encontraron en el LPPG original y degradado. l) Análisis del espectro de RMN C-13 del LPPG. El aspecto general del espectro es similar al de los lipopolisacáridos [270]. Se observaron resonancias características de los carbonos anoméricos de azúcares entre 99 y 106 ppm. La señal a 105,8 se asignó a β-D-galactofuranosa. Los carbonos anoméricos de la manosa aparecen como una señal compleja entre 101,2 y 102,9, lo cual refleja las varias uniones de este azúcar [(1→2), (1→3) y (1→6)]. Los resultados obtenidos permitieron postular estructuras parciales de distintos fragmentos del LPPG y comparar una estructura hipotética con la del glicolípido que sirve de ancla a la glicoproteína variante de superficie de Trypanosoma brucei.

La subfamilia Triatominae (Heteroptera: Reduviidae) incluye aproximadamente 140 especies de insectos hematófagos, vectores de la Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis americana. Esta es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi y afecta entre 6 y 7 millones de personas en el mundo, principalmente en América Latina. Las especies de la subfamilia Triatominae están agrupadas en complejos y subcomplejos en base a similitudes morfológicas y de distribución geográfica, entre otras características. Las distintas especies de triatominos son capaces de colonizar el hábitat doméstico, peridoméstico y silvestre y se clasifican de acuerdo con el grado de asociación con el ser humano en especies primarias y secundarias. Las especies primarias más importantes de América Latina son: Triatoma infestans, principal vector primario en Argentina y el Cono Sur de América Latina; Triatoma dimidiata distribuida en México, toda América Central y el norte y oeste de América del Sur; y Rhodnius prolixus localizado en varios países de América del Sur y América Central. Las especies del subcomplejo Sordida (Triatoma sordida, Triatoma guasayana, Triatoma patagonica y Triatoma garciabesi) están incluidas, junto con otras, dentro de las especies secundarias de mayor importancia en Argentina y países limítrofes. Este subcomplejo se encuentra ampliamente distribuido en Argentina, Bolivia, sur de Brasil, Paraguay y Uruguay. El uso de insecticidas piretroides para el control de la Enfermedad de Chagas ha reducido tanto el rango geográfico como la prevalencia de infestación con T. infestans, T. dimidiata y R. prolixus. Sin embargo, se han detectado poblaciones de T. infestans con niveles altos y muy altos de resistencia a piretroides especialmente en Argentina y Bolivia. La resistencia a insecticidas piretroides es un fenómeno multifactorial que comprende tres mecanismos principales: la insensibilidad del sitio de acción o resistencia knockdown, la actividad aumentada de enzimas detoxificantes o resistencia metabólica y la disminución de la penetración o factor cuticular de resistencia. El integumento es el tejido más externo de los insectos y está formado por la cutícula y la epidermis subyacente. Tiene una importancia fundamental en el crecimiento, el metabolismo y la fisiología general de los insectos. La cutícula comprende la epicutícula más externa y la procutícula. La epidermis incluye diversos tipos celulares como las células epidérmicas, los oenocitos, las glándulas dermales y las células tricógenas. Además de su activo rol en el metabolismo general del organismo, las células de la epidermis sintetizan todos los componentes de la cutícula y se ha demostrado que en particular los oenocitos están involucrados en la biosíntesis de los hidrocarburos y demás lípidos cuticulares. Los hidrocarburos cuticulares no sólo están implicados en evitar una pérdida de agua letal por evaporación, sino que participan en la comunicación química y también tienen un rol relevante en evitar la penetración de insecticidas. Estudios de nuestro laboratorio demostraron que la remoción de los hidrocarburos cuticulares incrementaba la penetración de insecticidas y más recientemente se mostró por primera vez en insectos, un incremento significativo de los hidrocarburos cuticulares en ejemplares de T. infestans resistentes a piretroides, asociado a una disminución de la penetración de deltametrina. Por otra parte, los hidrocarburos cuticulares han sido usados como marcadores taxonómicos para estudiar la variabilidad inter e intraespecífica en numerosas especies de insectos y en nuestro laboratorio se han usado para analizar la variabilidad intraespecífica de T. dimidiata y T. infestans, dos de los 3 principales vectores de la Enfermedad de Chagas. La FAS de insecto es una enzima que contiene siete dominios funcionales y que actúa como homodímero, catalizando la síntesis de ácidos grasos de cadena larga a partir de acetil-CoA y malonil- o metilmalonil-CoA. La síntesis de los hidrocarburos y otros lípidos cuticulares de insecto se inicia a partir de la acción de ácido graso sintasas (FASs) específicas del integumento. Los ácidos grasos de cadena larga participan en diversos procesos biológicos tales como la transducción de señales, constituyen las membranas celulares, actúan como reserva energética, etc. Los productos de las FASs del integumento son a su vez sustrato de elongasas de ácidos grasos (ELOVLs) específicas de sustrato que producen ácidos grasos de cadena muy larga. Los acil-CoA liberados del sistema elongante son sustrato de diversas enzimas como acil-CoA reductasas (FARs) y citocromos P450 de la familia 4G (CYP4Gs) para formar hidrocarburos, alcoholes grasos, ceras y demás lípidos cuticulares. En este trabajo de tesis, en primer lugar, se llevó a cabo la anotación de genes de la biosíntesis y metabolismo de lípidos cuticulares de T. infestans a partir de un transcriptoma de integumento disponible en el laboratorio y se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT- qPCR) la expresión de genes codificantes de enzimas involucradas en la formación de hidrocarburos cuticulares (FAS, ELOVL, FAR, CYP4G) en ejemplares resistentes a piretroides comparada con respecto a ejemplares susceptibles. Se detectó una sobreexpresión en los insectos resistentes de varios genes codificantes de ELOVL y CYP4G, que podría contribuir a explicar el mayor contenido de hidrocarburos cuticulares observado en estos ejemplares. Asimismo, se detectó en los insectos resistentes una sobreexpresión de genes codificantes de esterasas y CYPs del clan 3, lo que junto con otros resultados de nuestro laboratorio (aumento del contenido de HC y penetración disminuida de insecticida) sugiere una participación activa del integumento en el mecanismo de resistencia metabólica. En segundo lugar, se caracterizaron molecularmente los tres genes codificantes de FAS identificados previamente en el genoma de R. prolixus (RPRC000123, RPRC000269 y RPRC002909), y dos genes en T. infestans (KY797274 y KY805857) obtenidos a partir del transcriptoma de integumento de este insecto. Los análisis mediante RT- qPCR mostraron que los transcriptos de los genes RPRC000123, RPRC002909 y KY805857 se expresan principalmente en el integumento, mientras que los de los genes RPRC000269 y KY797274 se expresan en el cuerpo graso. Los genes de FAS ya caracterizados en D. melanogaster, junto con el análisis filogenético y de expresión diferencial en distintos tejidos de los genes codificantes de FAS en estos triatominos sugieren que, el gen RPRC000269 de R. prolixus y el gen KY797274 de T. infestas son ortólogos del gen FASN1 (CG3523), el gen RPRC002909 de R. prolixus es ortólogo del gen FASN2 (CG3524), mientras que el gen RPRC000123 de R. prolixus y el gen KY805857 de T. infestans son ortólogos del gen FASN3 (CG17374). Usando como modelo experimental a R. prolixus, se silenciaron los tres genes de FAS mediante la técnica de interferencia de ARN. El silenciamiento de los genes RPRC000269 y RPRC002909 no afectó la viabilidad de los insectos mientras que los insectos con el gen RPRC000123 silenciado, criados en condiciones de humedad estándar (45%), murieron inmediatamente luego de la muda al siguiente estadio, sin esclerotizar y oscurecer la cutícula. El análisis de los ácidos grasos e hidrocarburos del integumento de estos últimos, efectuado mediante cromatografía gaseosa capilar acoplada a un detector de ionización de llama (CGC-FID) o de espectrometría de masas (CGC-MS) reveló una disminución significativa en el contenido de ácidos grasos lineales y ramificados y de HC ramificados. Los insectos con el gen RPRC000123 silenciado y expuestos a condiciones de alta humedad (96%) sobrevivieron durante las 48hs posteriores a la muda. De esta manera se pudo determinar que la FASN3 de R. prolixus es esencial para la formación de los precursores de los hidrocarburos que impermeabilizan la cutícula. En tercer lugar, se analizaron las relaciones filogenéticas entre T. infestans y las diversas especies del subcomplejo Sordida empleando los hidrocarburos cuticulares como caracteres taxonómicos para la construcción de cladogramas según el modelo de Neighbor-Joining. Se pudo determinar a las poblaciones de T. infestans, la mayoría de las poblaciones de T. guasayana y dos de T. garciabesi como grupos monofiléticos. No se pudieron establecer relaciones filogenéticas de la mayoría de las poblaciones de T. sordida dado por la presencia de politomías. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan información relevante sobre el rol del integumento en la resistencia a insecticidas. Asimismo, permiten avanzar en el conocimiento de las funciones e importancia de las ácido graso sintasas de insecto, las cuales han sido escasamente estudiadas.