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La invasión al sistema nervioso central (SNC) por bacterias del genero Brucella resulta en un desorden inflamatorio llamado neurobrucelosis. En este trabajo nosotros presentamos evidencia in vivo e in vitro mostrando que B. abortus y sus lipoproteínas activan la inmunidad innata del SNC, originando una respuesta inflamatoria que lleva a la astrogliosis, una característica típica de neurobrucelosis. Inyecciones intracraneales de B. abortus muerta por calor (HKBA) o de la proteína de la membrana externa 19 (Omp19), una lipoproteína de B. abortus utilizada como modelo, indujeron astrogliosis concomitantemente con un infiltrado neutrofilico en el cuerpo estriado de los ratones. La infección de astrocitos y microglia con B. abortus incitó la secreción de IL-6, IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 y KC (CXCL1). HKBA también estimuló la liberación de estos mediadores inflamatorios, sugiriendo la independencia de la viabilidad bacteriana en este fenómeno e implicando a un componente estructural de la bacteria. De acuerdo con esto, Omp19 indujo el mismo patrón de secreción de citoquinas y quimiocinas. La respuesta inflamatoria desencadenada por Omp19 estuvo mediada por TLR2, ya que cultivos de células gliales provenientes de ratones TLR2 KO no promovieron la secreción de mediadores proinflamatorios. Sin embargo este receptor no media la infección ni la replicación de la bacteria en astrocitos o en microglía. La infección con B. abortus promovio apoptosis de astrocitos pero no de microglia. HKBA y Omp19 indujeron, no solo la apoptosis de los astrocitos sino también su proliferación, dos de las caracteristicas que se observan durante la astrogliosis. La proliferación inducida por HKBA y Omp19 disminuyó en presencia de Ac anti-IL-6. Por otro lado, la apoptosis promovida por los 2 estímulos fue completamente suprimida en células provenientes de ratones deficientes del receptor p55 de TNF-alfa o cuando se agregó a los cultivos el inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK. Por lo tanto, IL-6 contribuye a la proliferación de astrocitos, y la senalización de TNF-alfa vía TNFR1 a través de caspasas determina la apoptosis, cuando son estimulados con B. abortus y sus lipopoproteínas. Los resultados de esta tesis son prueba de principio de que las lipoproteínas de Brucella podrían ser determinantes de patogenia claves en neurobrucelosis, y que la astrogliosis podria contribuir a la patogénesis de la misma.

En esta Tesis se ha desarrollado una nueva técnica de caracterización óptica de superficies con resolución nanométrica. A la mencionada tecnica se le ha dado el nombre de Microscopio Óptico de Barrido por Intensificación de Campo (FESOM). El principio de operación de esta nanoscopía se basa en la intensificación del campo eléctrico de la luz en las vecindades de una punta metálica, iluminada por un láser, que se acerca a distancias atómicas de una superficie. El campo intensificado actúa como sonda local e intensa, muy localizada, que interactúa con la superficie generando una radiación que contiene información óptica de la superficie sensada, con altísima resolución lateral. Se ha demostrado, de las imágenes obtenidas, una resolución mejor que 6nm en muestras metálicas. La técnica puede ser fácilmente extendida a muestras semiconductoras o aislantes, utilizando la misma señal óptica generada como señal de realimentación del circuito de control.

Los arenavirus son virus envueltos con genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación tiene polaridad bisentido. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vez que la nucleocápside se encuentra en el citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside se denomina NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP), los cuales conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación de los arenavirus Tacaribe (TCRV) y Junín (JUNV). Debido a que TCRV no utiliza el receptor de transferrina humano (hTfR) para entrar en las células, se utilizo un modelo de células que expresan diferencialmente el TfR y se analizaron las vías de entrada utilizadas por el virus. Para ello, se utilizaron inhibidores farmacológicos de las diferentes vías endocíticas (dependiente de clatrina, colesterol, dinamina, acidificación endosomal y macropinocitosis) y se confirmaron los resultados obtenidos utilizando construcciones dominantes negativas unidas a GFP de proteínas involucradas en cada una de ellas. Estos experimentos permitieron caracterizar que en aquellas líneas que no expresan el hTfR, la vía endocítica principal de entrada es la dependiente de clatrina, dinamina y acidificación endosomal mientras que en las células que si expresan dicho receptor, la vía principal es la macropinocitosis. La endocitosis del virus mediada por la unión a un receptor celular puede desencadenar diferentes señales intracelulares para beneficiarse de procesos celulares. En este trabajo estudiamos la participación de la autofagia durante la infección con JUNV en un modelo de células humanas. Se analizó la distribución de la proteína LC3 sobreexpresada (marcador de la vía de la autofagia), se utilizaron inhibidores farmacológicos y células con el gen Atg 5 mutado (esencial para la activación de la vía convencional de la autofagia). Los resultados obtenidos permitieron determinar que esta vía se activa desde el inicio de la infección y permanece activa hasta 24 hs post-infección. Los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientos básicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de estos arenavirus, sino que además permite desarrollar nuevos blancos antivirales contra JUNV.

El estudio de los mecanismos por los cuales las sustancias químicas producen daños en un ser viviente se puede realizar de modo más simple y racional con el empleo de sistemas modelo de experimentación. El tetracloruro de carbono actuando sobre el hepatocito es un clásico en la investigación toxicológica y en patología. Todavia queda mucho por entender acerca de las reacciones químicas que ocurren entre este tóxico y los distintos componentes celulares y que son la causa primaria de todos los procesos que conducen a los varios tipos de daños observados. En el campo de la carcinogénesis química, dos razones apoyan el empleo de este modelo experimental: el tetracloruro de carbono es un representante de una extensa familia de sustancias químicas carcinogénicas con mecanismo de acción desconocido. Por otra parte, desde el punto de vista ambiental, la carcinogénesis hepática por CCl4 es un problema relevante por él mismo y por otros solventes clorados de amplio uso industrilal. En el presente trabajo de pretendió aportar al conocimiento de la química de las interacciones de CCl4 con componentes celulares, actuando éste sobre el hepatocito. Además se propone una nueva hipótesis para entender el mecanismo de acción iniciadora de la carcinogénesis de este compuesto, que por su naturaleza general sería extrapolable a otros carcinógenos. Se estudió la capacidad de interacción de metabolitos reactivos del tetracloruro de carbono (principalmente radicales libres triclorometilo) con el ADN y con proteínas nucleares, la peroxidación de lípidos hepática (total y nuclear) estimulada por CCl4 y la biotransformación de CCl4 a CHCl3 en hígado (total y en núcleos); en tres especies animales con diferente respuesta a la carcinogénesis hepática inducida por CCl4. Ellas fueron el hamster sirio dorado, el ratón C3H y la rata Sprague Dawley. La susceptibilidad hacia este carcinógeno sigue el orden: hamster ≥ ratón C3H >> rata Sprague Dawley = O. No se observó correlación entre el grado de susceptibilidad de esas especies y la intensidad de las interacciones (expresadas como unión covalente de 14C) de metabolitos reactivos de CCl4 con el ADN. Se observó correlación, en cambio, entre la intensidad de las interacciones con proteínas nucleares totales y la respuesta carcinogénica a CCl4 en esas especies. Cuando se efectuaron estudios sobre distintas fracciones de las proteinas nucleares (solubles I y II, histonas, desoxirribonucleoproteinas I y II, ribonucleoproteínas acídicas y proteínas residuales) se verificó la existencia de una correlación entre intensidad de las interacciones de metabolitos reactivos de CCl4 (unión covalente de 14C) con las fracciones acídica y residual, y la respuesta carcinogénica de las tres especies al CCl4. Se verificó que preparados nucleares de hígado de hamster, de ratón C3H y de rata Sprague Dawley son capaces de biotransformar CCl4 a CHCl3 y de estimular (en atmosfera aerobia) la peroxidación de sus lípidos en presencia de CCl4 y en presencia o ausencia de NADPH. No hubo correlación entre peroxidación nuclear (o en tejido entero) y la conocida respuesta carcinogénica de las tres especies. Habría sin embargo alguna correlación entre la capacidad biotransformadora de CCl4 a CHCl3 en preparados nucleares y la susceptibilidad a la carcinogénesis por CCl4. No se observó lo equivalente en tejido hepático entero. Se observaron interacciones entre radicales libres *CCl3 (generados por acción iniciadora de peróxido de benzoilo sobre CCl4) y las cuatro bases del ADN: guanina, adenina, citosina y timina (detección por FID, CE y EM). En los cuatro casos se intentó realizar la identificación estructural de los productos formados por espectrometia de masas. No se han obtenido aún resultados positivos. Las fragmentaciones generadas por los derivados trimetilsililados son escasas y ello dificulta la interpretación de los espectros (ver Resultados). Es nuestra intención proseguir en el futuro con la identificación estructural, intentando modos alternativos de derivatización u otras técnicas espectroscópicas. Se evidenciaron interacciónes entre radicales libres *CCl3 (generados por acción iniciadora de peróxido de benzoilo sobre CCl4) y varios aminoácidos (fue estudiada la reacción con 18 aminoácidos). Los aminoácidos arginina, aspártico, glutámico, glicina, leucina, lisina, norleucina y valina no mostraron reaccionar de modo apeciable. Los restantes (cisteina, cistina, metionina, fenilalanina, histidina, prolina, serina, treonina, triptofano y tirosina) reaccionaron con distinto grado de intensidad. Para algunos (metionina, fenilalanina y tirosina) fue posible identificar productos de interacción, ya fuera aductos clorados, productos de fragmentación, etc. En los casos de metionina y de fenilalanina observamos la ocurrencia de interacciones que no pueden ser consideradas como unión covalente de metabolitos reactivos o peroxidación de lípidos inducida por CCl4. Se trata de alteraciones inducidas sobre los aminoácidos que implican la fragmentación de la molécula. Para metionina pudimos observar la formación de dimetildisulfuro y de metanotiol, en un sistema de incubación microsomal "in vitro". Ambos productos derivarian de la fragmentación de la cadena lateral del aminoácido para dar radicales libres *SCH3. Fenilalanina mostró también ser capaz de generar productos de degradación como el benceno, que fue observado en incubaciones de microsomas hepáticos. Hemos visto que el tetracloruro de carbono, que produce una variedad de alteraciones y daños en el higado, se metaboliza a especies muy reactivas que interaccionan con proteinas, lípidos y ácidos nucleicos, y que esas interacciones son la causa original de las alteraciones que más o menos directamente conducirán a los efectos tóxicos visibles. Se desprende de esto la importancia que tiene conocer en lo posible la química de esas interacciones pues ello nos permitirá a su vez entender mejor cada efecto observado en los parámetros que midamos, nos permitirá predecir tipos y localizaciones de otras alteraciones probables y por último dará las pautas para diseñar tratamientos que neutralicen o eviten algunas de esas interacciones y/o sus consecuencias. Si tenemos en cuenta además la relevancia del sistema CCl4-hepatocito como modelo experimental de daño celular, extrapolable a situaciones de otros tóxicos-hepatocito, CCl4- otros órganos, otros tóxicos-otros órganos o aún otros tóxicos-otros seres vivos, resulta obvio el interés que para nosotros y otros laboratorios tiene investigar en este campo, por la generalidad que puede asignarse a los resultados que se obtengan (15, 158). En este trabajo se ha pretendido aportar al conocimiento de las interacciones de metabolitos reactivos de CCl4 con aminoácidos y bases de ácidos nucleicos, pues es muy poco lo realizado hasta ahora en el tema. Somos conscientes de la cantidad de trabajo experimental que implican estos objetivos pero justamente nuestra intención es continuar con esta linea en el futuro. Un hallazgo a nuestro juicio novedoso, comprende a los resultados obtenidos con metionina y en parte con fenilalanina. Encontramos mecanismos de alteración de los componentes celulares que no corresponden a los tradicionales en la toxicología del CCl4 y de otros tantos compuestos (unión covalente de metabolitos y peroxidación de lípidos) pero que son completamente justificados por la naturaleza quimíca de los productos de biotransformación de CCl4, esto es fundamentalmente el radical libre triclorometilo. Desde que se postula la formación ya sea "in vivo" o "in vitro" de un radical libre, deben esperarse en principio todas las interacciones que normalmente realiza tal especie (abstracciones, adiciones, dimerizaciones, etc.). Lo que encontremos en la situación real dependerá del medio en que se haya formado, qué otras moléculas se hallen presentes, la estabilidad de los productos formados, etc., eso es lo que aporta el medio biológico. Este razonamiento, que puede parecer trivial, ha sido sin embargoresistido en el medio de investigación toxicológico o en patología, limitándose exclusivamente a considerar las interacciones tóxico-medio en términos de uniones covalentes y/o peroxidación de lípidos. En determinados casos incluso, la sola existencia de radicales libres suponía peroxidación de lípidos como causa excluyente de las patologías observadas. Es en este sentido donde creemos haber hecho un aporte relevante, al señalar mecanismos de interacción posibles simplemente reconociendo al tóxico como una sustancia química que reaccionará como tal y que debe estarse atento a considerar todos los tipos de interacción posibles, de acuerdo a su naturaleza. En lo que se refiere a carcinogénesis química, consideramos que el tetracloruro de carbono puede servir como un buen modelo para estudiar el modo de acción de nmchos carcinógenos no genotóxicos. La buena correlación obtenida entre unión covalente a proteínas nucleares (y entre éstas a las acídicas) y susceptibilidad a la inducción de tumores en distintas especies, nos hace pensar en que la hipótesis propuesta puede ser válida. En efecto, las alteraciones que pueda producir un metabolito reactivo como un radical libre interaccionando con los distintos aminoácidos muy probablemente alteren o anulen las funciones de las proteínas reguladoras de la expresión genética. Esto permitiría la expresión de zonas del genoma que usualmente no se expresan y asi comenzaría la transformación de la célula. Por otra parte, creemos que esta hipótesis es extrapolable a muchos otros carcinógenos epigenéticos, ya que la idea central, la alteración de los mecanismos reguladores de la expresión del ADN por ataque de metabolitos reactivos, es conceptualmente generalizable a muchas sustancias que se biotransforman generando especies de gran reactividad quimica. Es nuestra intención realizar en el futuro experimentos similares con otros hidrocarburos clorados que poseen un comportamiento como carcinógenos del mismo tipo que el tetracloruro de carbono.

Resumen temporalmente no disponible. La presente obra no cuenta con resumen provisto por el autor.

Fil:Cáceres, Javier Fernando. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En el presente trabajo se aborda un estudio cristalográfico del sitio activo de la enzima cisteínica papaína en complejo con uno de sus inhibidores. El estudio incluye el proceso de cristalización, con diferentes métodos y seguimientos de la evolución de los cristales; colección parcial de datos de difracción, a partir de los cuales se determinan los parámetros de celda del complejo. Refinamiento de la posición del inhibidor en el sitio activo conjuntamente con la ubicación de moléculas de agua en el mismo. Posteriormente, y a partir de las coordenadas cristalográficas se realiza un cálculo de la interacción electrostática en el proceso de unión de la Leupeptina con la Papaína. La última parte comprende el cálculo del potencial electrostático de la Fosfolipasa A₂ de pancreas porcino a una membrana lipídica, observándose la importancia del ión Calcio en la actividad catalítica de la enzima.

Se presenta el estudio de dos sistemas de interés biofísico a nivel molecular mediante técnicas computacionales. Se pone de manifiesto la relevancia de las interacciones eléctricas. Se proponen mecanismos de interacción molecular relevantes para la función biológica de una proteína. En el capítulo I se describe la motivación por este tipo de estudios en las aplicaciones de diseño de fármacos y se menciona la teoría relacionada. El capítulo II refiere la técnica de resolución numérica de la Ecuación de Poisson–Boltzmann también llamada Modelo Macroscópico–microscópico Electrostático. En el III se describe la técnica de simulación por Dinámica Molecular (DM), con un apéndice sobre la técnica de Dinámica Browniana (DB). En el IV se presentan los resultados de simulación por DB de un sistema de Cloruro de Sodio en Agua. En el V se presenta el estudio de la interacción de la proteína transportadora de Acil Coenzima A (ACBP) con una membrana biológica. Y por último, en el VI se presentan los resultados de la simulación por DM de la ACBP en su interacción con un ligando: el Palmitoil unido a una Coenzima A.

Tesis de Maestría

En la actualidad, el crecimiento vertiginoso de la cantidad de información genera volúmenes de datos cada vez más grandes y difíciles de comprender y analizar. El aporte de la visualización a la exploración y entendimiento de estos grandes conjuntos de datos resulta altamente significativo. Es frecuente que distintos dominios de aplicación requieran representaciones visuales diferentes; sin embargo, varios de ellos comparten estados intermedios de los datos, transformaciones, y/o requieren manipulaciones similares a nivel de vistas. Al analizar estos denominadores comunes se plantea la necesidad de contar con un modelo de visualización consistente para todas las áreas de visualización que sea válido para distintos dominios de aplicación. En este contexto se define el Modelo Unificado de Visualización(MUV), un modelo de estados representado como un flujo entre los distintos estados que asumen los datos a lo largo del proceso. Las características del proceso de visualización determinan que el usuario deba poder interactuar con los datos y sus representaciones intermedias, controlar las transformaciones y manipular las visualizaciones. En este contexto, la definición de una taxonomía delas interacciones en el área de visualización es sumamente necesaria para lograr un mejor entendimiento del espacio de diseño de las interacciones. El objetivo general de esta tesis consiste en establecer tanto las interacciones comouna clasificación de las mismas en el área de visualización que sea válida en los distintos dominios de aplicación. Las interacciones definidas deberán poder aplicarse sobre lasdistintas transformaciones y estados del proceso de visualización. En este contexto, surge la necesidad de definir una representación para los conjuntos de datos lo suficientementeflexible y orientada al área de visualización, que permita soportar las distintas clasificaciones de datos, atributos, conjuntos de datos y mapeos visuales presentes en la literatura de visualización. Finalmente, con el objetivo de estudiar y validar los conceptos introducidos en esta tesis, se diseñó e implementó el SpinelViz y el Spinel Explorer, dos prototipos de visualización de datos geológicos. Para cada prototipo se diseñó un conjunto de interacciones dedicadas que contribuyeron directamente a un avance significativo en el flujo de trabajo de los geólogos expertos. Además, se mostró cómo la clasificación de las interacciones y las operaciones definidas permiten ordenar y facilitar el desarrollo de un sistema de visualización en un determinado campo de aplicación.