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El reconocimiento de antígenos por medio de anticuerpos es un evento fundamental en la respuesta inmune adaptativa. A su vez la formación de los complejos Antígeno:Anticuerpo es extensivamente utilizada como modelo de estudio de interacción proteína-proteína. En la presente tesis estudiamos el mecanismo de reconocimiento de un anticuerpo monoclonal específico, M1, por la proteína E7 del papilomavirus humano (HPV). E7 es la oncoproteína que constituye la principal actividad transformante del virus y además es paradigma de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). E7 se expresa constitutivamente en tejidos de carcinoma y la aparición de anticuerpos específicos ocurre con alta frecuencia en pacientes con cáncer cervical. Llevando a cabo un mapeo epitópico determinamos que el anticuerpo M1 reconoce específicamente una región inmunodominante de la proteína de HPV- 16 denominada “bisagra”, por conectar el dominio IDP N-terminal con el dominio globular Cterminal de la misma. Experimentos cinéticos mostraron que la región reconocida por M1, la cual posee dos residuos de prolina, comprende al menos dos poblaciones separadas por una alta barrera energética (~ 22 Kcal/mol). Los estudios de Resonancia Magnética Nuclear identificaron el origen de esta barrera como un evento de isomerización cis-trans de las prolinas presentes en el epítope de reconocimiento. Se determinó que el anticuerpo M1 reconoce específicamente al epítope en su conformación minoritaria (10%), que posee sus prolinas en cis, mediante el mecanismo de selección conformacional. Por lo tanto, se requiere que el 90% de las moléculas que se encuentran en configuración trans isomericen previo a la unión con el anticuerpo. La velocidad de asociación del conformero cis por M1 ( kon = 6 x 107 M-1 s-1) se encuentra entre las más rápidas para las interacciones Antígeno:Anticuerpo, a pesar de que la reacción global es extremadamente lenta (t1/2 ~ 4 min). Esto indica que la reacción de asociación se encuentra limitada por un evento de isomerización de prolina. Utilizando mutantes puntuales demostramos que la P41 en su conformación cis es la requerida para la unión con el anticuerpo. Luego del evento lento de pre-equilibrio y de la unión con M1, ocurre un evento de rearreglo unimolecular, formándose finalmente un complejo consolidado de alta afinidad (KD 120 nM). Nuestros resultados sugieren que la presentación de este epítope viral por las células presentadoras de antígeno tiene que haber estado en su configuración minoritaria cis, al generar el clon que produce el anticuerpo específico. Finalmente, mostramos la importancia de los determinantes estructurales presentes en regiones desordenadas en el reconocimiento entre macromoléculas. Dado que numerosas proteínas virales son multifuncionales debido a su naturaleza IDP, los resultados presentados en esta tesis sientan la bases para el análisis del mecanismo de reconocimiento por medio de anticuerpos de epítopes virales intrínsecamente desordenados.

Fil:Kerner, Néstor Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Se estudió en músculo de rata algunos, mecanismos que relacionan el sistema de enzimas que interviene en la fosforolisis de las uniones α(1→4) del glucógeno (sistema de la fosforilasa) con aquel responsable de la síntesis de dichas uniones (sistema de la glucógeno sintetasa). Se sabe que existen dos formas interconvertibles de fosforilasa, una activa solo en presencia de adenosina 5 monofosfato, la fosforilasa b y la otra forma, la fosforilasa a que no requiere dicho cofactor. La transformación de la fosforilasa b en a es catalizada por la fosforilasa b quinasa y la conversión inversa, por la fosforilasa a fosfatasa o PR enzima. La fosforilasa b quinasa existe también en dos formas: una "no activada", con muy poca actividad a pH 7,0 y mayor actividad a pH 8,0 y otra "actividad" casi con igual actividad a pH 7,0 y 8,0. También se sabe que la glucógeno sintetasa se presenta a su vez en dos formas, una , la glucógeno sintetasa dependiente, que es activa solo en presencia de glucosa 6 fosfato y la otra, la glucógeno sintetasa independiente que no necesita dicha hexosa fosfato para su actividad. Se comprobó, que una serie de factores, que actuan sobre la fosforilasa b quinasa actúan también pero en sentido opuesto sobre la glucógeno-sintetasa. Así el adenosina trifosfato con iones magnesio y 3´-5´ adenosina monofosfato cíclico (ATP-MG++-3´5´ AMP) o el ion calcio (Ca++) o la tripsina a la vez que convierten una forma menos activa de la fosforilasa b quinasa ("no activada") en otra más activa ("activada"), transforman una forma más activa de la glucogenosintetasa ("independiente" en otra menos activa ("dependiente"). Se comprobó que la acción del ATP-Mg++ - 3´5´ AMP sobre la glucógenosintetasa era independiente de aquella producida por el Ca++. Así, preparados insensibles al Ca++ fueron snsibles al: ATP-Mg++-3´5´ AMP y viceversa. Al estudiar el efecto del Ca++ sobre la glucógeno sintetasa, se separó un factor indispensable para dicho efecto, el que sería de naturaleza proteica, ya que es sensible al calor, no dializable y atacable por enzimas proteolíticas. El peso molecular de este factor, sería de alrededor de 130.000. Este factor proteico, que actúa sobre la glucógeno-sintetasa no pudo ser separado del factor que interviene en el efecto del Ca++ sobre la fosforilasa b quinasa, obtenido por mayer ya sea por precipitación fraccionada con sulfato de amonio, cromatografía en dietilaminoetilcelulosa (DEAE) o ultrafiltración con Sephadex G 200. Tampoco se pudieron diferenciar ambos factores por tratamiento con calor o digestión con tripsina. De confirmarse la identidad de ambos factores y dado el hecho que actuaría simultáneamente y en forma opuesta sobre la fosforilasa b quinasa y la glucógeno sintetasa, podría ser este, otro elemento de regulación en la síntesis y degradación del glucógeno. También se estudiaron as propiedades diferenciales de la glucógeno sintetasa dependiente obtenida con ATP-Mg++-3´5´ AMP, de aquella obtenida con Ca++. Mientras la primera es reconvertible a la forma independiente por acción del mercaptoetanol y iones magnesio, la obtenida con Ca++, no lo es. Por otra parte, esta última es más sensible al calor y a la digestión con tripsina, que la obtenida con ATP-Mg++-3´5´ AMP. Sin embargo, las constantes de Michaelis y velocidades máximas para UDPG y G6P y las inhibiciones producidas por UDP y glucosa son semejantes para ambas glucógeno sintetasas. Se comprobó además que otros factores que actúan sobre el sistema de la fosforilasa actúan también sobre el de la glucógeno sintetasa como ser: 1) acción de la adrenalina sobre el de la glucógeno sintetasa como ser: 1) acción de la adrenalina y de su intermediario el 3´5´ adenosina monofosfato; 2) inhibición del efecto del Ca++ por una fracción sobrenadante de la precipitación de la glucógeno sintetasa a pH 5,2 y 3) la acción destructiva del mismo Ca++ sobre el factor proteico que interviene en sus efectos sobre la glucógeno-sintetasa y la fosforilasa b quinasa. Finalmente se discute la función que el Ca++ y el adenosina trifosfato pueden tener desde el punto de vista fisiológico, en relación con el trabajo muscular y las acciones hormonales en distintas condiciones. De las conclusiones del trabajo experimental descripto en esta tesis y de los elementos que nos da la bibliografía se puede esquematizar un mecanismo como el indicado en la figura 3 y 4.

El uso de hormigón reciclado aparece como uno de los temas de interés en el campo de la tecnología del hormigón considerando la necesidad de incorporar criterios de desarrollo sustentable en ámbito de la construcción civil. Los agregados reciclados poseen características particulares con respecto a los agregados naturales; en general se destacan su mayor porosidad y absorción, como también su menor densidad y resistencia. Existen antecedentes que indican que las características de las interfaces matriz-agregado reciclado favorecen la adherencia. Al mismo tiempo se ha demostrado que los cambios en la rigidez del hormigón con agregados reciclados son más importantes que los registrados en la resistencia a compresión. Estos hechos permiten presuponer que pueden existir cambios en el mecanismo de falla del hormigón con agregados reciclados, particularmente a medida que se elevan los niveles de resistencia. Esta tesis tiene como objetivo analizar el mecanismo de rotura bajo cargas de tracción en hormigón con agregados reciclados. En primer lugar se presenta la caracterización de los agregados gruesos naturales y reciclados a través de las medidas de densidad, absorción, desgaste y estimación de su resistencia a través de ensayos de carga puntual, y se analiza la adherencia de morteros con diferentes relaciones agua/cemento con agregados naturales (piedra partida granítica) y dos tipos de agregado reciclado obtenidos a partir de la trituración de un hormigón de resistencia normal y un hormigón de alta resistencia. Seguidamente se analizan tres series de hormigones con diferentes niveles de resistencia las cuales incluyen un hormigón de referencia elaborado con agregado natural y dos hormigones reciclados elaborados con los mismos agregados reciclados. Se evaluaron la respuesta en flexión de vigas entalladas, la resistencia a tracción por compresión diametral y el comportamiento bajo compresión uniaxial sobre cilindros normalizados. Con el fin de considerar el efecto de los agregados naturales y reciclados y de los distintos niveles de resistencia de la matriz se analizaron las superficies de fractura observando la distribución y estado de los agregados e interfaces. Los resultados permiten discutir la incidencia que poseen la adherencia de interfaces y la resistencia relativa de las fases componentes del hormigón sobre el mecanismo de rotura del compuesto.

Fil:Capasso, Juan Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La interacción proteína-ADN juega un papel central en la fisiología celular. Dentro de éstas, se identifica al reconocimiento secuencia especifico con un rol regulatorio clave, pues de éstas interacciones depende la orquestación de los patrones de expresión génica de un organismo. Utilizando el dominio de unión a ADN del factor de transcripción E2 del papilomavirus humano, nos propusimos analizar la interacción en condiciones en las cuales fuera posible extraer datos fisicoquímicos precisos del proceso de unión. Confiamos en que la interpretación de éstos en términos termodinámicos provee un marco para relacionar las estructuras proteicas con su funcionalidad biológica Caracterizamos un mecanismo de unión E2c-ADN al equilibrio en el cual E2c presenta dos modos diferentes de unión de ADN diferentes. Estos modos resultan estar estrechamente relacionados con la ocurrencia de poblaciones conformacionales del estado plegado de E2c. Mostramos ademas que ésto no sucede en un homólogo cercano con el que comparte una alta identidad de secuencia y una topología de plegamiento idéntica, sugiriendo que ésto puede estar relacionado con los distintos roles funcionales que E2c presenta. El camino cinétíco de interacción E2c-ADN se inicia con una colisión rápida, limitada por la difusión de las macromoléculas en solución. Esto da lugar a un "complejo de encuentro" estabilizado por interacciones electrostáticas, en el cual E2c tiene la posibilidad de deslizarse sobre la doble hélice. Si el ADN contiene un sitio E2, el complejo sufre fuertes rearreglos conformacionales que, luego de una fase de expulsión de solvente. resultan en la formación de un complejo estable proteina:ADN. Este último paso involucra un ocultamiento de superficie accesible al solvente y es allí donde se consolidan las interacciones cercanas aminoácido-base. Experimentos de doble-mezcla por flujo detenido nos permitieron asignar el orden secuencial de los rearreglos y demostrar que la unión puede también proceder por una ruta macroscópica paralela. caracterizada como de dos estados. Utilizando una estrategia de mutagénesis sitio-dirigida realizamos un mapeo energético de la interfase de unión. Pudimos asignar las contribuciones que cada residuo realiza, en forma aditiva, a la energía libre de asociación. Las asignaciones energéticas resultaron estar en excelente concordancia con las estructuras de alta resolución, y correlacionan con el carácter altamente dinámico de la interfase de asociación. Lon conjuntos de estados de transición del camino cinético fueron analizados con 23 mutantes sitio-dirigidas. Esto nos permitió disectar las contribuciones energéticas de los residuos independientes a nivel atómico e inferir los cambios conformacionales que ocurren durante las etapas de unión y reconocimiento de secuencia. Mostramos que la plasticidad estructural que E2c presenta está íntimamente ligada a su capacidad de reconocimiento sitio-específico. Por último, presentamos un modelo funcional plausible de regular la actividad biológica de E2c y su capacidad de reconocimiento de secuencias de ADN.

Durante una infección por P. aeruginosa, la migración de las células fagociticas desde la circulación hacia el pulmónes necesaria para la inactivación de la bacteria. Una respuesta inflamatoria incrementada o acelerada puede, sin embargo, perjudicar al huésped y puede dejar serias secuelas en aquellos pacientes que se reacuperan de una neumonía por P. aeruginosa. Los productos de origen bacteriano con actividad quimiotáctica y quimiotaxigénica ha sido extensamente estudiados debido a su importancia como inductores de inflamación. A pesar que la acumulación de LPMN parece ser una de las mayores causas de la inducción de patogénesis durante la inflamación aguda, poco es lo que se conoce a cerca del efecto de los péptidos quimiotácticos bacterianos sobre los eventos fisiopatológicos que ocurren durante una infección por E. aeruginosa. En estudios previos de nuestro equipo se demostró que B. aeruginosa y g. aureus liberan quimiotactinas en cultivo, con capacidad de atraer LPMN. En este trabajo se ha demostrado que B. aeruginosa libera en cultivo una mezcla de sustancias quimiotacticas para LPMN, con características peptidicas de bajo peso molecular; la contribución de estas sustancias a la actividad quimiotáctica del SBCP es predominante. Las quimiotactinas activan a los LPMN para producir especies reactivas del oxigeno. La respuesta funcional de los LPMN in vitro, frente a las quimiotactinas bacterianas fue parcialmente incrementada por la preincubación de las células con IL-l. La actividad quimiotáctica y la liberación de especies reactivas del oxígeno por los LPMN activados con las quimiotactinas bacterianas in vitro, fueron parcialmente inhibidas por una DAINE. Los estudios in vivo permitieron demostrar que 1a migración de los LPMN, puede ser inducida por un aerosol de P. aeruginosa, por los quimiotácticos bacterianas o un quimiotáctico sintético. La quimiotaxis de los LPMN, en el modelo murino, fue inhibida por el tratamiento con piroxicam. La mortalidad de los ratones, en el modelo de neumonía inducido por P. aeruginosa fue disminuida, tanto por el tratamiento con piroxicam previo como por el tratamiento posterior al desafío por aerosol. Los resultados obtenidos en los experimentos in vivo e in vitro permitieron conocer parte de los mecanismos del daño de tejido pulmonar inducido por LPMN durante la infección por P. aeruginosa. También se demostró la posibilidad de regular el proceso inflamatorio inducido por P. aeruginosa, mediante el tratamiento con DAINE. Estos hallazgos permiten considerar la aplicación clinica futura de estas drogas para controlar el daño de tejido pulmonar inducido durante la neumonía por P. aeruginosa.

La proto-oncoproteína c-Fos es un factor de transcripción tipo AP-1 cuya función fue descripta hace más de 25 años (Curran & Morgan 1987). En su función canónica, c-Fos forma heterodímeros funcionales con proteínas de las familias Jun, ATF o JDP, que se unen a regiones específicas del ADN y promueven la transcripción de múltiples genes blanco (Hess et al. 2004). Esta actividad AP-1 ha sido involucrada en la transformación de señales de crecimiento de corta duración en cambios de larga duración al regular la expresión de genes involucrados en el crecimiento celular. Evidencias previas del laboratorio han demostrado que la proteína c-Fos, de manera independiente de su actividad como factor de transcripción tipo AP-1, activa la síntesis de fosfolípidos al asociarse al retículo endoplásmico (Caputto et al. 2014). El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar la actividad no genómica de c-Fos por la es capaz de activar la síntesis de lípidos, y en particular el mecanismo molecular por el cual c-Fos ejerce este efecto. Encontramos que para alcanzar el incremento en el marcado radioactivo de todas las especies de fosfolípidos analizadas, c-Fos afecta positivamente solo etapas metabólicas específicas. Utilizando homogeneizados de células NIH3T3 quiescentes, encontramos que c-Fos recombinante activa in vitro la actividad de CDP-diacilglicerol sintasa, Lipin 1 y fosfatidilinositol 4-quinasa tipo II pero no fosfatidilinositol sintasa. La constante cinética Vmax se incrementó para todas las enzimas analizadas mientras que no se observó ningún efecto en Km, una medida de la afinidad de la enzima por su sustrato. Más aún, hemos probado la activación in vitro en un sistema purificado que contiene sólo a c-Fos, Lipin 1 y membranas modelo compuestas de micelas mixtas de Triton X-100/PA. En este sistema altamente simplificado, encontramos que c-Fos incrementa la actividad enzimática de Lipin1 sin modificar la afinidad de esta por las membranas modelo. En orden de explicar el mecanismo de activación enzimática, realizamos ensayos de interacción proteína-proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación y de microscopía FRET establecimos una interacción física entre c-Fos y las enzimas que activa mientras que esta no se produce con aquellas enzimas cuya actividad c-Fos no regula. El empleo de mutantes de deleción permitió determinar que la región involucrada en la activación enzimática es diferente de la región responsable de la unión a enzimas específicas, y que estas regiones de asociación/activación son comunes a todas las enzimas estudiadas. Mientras que la región de activación es el dominio básico de c-Fos, la región de asociación se encuentra en el N-terminal de la proteína. Los resultados apoyan nuestra hipótesis de un mecanismo compartido en la activación de la síntesis de fosfolípidos en el que c-Fos se asocia físicamente con las enzimas responsables de la síntesis de fosfolípidos que es capaz de activar modificando su eficiencia catalítica sin alterar la afinidad de la enzima blanco por su sustrato. A su vez, refuerzan el concepto de una proteína que posee dos funciones diferenciales como lo son la de su actividad como factor de transcripción y la capacidad de incrementar actividades enzimáticas claves per se, para de esta forma sostener eventos de proliferación o diferenciación celular.

La proto-oncoproteína c-Fos es un factor de transcripción tipo AP-1 cuya función fue descripta hace más de 25 años (Curran & Morgan 1987). En su función canónica, c-Fos forma heterodímeros funcionales con proteínas de las familias Jun, ATF o JDP, que se unen a regiones específicas del ADN y promueven la transcripción de múltiples genes blanco (Hess et al. 2004). Esta actividad AP-1 ha sido involucrada en la transformación de señales de crecimiento de corta duración en cambios de larga duración al regular la expresión de genes involucrados en el crecimiento celular. Evidencias previas del laboratorio han demostrado que la proteína c-Fos, de manera independiente de su actividad como factor de transcripción tipo AP-1, activa la síntesis de fosfolípidos al asociarse al retículo endoplásmico (Caputto et al. 2014). El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar la actividad no genómica de c-Fos por la es capaz de activar la síntesis de lípidos, y en particular el mecanismo molecular por el cual c-Fos ejerce este efecto. Encontramos que para alcanzar el incremento en el marcado radioactivo de todas las especies de fosfolípidos analizadas, c-Fos afecta positivamente solo etapas metabólicas específicas. Utilizando homogeneizados de células NIH3T3 quiescentes, encontramos que c-Fos recombinante activa in vitro la actividad de CDP-diacilglicerol sintasa, Lipin 1 y fosfatidilinositol 4-quinasa tipo II pero no fosfatidilinositol sintasa. La constante cinética Vmax se incrementó para todas las enzimas analizadas mientras que no se observó ningún efecto en Km, una medida de la afinidad de la enzima por su sustrato. Más aún, hemos probado la activación in vitro en un sistema purificado que contiene sólo a c-Fos, Lipin 1 y membranas modelo compuestas de micelas mixtas de Triton X-100/PA. En este sistema altamente simplificado, encontramos que c-Fos incrementa la actividad enzimática de Lipin1 sin modificar la afinidad de esta por las membranas modelo. En orden de explicar el mecanismo de activación enzimática, realizamos ensayos de interacción proteína-proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación y de microscopía FRET establecimos una interacción física entre c-Fos y las enzimas que activa mientras que esta no se produce con aquellas enzimas cuya actividad c-Fos no regula. El empleo de mutantes de deleción permitió determinar que la región involucrada en la activación enzimática es diferente de la región responsable de la unión a enzimas específicas, y que estas regiones de asociación/activación son comunes a todas las enzimas estudiadas. Mientras que la región de activación es el dominio básico de c-Fos, la región de asociación se encuentra en el N-terminal de la proteína. Los resultados apoyan nuestra hipótesis de un mecanismo compartido en la activación de la síntesis de fosfolípidos en el que c-Fos se asocia físicamente con las enzimas responsables de la síntesis de fosfolípidos que es capaz de activar modificando su eficiencia catalítica sin alterar la afinidad de la enzima blanco por su sustrato. A su vez, refuerzan el concepto de una proteína que posee dos funciones diferenciales como lo son la de su actividad como factor de transcripción y la capacidad de incrementar actividades enzimáticas claves per se, para de esta forma sostener eventos de proliferación o diferenciación celular.

Este trabajo de investigación tiene por objeto determinar los parámetros cinéticos y termodinámicos que influyen en la velocidad de la reacción. Se siguieron criterios de trabajos recientes para estimar y eliminar posibles errores en la medida de la velocidad de reacción debido a gradientes de concentración y temperaturas en el lecho catalítico. Como instrumentó de análisis se usó un cromatógrafo de gases para verificar su precisión y reproductibilidad se analizaron muestras paralelamente mediante un equipo dé infrarrojo. Para el procesamiento de los datos se diseñó un programa de computación que analizara en forma exhaustiva, desde el punto de vista estadístico, el grado de influencia de c/u de las variables que influyen en la velocidad de reacción, como así también el grado de correlación y la incertidumbre de los valores obtenidos (linealidad, correlación simple y múltiple, desviaciones, varianza, test "t" y test "F" ) para los modelos cinéticos postulados.