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Se estudia la impregnación alcalina de astillas de madera de latifoliada, aspecto de gran importancia en el pulpado alcalino. Se analiza el fenómeno unidireccional transversal isotérmico donde el álcali que difunde, reacciona y modifica química y físicamente a la madera. Se evalúan la importancia relativa de la difusión, reacciones químicas e hinchamiento. Se determina la velocidad de deacetilación (reacción principal) para eucalipto en condiciones cercanas y extrapolables a las industriales. Esta muestra depencia con la temperatura, las concentraciones de acetilos y álcali y la fuerza iónica del medio. Para el análisis de la difusión se utiliza la capilaridad efectiva, propiedad intrínseca de la madera y se determina su dependencia con la temperatura, fuerza iónica, pH, y grado de acción química, encontrándose mayor influencia del ataque químico que de las demás variables. Se obtienen experimentalmente los perfiles de concentración de iones y grado de avance de reacciones en la impregnación de madera sólida bajo diferentes condiciones, similares a las del proceso industrial. Se considera el balance de masa para las principales especies involucradas. El estudio considera las reacciones químicas más relevantes y los cambios temporales, físicos y químicos, en cada posición de la madera debido a la acción del álcali. La resolución numérica se realiza mediante el programa gPROMS (general PROcess Modeling System). Los perfiles encontraron en la simulación del fenómeno están de acuerdo con los resultados experimentales. El efecto de las principales variables de proceso se puede analizar a través del modelo propuesto.

La producción de granos en soja depende, al menos en parte, del fotoperíodo explorado durante post-floración. Este efecto fotoperiódico ha sido vinculado a los cambios en la duración de la oferta de recursos (efecto indirecto) ya que el fotoperíodo modifica la duración de la etapa post-floración. Sin embargo, los cambios en el fotoperíodo también alteran la morfología y el desarrollo de las plantas de soja pudiendo afectar directamente la producción de granos, además de los cambios mencionados en la oferta de recursos. Este tipo de efectos fotoperiódicos directos permitirían hacer un uso más eficiente de los recursos para producir granos. En este marco, el objetivo de esta tesis es estudiar los mecanismos asociados a la producción de granos en soja frente a cambios en el fotoperíodo en post-floración. Se realizaron dos experimentos a campo con tratamientos de extensión artificial del fotoperíodo para identificar los mecanismos fotoperiódicos involucrados en la producción de granos a nivel de cultivo y a nivel de nudo, en un genotipo comercial de soja. A su vez, se incluyeron tratamientos de sombreo (distintos niveles de radiación incidente) para discriminar cuáles de dichos mecanismos fotoperiódicos están mediados por cambios en la oferta de radiación (indirectos) y cuáles son efectos del fotoperíodo per se (directos). Además, se realizaron otros dos experimentos utilizando líneas casiisogénicas y genotipos comerciales con distinta sensibilidad fotoperiódica para analizar la variabilidad genotípica para los mecanismos fotoperiódicos involucrados en la producción de granos. La extensión del fotoperíodo aumentó la producción de granos a nivel de cultivo a través de cambios en la oferta de recursos (efectos indirectos). Sin embargo, también se observaron efectos directos del fotoperíodo sobre la producción de granos mediante la modificación de la producción de nudos. La extensión del fotoperíodo distribuyó espacialmente los destinos, lo cual permitiría hacer un uso más eficiente de los recursos al reducir la nterferencia entre vainas que crecen en un mismo nudo. Asimismo, se encontró variabilidad genotípica para este mecanismo fotoperiódico directo. A nivel de nudo, la extensión del fotoperíodo retrasó el inicio de la elongación de vainas dominantes y permitió que se extendiese la floración, abriesen más flores y estableciesen más vainas en posiciones normalmente dominadas del nudo. Este efecto fotoperiódico también distendió la interferencia entre vainas que crecen en un mismo nudo a través cambios en la distribución temporal de los destinos. Sin embargo, no se encontró variabilidad genotípica para este mecanismo fotoperiódico bajo condiciones de fotoperíodo natural. Los resultados obtenidos revelan mecanismos asociados a la producción de granos en soja frente a cambios en el fotoperíodo en post-floración que son independientes del aumento de la oferta de recursos. Dichos mecanismos involucran efectos fotoperiódicos directos sobre las relaciones intra-nodales entre vainas, mediados por el efecto del fotoperíodo sobre la producción de nudos y la tasa de desarrollo de las vainas.

Fil:Hermitte, Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Santa Cruz, Ana Rosa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En esta Tesis se abordó el estudio de los mecanismos bioquímicos involucrados en la interacción entre algunas bacterias promotoras del crecimiento y dos plantas de interés agronómico, arroz (Oryza sativa) y tomate (Solanum lycopersicum). La bacteria Azospirillum brasilense promovió el crecimiento de plantas de arroz, especialmente de su sistema radicular; la inoculación indujo un aumento en la producción de etileno en la planta y en la actividad y expresión de la ácido 1-amino-ciclopropano-1- carboxílico sintasa (ACS). Se observó también un aumento en la actividad de quinasa de proteínas dependiente de Ca⁺² cuyas características bioquímicas indican que se trata de una CDPK que estaría relacionada con el crecimiento de las raíces laterales. La inoculación con A. brasilense promovió el crecimiento de plantas de tomate, aumentó los niveles de ácido indol acético (AIA) y etileno y la actividad y expresión de ACS. El suplemento exógeno de etileno y el uso de un inhibidor de su percepción permiten asignar a modo de hipótesis un rol intermediario del etileno en la promoción del crecimiento del sistema radicular en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. El análisis global del perfil de expresión génica asociado a la inoculación de plantas de tomate con A. brasilense indicó que la inoculación estimuló la expresión de una variedad de genes, muchos de los cuales se inducen por etileno y que se han encontrado sobre expresados en otras especies en respuesta a la infección con patógenos o afectadas por agentes generadores de estrés. Los niveles de expresión de los genes implicados en el establecimiento de la respuesta hipersensible aparecen sub expresados lo cual podría favorecer el establecimiento de la interacción endofítica entre A. brasilense y tomate. Utilizando la técnica de 2D-DIGE se comenzó el análisis de los perfiles de proteínas expresadas en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. Con esta técnica se logró evidenciar diferencias en los patrones de expresión que dependen del tratamiento al que se sometió a las plantas.

Diversas evidencias experimentales demostraron que el desarrollo de insulinorresistencia (IR) se acompaña de cambios en la actividad del eje hipotálamo-hipófiso_adrenal (HHA) que se traducen en variaciones en los niveles sanguíneos de glucocorticoides (GC), tanto en pacientes como en modelos animales de la enfermedad. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos un aumento en los niveles de GC en animales tratados con una dieta rica en sacarosa (DRS) durante 7 semanas que se asoció con una respuesta adrenal disminuida en la prueba de estimulación con la hormona adrenocorticotropina (ACTH). Dado que la principal hormona reguladora de la secreción de GC es la ACTH, el objetivo central de este trabajo de tesis consistió en evaluar los efectos de la administración de DRS sobre la producción de ATCH en distintos estadios del dearrollo de IR y estudiar los mecanismos subyacentes a las alteraciones encontradas a nivel adenohipofisario. En ese marco, evaluamos los efectos del tratamiento antioxidante sobre cambios tempranos inducidos por el consumo de DRS y del ejercicio moderado como medida preventiva de los efectos de la exposición prolongada a la dieta. Los resultados obtenidos indicaron que en el modelo animal de IR por la administración de DRS, los animales presentaron cambios en la secreción de ACTH y corticosterona. En etapas tempranas del tratamiento (3 semanas) encontramos un aumento en la actividad del eje HHA, que fue previa a la detección de cambios en la insulinosensibilidad sistémica (evidente a partir de la séptima semana del inicio del consumo de DRS). Sin embargo, en animales tratados por períodos más prolongados (15 semanas) observamos una disminución de los niveles circulantes de ACTH y de corticosterona. Postulamos que la hiperactivación temprana del eje podría estar asociada con la generación de estrés oxidativo a nivel adenohipofisario, dado que el tratamiento antioxidante sistémico previno tanto el aumento de marcadores de este proceso como la hipersecreción de ACTH. La disminución en la actividad del eje HHA detectada en etapas más tardías del tratamiento podría ser consecuencia de la exposición crónica del tejido hipofisario al estrés oxidativo, inducido por concentraciones elevadas de ácidos grasos no esterificados (AGNE) circulantes, un efecto que podría ser medido por la inducción de autofagia. Demostramos que el ejercicio moderado previno la inducción de estos procesos y la inhibición de la secreción de ACTH en animales alimentados con DRS durante 15 semanas, además de evitar el incremento de AGNE. Finalmente, estudiamos con mayor profundidad estos procesos en células adenohipofisarias en cultivo evaluando el efecto de la incubación de células de la línea ArR-20 con ácido palmítico (C16:O) y con inductores de estrés oxidativo y autofagia. En suma, nuestros resultados indican que la administración de una DRS produce un incremento temprano en la expresión de Pomc y ACTH posiblemente mediada por la generación de estrés oxidativo tisular. Una exposición prolongada del tejido a niveles incrementados de nutrientes, como los ácidos grasos, adicionalmente induce el proceso autofágico, lo que lleva a una hipofunción de la glándula. Los GC afectan el metabolismo estimulando la movilización de las reservas energéticas. Sin embargo, un aumento sostenido de los niveles de estas hormonas podría contribuir al agravamiento de las características metabólicas del síndrome de IR, y precipitar la aparición de las complicaciones a largo plazo relacionadas con la enfermedad. En nuestro modelo, el estado de IR crónico se correlacionó con una inhibición de la actividad basal del eje HHA, lo que contribuiría al restablecimiento de la homeostasis metabólica. Sin embargo, también podría dar lugar a complicaciones adicionales, como la insuficiencia adrenal, afectando la respuesta del organismo frente a situaciones de estrés, lo que representaría otro factor de riesgo para los pacientes con IR.

Objetivos de la tesis: 1. Determinar si el tratamiento agudo con dosis arritmogénicas de digitálicos es capaz de promover la activación de CaMKII y evaluar si la actividad de esta quinasa es mediadora de alteraciones arritmogénicas en el manejo del Ca++ durante dicho tratamiento. 2. Determinar la importancia que la actividad de CaMKII pueda tener en el desarrollo de una respuesta inotrópica positiva durante el tratamiento con glucósidos cardiotónicos. 3. Evaluar la importancia que pueda tener la activación de CaMKII en la génesis de arritmias en un modelo de intoxicación digitálica In Vivo. 4. Discriminar el rol que pueda cumplir la fosforilación de los RyR2 y de Fosfolamban en modelos celulares de intoxicación digitálica. 5. A partir de los resultados obtenidos, evaluar posibles estrategias antiarrítmicas basadas en la inhibición de la actividad de CaMKII o en la intervención sobre el mecanismo arritmogénico desencadenado por los digitálicos.

En la presente Tesis hemos utilizado un modelo experimental de hipoxia aguda normobárica en embriones de aves, con el objetivo de elucidar las vías moleculares y eventos de señalización celular que forman parte de los mecanismos de injuria y neuroprotección ante un daño hipóxico en el SNC en desarrollo. Los resultados obtenidos han demostrado que la hipoxia induce un incremento en los marcadores de stress oxidativo y activa la vía apoptótica intrínseca. La muerte apoptótica se encuentra precedida por una inducción de óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS), daños ultraestructurales e inhibición del complejo I mitocondriales – ambos cambios dependientes de óxido nítrico. En segundo lugar, se ha establecido que el precondicionamiento con un estímulo hipóxico de baja intensidad, confiere tolerancia parcial a una injuria hipóxica más severa 24 h después. Mediante la administración de moduladores de las HIF-prolil hidroxilasas, demostramos que la acumulación de HIF-1 durante el precondicionamiento es necesaria para que se manifieste la tolerancia a una injuria hipóxica posterior. Por último, observamos que la administración de inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS y el precondicionamiento hipóxico, aplicados en forma conjunta, tuvieron un efecto aditivo, logrando una neuroprotección completa. Los resultados obtenidos sugieren que los efectos neuroprotectores de los inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS en nuestro modelo se deben a efectos independientes de la acción de NO sobre la vía de HIF-1.

En el aprendizaje asociativo, la reactivación de la memoria por la presentación de un recordatorio puede inducir dos procesos mnésicos aparentemente opuestos, la reconsolidación o la extinción. En esta Tesis describimos un switch molecular entre mecanismos de transcripción que se inducen diferencialmente en el hipocampo en la determinación de dichos procesos. Encontramos que NF-kB es necesario para la reconsolidación, mientras que para la extinción su activación se ve restringida por la fosfatasa calcineurina. El factor de transcripción NFAT es activado a su vez por calcineurina durante la extinción, y es necesario para que este proceso tenga lugar. Por el contrario, NFAT parecería no tener ningún rol en la reconsolidación. La actividad de calcineurina también es necesaria para que se lleve a cabo el proceso de extinción. Esta fosfatasa jugaría entonces un doble papel: 1) induciendo la activación y translocación de NFAT desde el citoplasma hacia el núcleo, 2) bloqueando a la vez la activación de NF- kB. Asimismo, nuestros resultados en el estudio de la consolidación sugieren fuertemente que calcineurina actúa como limitante negativo en la formación de memorias, y su mecanismo de acción involucra la regulación del estado de activación de NF-kB. Profundizamos entonces el modelo en el que quinasas y fosfatasas dependientes de calcio controlan activamente el procesamiento neuronal, mediante un equilibrio finamente regulado en el que se oponen entre sí. Por último, estudiamos el rol de NF-kB en plasticidad estructural relacionada a procesos de memoria, y resultados preliminares nos indican que el mismo tendría un rol clave en el aumento de densidad de espinas asociado al aprendizaje.

El transporte intracelular de proteínas es una actividad esencial para las células eucariotas. La vía secretora ejecuta el transporte de proteínas hacia el exterior celular y participa en el transporte de proteínas y lípidos entre los diferentes compartimentos de membrana que integran la vía. La coordinación de las distintas etapas de transporte entre los compartimentos intracelulares es necesaria para permitir el flujo de membranas y mantener el tamaño de las organelas y la homeostasis celular.Las proteínas que son transportadas a través de la vía secretora son traslocadas al Retículo Endoplásmico (RE) y, posteriormente, son reclutadas a regiones especializadas del mismo, denominadas sitios de salida del RE (ERES - ?ER Exite Sites?). En estos sitios, el complejo proteico de cubierta tipo II (COPII) es el responsable de concentrar y seleccionar el material a ser exportado, y también participa en la deformación de la membrana necesaria para la generación de intermediarios de transporte. Luego, en la interfase de los ERES y el compartimiento intermedio entre RE y Golgi (ERGIC o VTCs) se produce el intercambio de COPII por el complejo de cubierta tipo I (COPI), que permite el transporte hacia el complejo de Golgi (anterógrado) o de vuelta al RE (retrógrado). La GTPasa Rab1 es primordial para el transporte anterógrado de proteínas y lípidos desde el Retículo Endoplásmico (RE) al complejo de Golgi, donde interacciona con múltiples efectores que integran la vía secretora. Rab1b participa en el reclutamiento del complejo COPI y la consiguiente maduración de los VTCs. En este trabajo se demostró que Rab1b interacciona con los componentes de COPII Sec23, Sec24 y Sec31, y que la inhibición de Rab1b modifica el fenotipo de COPII. Además, se observó que Rab1b modula la dinámica de asociación/disociación de COPII a membranas en la interfase de los ERES. Nuestros resultados sugieren que Rab1b es un regulador clave de la función y dinámica de asociación/disociación de COPII.Las vías de transporte intracelular de membranas son ubicuas, pero están diferencialmente desarrolladas en los diversos tejidos dependiendo de su función. Los órganos secretores deben adaptarse a la necesidad creciente de secreción de proteínas que ocurre durante el desarrollo, diferenciación, o cambio de las condiciones fisiológicas. Si bien la maquinaria de transporte que participa en la vía secretora ha sido ampliamente descripta, poco se conoce sobre la regulación de la capacidad secretora en células especializadas. Empleando como modelo secretor y respondedor a un estímulo específico la línea celular derivada de tiroides de rata Fischer, FRTL-5, se demostró que el estímulo con TSH promueve el incremento de los niveles de factores de transporte y del volumen del Golgi. Estos cambios ocurren de manera simultánea con la producción de proteínas importantes en la función tiroidea (cargo), sugiriendo que el incremento resultante en la maquinaria de transporte no es consecuencia del incremento de cargo. Además, se encontró que gran cantidad de factores de transporte poseen en su región regulatoria un motivo altamente enriquecido, el cual presenta alta homología con la secuencia descripta para el elemento respondedor a AMPc (CRE). Concordantemente, los cambios observados en los factores de transporte son mediados por la vía de la adenilato ciclasa/AMPc. Finalmente se observó que TSH induce la activación y el incremento de los niveles del factor de transcripción CREB3L1, quien promueve el incremento del volumen del complejo de Golgi, incluso en células no estimuladas. En conjunto estos datos indican que, se desencadena una respuesta celular global que le permite a la célula adaptarse al incremento de cargo, sugiriendo que vías de señalamiento comunes modulan la producción de genes específicos de tiroides y de la maquinaria de transporte.