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El transporte intracelular de proteínas es una actividad esencial para las células eucariotas. La vía secretora ejecuta el transporte de proteínas hacia el exterior celular y participa en el transporte de proteínas y lípidos entre los diferentes compartimentos de membrana que integran la vía. La coordinación de las distintas etapas de transporte entre los compartimentos intracelulares es necesaria para permitir el flujo de membranas y mantener el tamaño de las organelas y la homeostasis celular.Las proteínas que son transportadas a través de la vía secretora son traslocadas al Retículo Endoplásmico (RE) y, posteriormente, son reclutadas a regiones especializadas del mismo, denominadas sitios de salida del RE (ERES - ?ER Exite Sites?). En estos sitios, el complejo proteico de cubierta tipo II (COPII) es el responsable de concentrar y seleccionar el material a ser exportado, y también participa en la deformación de la membrana necesaria para la generación de intermediarios de transporte. Luego, en la interfase de los ERES y el compartimiento intermedio entre RE y Golgi (ERGIC o VTCs) se produce el intercambio de COPII por el complejo de cubierta tipo I (COPI), que permite el transporte hacia el complejo de Golgi (anterógrado) o de vuelta al RE (retrógrado). La GTPasa Rab1 es primordial para el transporte anterógrado de proteínas y lípidos desde el Retículo Endoplásmico (RE) al complejo de Golgi, donde interacciona con múltiples efectores que integran la vía secretora. Rab1b participa en el reclutamiento del complejo COPI y la consiguiente maduración de los VTCs. En este trabajo se demostró que Rab1b interacciona con los componentes de COPII Sec23, Sec24 y Sec31, y que la inhibición de Rab1b modifica el fenotipo de COPII. Además, se observó que Rab1b modula la dinámica de asociación/disociación de COPII a membranas en la interfase de los ERES. Nuestros resultados sugieren que Rab1b es un regulador clave de la función y dinámica de asociación/disociación de COPII.Las vías de transporte intracelular de membranas son ubicuas, pero están diferencialmente desarrolladas en los diversos tejidos dependiendo de su función. Los órganos secretores deben adaptarse a la necesidad creciente de secreción de proteínas que ocurre durante el desarrollo, diferenciación, o cambio de las condiciones fisiológicas. Si bien la maquinaria de transporte que participa en la vía secretora ha sido ampliamente descripta, poco se conoce sobre la regulación de la capacidad secretora en células especializadas. Empleando como modelo secretor y respondedor a un estímulo específico la línea celular derivada de tiroides de rata Fischer, FRTL-5, se demostró que el estímulo con TSH promueve el incremento de los niveles de factores de transporte y del volumen del Golgi. Estos cambios ocurren de manera simultánea con la producción de proteínas importantes en la función tiroidea (cargo), sugiriendo que el incremento resultante en la maquinaria de transporte no es consecuencia del incremento de cargo. Además, se encontró que gran cantidad de factores de transporte poseen en su región regulatoria un motivo altamente enriquecido, el cual presenta alta homología con la secuencia descripta para el elemento respondedor a AMPc (CRE). Concordantemente, los cambios observados en los factores de transporte son mediados por la vía de la adenilato ciclasa/AMPc. Finalmente se observó que TSH induce la activación y el incremento de los niveles del factor de transcripción CREB3L1, quien promueve el incremento del volumen del complejo de Golgi, incluso en células no estimuladas. En conjunto estos datos indican que, se desencadena una respuesta celular global que le permite a la célula adaptarse al incremento de cargo, sugiriendo que vías de señalamiento comunes modulan la producción de genes específicos de tiroides y de la maquinaria de transporte.

El estudio de la conciencia y la arquitectura cognitiva subyacente a este fenómeno es motivo de amplia discusión y debate dentro de la neurociencia en las últimas décadas, gracias a los avances logrados sobre todo en el campo del procesamiento visual. El trabajo desarrollado en esta tesis se encuentra enmarcado dentro del estudio de los aspectos cognitivos y neurofisiológicos de procesos que involucran tareas de decisión perceptual, en particular, el acceso de la información sensorial a procesos cognitivos posteriores tales como la memoria de trabajo, la conciencia y el reporte subjetivo. Hemos desarrollado y profundizado el estudio de un paradigma de reporte parcial asociado a una respuesta subjetiva y analizado la relación existente entre la respuesta objetiva y la respuesta subjetiva. A partir de las propiedades temporales y espaciales encontradas y del análisis de los errores, observamos un efecto de aprendizaje perceptual en el acceso a la memoria icónica, una restricción atencional al acceso y mantenimiento de la información en memoria icónica, y un decaimiento de la información geométrica similar a la dinámica de la misma. Adicionalmente, encontramos una respuesta subjetiva robusta y bajo ciertas condiciones desacoplada de la respuesta objetiva. A su vez, gracias a la evidencia acumulada en los trabajos precedentes, evaluamos los correlatos neurofisiológicos del reporte subjetivo, independientemente de la respuesta objetiva, mediante la utilización de electroencefalografía de alta densidad (EEG), y alteraciones en el flujo de información en pacientes con lesiones frontales y pacientes con Trastorno Bipolar. Encontramos marcadas evidencias respecto a la participación de áreas pre-frontales, de la corteza cingulada y la corteza parietal en la generación del reporte subjetivo, en favor de un modelo global de acceso a conciencia que involucra la participación e integración de la información de áreas sensoriales por parte de regiones de la corteza pre-frontal y del cingulado anterior. Encontramos también evidencia de un proceso de acumulación involucrado en la generación de la confianza subjetiva. Desarrollamos en paralelo un paradigma de decisión perceptual con respuesta continua en donde logramos seguir en tiempo real el acceso de la información sensorial a la toma de decisiones, dividiendo este evento en secuencias discretas cuya duración y número covarían con la dificultad de la tarea. En este sentido, creemos que los resultados obtenidos en esta Tesis son un avance en el entendimiento de la dinámica de los procesos cognitivos, el acceso conciente y la generación de estados mentales subjetivos.

El crecimiento y el desarrollo de las plantas se encuentran fuertemente influenciados por el ambiente luminoso que las rodea. Las señales de sombreado por plantas vecinas desencadenan respuestas como el aumento del crecimiento del tallo. CONSTITTUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) es una E3 ligasa involucrada en la ubiquitinización de proteínas dirigidas a degradación. En plántulas crecidas en oscuridad, COP1 se acumula en el núcleo y la exposición a la luz causa la migración de COP1 al citosol. Si bien COP1 es también necesario para que se produzca la respuesta de crecimiento a las señales de sombra, sus mecanismos de acción en esta condición no han sido dilucidados. Los resultados expuestos en este trabajo muestran que COP1 se acumula en el núcleo en sombra natural y sombra simulada, sugiriendo un rol activo en la señalización de la sombra. Las proteínas PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR (PIF) son factores de transcripción centrales en la regulación de la señalización de la sombra y la promoción del crecimiento del tallo a través de las auxinas. Estudiamos la posible convergencia de la vía de señalización de los PIF con COP1 mediante el análisis del transcriptoma, los niveles de auxinas y distintas respuestas fisiológicas. Las proteínas HY5 y HFR1 son blancos moleculares de COP1 antes que las plántulas sean expuestas a la luz por primera vez. Ambos regulan negativamente la actividad de los PIF mediante diferentes mecanismos. Los resultados presentados demostraron que COP1 regula negativamente los niveles de HFR1, pero no de HY5, en condiciones de sombra, por lo que proponemos que este sería un punto convergencia entre ambas vías de señalización. Finalmente, mostramos que COP1 también regularía negativamente los niveles de proteínas DELLA, que son claves en la señalización de giberelinas e inhiben la acción de los PIF formando heterodímeros.

Durante mucho tiempo la Eritropoyetina (Epo) fue conocida únicamente por su acción sobre el sistema hematopoyético. Más recientemente, investigaciones desarrolladas para comprender los mecanismos básicos de sus efectos biológicos han revelado un efecto pleiotrópico de Epo que se extiende más allá de la regulación eritropoyética. En este sentido, su capacidad citoprotectora sugiere un posible uso terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, además de su administración a pacientes anémicos. Por otro lado, la actividad de Epo sobre progenitores eritroides de médula ósea ha sido asociada a una mayor incidencia de eventos trombóticos e hipertensión en pacientes, lo cual ha dado origen a la búsqueda de compuestos derivados incapaces de estimular la eritropoyesis que conserven su actividad citoprotectora. Uno de estos compuestos es la eritropoyetina modificada por carbamilación (cEpo), cuyos efectos sobre el endotelio no han sido estudiados en profundidad hasta el momento. Con el fin de optimizar el uso clínico de Epo se requiere de un mayor conocimiento para aclarar la compleja interrelación de las acciones hematopoyética y no-hematopoyética de esta citoquina sobre distintos tejidos. En base a esto, uno de los objetivos de este trabajo de Tesis Doctoral es aportar nuevos datos sobre los efectos y mecanismos de acción de Epo sobre el endotelio, con particular interés en la angiogénesis, al mismo tiempo que se busca dilucidar si la carbamilación de la molécula de Epo introduce algún cambio en su actividad biológica sobre células endoteliales. Mediante técnicas de migración por wound healing, formación de túbulos de células endoteliales sobre un sustrato símil matriz extracelular y análisis del ciclo celular, realizados sobre la línea celular endotelial humana EA.hy926, determinamos un efecto inductor de Epo sobre la función angiogénica, que no fue observado con cEpo. En cuanto a los mecanismos de acción involucrados, hemos descrito la participación del receptor EpoR2 y de la quinasa JAK2, asociados a la acción eritropoyética de Epo, en su efecto inductor de la migración en células endoteliales. Si bien cEpo fue capaz de activar las vías de señalización asociadas a Epo, su ausencia de efecto promigratorio estaría relacionada con un cierre prematuro de su señal, mediado por la fosfatasa PTP1B. Este mecanismo de acción diferencial entre ambas eritropoyetinas fue reportado en trabajos anteriores de nuestro grupo realizados en células eritroides. Por otro lado, nuestros resultados muestran un efecto dual de Epo sobre la generación de especies reactivas de oxígeno, siendo capaz de prevenirla a tiempos largos de exposición, al igual que cEpo, pero también estimulándola en forma transiente, lo cual constituiría un mecanismo promigratorio. La enzima óxido nítrico sintasa también estaría relacionada con la acción de Epo sobre la migración de células EA.hy926. La relación entre calcio y eritropoyetina, descrita anteriormente en la diferenciación eritroide, también es importante en la migración de células endoteliales, como lo confirman ensayos realizados con quelantes de este catión. Mediante experimentos realizados con inhibidores farmacológicos de canales de calcio dependientes de voltaje se determinó la participación de los mismos en el influjo de este catión estimulado por Epo, lo que constituye una evidencia a favor de la expresión de estos canales en células endoteliales. El estudio de estos canales nos permitió, además, conocer la actividad antiangiogénica de la amlodipina, un antagonista de calcio de uso clínico como antihipertensivo. Por otra parte, también se determinó la importancia de canales de calcio TRPC y canales de potasio en la respuesta migratoria a Epo. El calcio fue también un intermediario en el efecto inductor de Epo sobre la expresión de acuaporina-1, cuya función como proteína canal de agua hemos visto por primera vez asociada a la migración estimulada por Epo. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis muestran un efecto diferencial de eritropoyetina y su derivado carbamilado sobre la angiogénesis, mediante mecanismos similares a los observados en células eritroides, y aportan información sobre los diferentes intermediarios y efectores de Epo en su modulación de la actividad angiogénica. La incapacidad de cEpo de activar procesos relacionados a la migración celular genera interés en su posible aplicación terapéutica, ya que podría ejercer citoprotección sin estimular la angiogénesis ni la eritropoyesis en pacientes donde estos procesos pueden representar un efecto indeseado.

Durante mucho tiempo la Eritropoyetina (Epo) fue conocida únicamente por su acción sobre el sistema hematopoyético. Más recientemente, investigaciones desarrolladas para comprender los mecanismos básicos de sus efectos biológicos han revelado un efecto pleiotrópico de Epo que se extiende más allá de la regulación eritropoyética. En este sentido, su capacidad citoprotectora sugiere un posible uso terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, además de su administración a pacientes anémicos. Por otro lado, la actividad de Epo sobre progenitores eritroides de médula ósea ha sido asociada a una mayor incidencia de eventos trombóticos e hipertensión en pacientes, lo cual ha dado origen a la búsqueda de compuestos derivados incapaces de estimular la eritropoyesis que conserven su actividad citoprotectora. Uno de estos compuestos es la eritropoyetina modificada por carbamilación (cEpo), cuyos efectos sobre el endotelio no han sido estudiados en profundidad hasta el momento. Con el fin de optimizar el uso clínico de Epo se requiere de un mayor conocimiento para aclarar la compleja interrelación de las acciones hematopoyética y no-hematopoyética de esta citoquina sobre distintos tejidos. En base a esto, uno de los objetivos de este trabajo de Tesis Doctoral es aportar nuevos datos sobre los efectos y mecanismos de acción de Epo sobre el endotelio, con particular interés en la angiogénesis, al mismo tiempo que se busca dilucidar si la carbamilación de la molécula de Epo introduce algún cambio en su actividad biológica sobre células endoteliales. Mediante técnicas de migración por wound healing, formación de túbulos de células endoteliales sobre un sustrato símil matriz extracelular y análisis del ciclo celular, realizados sobre la línea celular endotelial humana EA.hy926, determinamos un efecto inductor de Epo sobre la función angiogénica, que no fue observado con cEpo. En cuanto a los mecanismos de acción involucrados, hemos descrito la participación del receptor EpoR2 y de la quinasa JAK2, asociados a la acción eritropoyética de Epo, en su efecto inductor de la migración en células endoteliales. Si bien cEpo fue capaz de activar las vías de señalización asociadas a Epo, su ausencia de efecto promigratorio estaría relacionada con un cierre prematuro de su señal, mediado por la fosfatasa PTP1B. Este mecanismo de acción diferencial entre ambas eritropoyetinas fue reportado en trabajos anteriores de nuestro grupo realizados en células eritroides. Por otro lado, nuestros resultados muestran un efecto dual de Epo sobre la generación de especies reactivas de oxígeno, siendo capaz de prevenirla a tiempos largos de exposición, al igual que cEpo, pero también estimulándola en forma transiente, lo cual constituiría un mecanismo promigratorio. La enzima óxido nítrico sintasa también estaría relacionada con la acción de Epo sobre la migración de células EA.hy926. La relación entre calcio y eritropoyetina, descrita anteriormente en la diferenciación eritroide, también es importante en la migración de células endoteliales, como lo confirman ensayos realizados con quelantes de este catión. Mediante experimentos realizados con inhibidores farmacológicos de canales de calcio dependientes de voltaje se determinó la participación de los mismos en el influjo de este catión estimulado por Epo, lo que constituye una evidencia a favor de la expresión de estos canales en células endoteliales. El estudio de estos canales nos permitió, además, conocer la actividad antiangiogénica de la amlodipina, un antagonista de calcio de uso clínico como antihipertensivo. Por otra parte, también se determinó la importancia de canales de calcio TRPC y canales de potasio en la respuesta migratoria a Epo. El calcio fue también un intermediario en el efecto inductor de Epo sobre la expresión de acuaporina-1, cuya función como proteína canal de agua hemos visto por primera vez asociada a la migración estimulada por Epo. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis muestran un efecto diferencial de eritropoyetina y su derivado carbamilado sobre la angiogénesis, mediante mecanismos similares a los observados en células eritroides, y aportan información sobre los diferentes intermediarios y efectores de Epo en su modulación de la actividad angiogénica. La incapacidad de cEpo de activar procesos relacionados a la migración celular genera interés en su posible aplicación terapéutica, ya que podría ejercer citoprotección sin estimular la angiogénesis ni la eritropoyesis en pacientes donde estos procesos pueden representar un efecto indeseado.

En el presente trabajo se evaluó la capacidad antiproliferativa, anticolesterogénica y los efectos sobre el metabolismo lipídico de dos isoprenoides de 10 carbonos, linalool (monoterpeno alcohol lineal) y 1,8-cineole (monoterpeno cíclico con grupo éter), sobre células HepG2 (procedentes de un hepatocarcinoma humano) como modelo de célula hepática y A549 (provenientes de adenocarcinoma de pulmón humano) como tipo celular extra-hepático. Se analizaron los mecanismos de acción involucrados y los efectos del tratamiento combinado de ambos monoterpenos entre sí o de cada monoterpeno con simvastatina (una estatina modelo) evaluando los posibles efectos sinérgicos de cada interacción. La actividad de los isoprenoides naturales sobre la colesterogénesis y proliferación celular se concentra en la vía del mevalonato (VM), una vía metabólica muy compleja indispensable para la homeostasis celular. Esto se debe a que la VM no solo es la vía de síntesis del colesterol, sino que además provee intermediarios fundamentales para la prenilación de proteínas de la superfamilia Ras, proteínas reguladoras de la proliferación y supervivencia celular. Durante el desarrollo de este trabajo se determinó la viabilidad y proliferación celular por los métodos de MTT, rojo neutro y recuento celular. En todos los casos, tanto los monoterpenos como la simvastatina inhibieron la proliferación celular, mientras que las combinaciones de a pares entre monoterpenos y cada uno de ellos con simvastatina mostraron un efecto sinérgico en dicha inhibición. Se estudió la distribución de las poblaciones en el ciclo celular, apoptosis por diferentes metodologías y la localización subcelular de Ras, a diferentes concentraciones. Tanto linalool como 1,8-cineole arrestaron el ciclo celular, principalmente en G0/G1 mientras que linalool también indujo apoptosis en células HepG2. Al combinar los compuestos se observó en gran parte de los casos una interacción sinérgica sobre la inducción de apoptosis. Linalool disminuyó los niveles de Ras en membrana plasmática y los aumentó en citosol, mientras que al combinase con simvastatina, la inhibición de la traslocación a membrana fue levemente potenciada. A través de experimentos de incorporación de 14C-acetato en lípidos en condiciones donde la proliferación no se encuentra afectada, se demostró que linalool y 1,8-cineole inhibieron la VM, probablemente a diferentes niveles. Esto resultó en una reducción de la colesterogénesis y una acumulación de intermediarios y/u otros productos finales de la vía. Las concentraciones efectivas en la inhibición de la síntesis de colesterol fueron considerablemente inferiores a las necesarias para ejercer efecto antiproliferativo, sobre todo para 1,8-cineole. En ciertos casos, los tratamientos aumentaron la incorporación de colesterol exógeno. Ambos monoterpenos afectaron la incorporación de acetato en lípidos neutros, fosfolípidos y ácidos grasos, cada uno de manera diferente. La combinación de ambos isoprenoides entre sí, o de cada uno con simvastatina, inhibió sinérgicamente la síntesis de colesterol. A bajas concentraciones linalool y 1,8-cineole bloquearon etapas específicas de la colesterogénesis mientras que a concentraciones elevadas provocaron una inhibición de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR), enzima limitante de la velocidad de la VM. El agregado de mevalonato exógeno fue incapaz de revertir la inhibición de la proliferación promovida por ambos compuestos, lo que demuestra que la inhibición de HMGCR por sí sola no es responsable de tal efecto y refuerza la hipótesis de la inhibición a nivel de la prenilación de proteínas como principal mecanismo antiproliferativo. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis contribuyen a un mejor entendimiento de la acción de linalool y 1,8-cineole sobre la VM aportando conocimiento sobre los posibles mecanismos involucrados en su actividad anticolesterogénica y antiproliferativa. También sugieren el potencial uso de estos compuestos como una alternativa natural para ser utilizados en terapias contra cáncer y/o enfermedades cardiovasculares, ya sea solos, combinados entre sí o con estatinas.

La insulina desempeña un papel clave en la regulación de múltiples procesos celulares. La unión de la hormona a su receptor en la superficie celular activa la actividad intínseca de quinasa de tirosinas del mismo, ocasionando la autofosforilación del receptor y la fosforilación de sustratos intracelulares denominados IRSs. Los IRSs actúan como moléculas adaptadoras en la transducción de señales, reclutando a una gran variedad de proteínas que contienen dominios de homología Src (SH2), entre ellas: la subunidad regulatoria (p85) de la PI3K a la “growth factor receptor binding protein 2”(Grb2). Este evento conduce a la activación de las cascadas de la PI3K y de Ras/MAPK, respectivamente. En el presente trabajo hemos examinado la acción de la hormona peptídica sobre la expresión del gen de la 5-aminolevulinato sintetasa (ALAS) en hepatocitos de rata y en células de hepatoma humano HepG2. La ALAS es la primera enzima y regulatoria de la biosíntesis del hemo, su nivel es normalmente bajo en el hígado pero se incrementa marcadamente en respuesta a drogas porfirinogénicas como el fenobarbital. El tratamiento con insulina 5nM produjo una notable disminución en los niveles del mRNA de ALAS tanto en condiciones basales como de estimulación con fenobarbital. Este efecto fue dosis dependiente como pudo observarse mediante ensayos de Northern y slot blot. Por otra parte la vida media del mRNA de ALAS no fue modificada por la presencia de la hormona lo que sugiere que la acción ejercida por la insulina sería relevante a nivel transcripcional. Con la finalidad de determinar la actividad transcripcional del promotor, realizamos una construcción (pACAT) que contiene 876 pb de la región 5’ flanqueante del gen de ALAS dirigiendo la expresión de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). En cotransfecciones transientes de células HepG2 observamos una significativa disminución de la actividad CAT cuando se incubaron las células con la hormona. Considerando estos resultados, utilizamos dos metodologías diferentes para caracterizar las vías de transducción de señales involucradas en la represión hormonal de ALAS. En un primer abordaje empleamos agentes químicos, permeables a la membrana plásmatica, que inhiben específicamente a proteínas intermediarias de la señalización de insulina, para evaluar la contribución de estos efectores a la respuesta final. Los inhibidores de la PI3K (wortmanina y LY294002), de la famesilación de Ras (lovastatina y PD152440) y de MEK (PD98059) abolieron la acción de la insulina, mientras que el inhibidor de mTOR/p70RSK (raparnicina) no tuvo efecto alguno sobre la represión hormonal. Por otra parte, analizamos el efecto de la sobrexpresión de formas dominantes negativas o constitutivamente activas de intermediarios de las vías de Ras/MAPK y de la PI3K para evaluar el papel de estas cascadas en la inhibición transcripcional de ALAS. La cotransfección de células HepG2 con versiones dominantes negativas de SOS, Ras, Raf, MEK y MAPK interfirió la acción de la insulina, mientras que la cotransfección con formas constitutivamente activas de Ras, MEK y p90RSK mimetizó la inhibición hormonal per se, independientemente del estímulo en el receptor. Un comportamiento similar se obtuvo cuando empleamos versiones dominantes negativas de PI3K y PKB o a la PKB miristoilada, respectivamente. Estos resultados nos permiten proponer que la señalización a través de ambas vías es requerida para obtener la totalidad del efecto final. Por último, la regulación hormonal fue mediada por un fragmento de ll7 pb (-469/354) del gen de ALAS, capaz de conferir sensibilidad a insulina cuando fue subclonado río arriba del promotor heterólogo de la quinasa de tímidina (pALIRE). Esta región presenta la secuencia GTTTTG, muy similar al IRE canónico reportado para genes reprimidos por la insulina, que resultó crucial para la inhibición. En EMSAs pudo observarse la formación de complejos por unión a secuencias con alta homología a las de HNF3 y NF1 presentes en esta región. Todos estos hallazgos sugieren que la insulina requiere la acción orquestada de efectores celulares (intermediarios de las cascadas Ras/MAPK/p90RSK y PI3K/PKB) y de factores de transcripción que reconocen secuencias específicas y abre la posibilidad de considerar que miembros de las familias HNF3 y NF1 podrían intervenir en la respuesta.

La exposición a aluminio (Al) afecta la eritropoyesis. Sin embargo, poco se conoce acerca de las características de este efecto, así como de los mecanismos involucrados. En el presente trabajo de investigación se planteó, como primer objetivo, la necesidad de caracterizar la anemia producida por sobrecarga oral crónica con Al. Después de ocho meses de tratamiento, los animales desarrollaron anemia no ferropénica. La disminución de la concentración plasmática de haptoglobina, el aumento de reticulocitos y la presencia de esquistocitos apoyan la naturaleza hemolítica de la anemia desarrollada. A causa del tratamiento, se observó una importante inhibición del desarrollo de CFU-E en ensayos ex vivo de células de médula osea. El otro signo notable fue la aparición de severas alteraciones morfolófgicas en eritrocitos de sangre periférica, lo que sugirió una acción directa del A1 sobre las células eritroides maduras. Esa posibilidad fue corroborada en ensayos in vitro de eritrocitos humanos incubados en presencia del metal, en los cuales el rasgo persistente fue la desaparición de la típica forma bicóncava. El aumento de la degradación de la proteína estructural banda 3, observado junto con la detección de depósitos de A1 en la membrana, apoya no sólo la estrecha relación entre la morfología celular y la estructura y organización de la membrana del eritrocito, sino también una acción directa del metal sobre componentes de la membrana. La disminuida respuesta de las células progenitoras CFU-E a la eritropoyetina (Epo), después de la exposición crónica a Al, motivó la investigación de los efectos del metal sobre mecanismos involucrados en la vía de activación del receptor para Epo (EpoR). La exposición a A1 provocó disminución del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, hallazgo que coincidió con la anulación del efecto antiapoptótico de la Epo sobre células K562. En la línea UT-7, altamente dependiente de Epo, sólo una exposición crónica a Al modificó la respuesta a la 1a hormona. Después de esa exposición, el aumento del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, detectado bajo condiciones de carencia de Epo, sugiere un aumento de la sensibilidad de esta línea celular a1 factor de crecimiento. En conclusión, es evidente que el Al no resulta un elemento inocuo. Actúa sobre el sistema eritropoyético afectando a las células eritroides en distintos estadios de maduración. Los resultados sugieren una acción directa del metal sobre los componentes de la membrana celular de los eritrocitos maduros y un mecanismo de interferencia en distintos caminos de activación de células eritroides inmaduras mediados por la formación del complejo eritmpoyetina-receptor.

La hormona paratiroidea (PTH) es un importante mediador de la remodelación ósea y actúa junto al calcitriol (1α,25(OH)2vitamina D3), como regulador esencial de la homeostasis del calcio y fósforo. El péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) es una poli hormona que tiene un papel importante en el desarrollo del feto y en la homeostasis de tejidos adultos actuando principalmente en forma parácrina. Puede ser expresada y secretada por varios tumores y es responsable de la hipercalcemia humoral maligna, siendo éste un signo de mal pronóstico en las neoplasias malignas. Al momento de comenzar este Trabajo de Tesis había poca información acerca del rol de PTHrP actuando como factor parácrino sobre células derivadas del cáncer colorrectal (CCR). En el presente Trabajo se evidencia que PTHrP es capaz de inducir un aumento en la proliferación celular de dos líneas celulares derivadas de CCR, las células Caco-2 y las células HCT116. Además, este efecto inducido por la hormona está modulado por las cascadas de señalización PKC, Src, Akt, ERK MAPK y β-catenina. Se observó que en las células tumorales intestinales la hormona mediante ERK MAPK desencadena el aumento de la expresión y/o activación por fosforilación de CREB/ATF-1, c-myc y ciclina D1, que son moléculas relevantes en la proliferación celular. Acorde con lo observado in vitro, los experimentos desarrollados en el modelo murino revelan que la administración continua de la hormona en forma intra-tumoral modula la expresión de los marcadores claves en la progresión del CCR ERK, ciclina D1 y CREB/ATF-1. Tanto las células tumorales intestinales normales como aquellas que sobre-expresan PTHrP responden a la acción de las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol, al menos a nivel transcripcional, disminuyendo la expresión de PTHrP. PTHrP no sólo favorece la activación de vías mitogénicas y la proliferación de las células Caco-2 y HCT116 sino que también es capaz de disminuir la sensibilidad de estas células al Irinotecán (que es una droga comúnmente utilizada para la quimioterapia del CCR) mediante las vías de ERK MAPK y β-catenina.Este trabajo aporta información original respecto al rol del análogo tumoral de PTH en células tumorales intestinales y los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta hormonal de estas células tanto in vitro como in vivo. Además, profundiza el conocimiento respecto de los mecanismos moleculares modulados por las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol en células tumorales intestinales. Un aporte de este Trabajo de Tesis es que al elucidar las vías de señalización que regulan los procesos inducidos por PTHrP y que favorecen la proliferación y/o quimiorresistencia, se podrían generar estrategias terapéuticas alternativas en el tratamiento del CCR cuya finalidad es inhibir la expresión de PTHrP o su mecanismo de acción en estas células tumorales.

Hemos analizado los distintos modos de conducción que tienen lugar a través del aislante de puerta en estructuras Metal-Oxido-Semiconductor (MOS). En especial, por sus implicancias en las tecnologías microelectrónicas, se ha puesto énfasis en lo concerniente al dióxido de silicio (SiO2). Dependiendo del rango de voltajes y de espesores de aislante considerados, el SiO2 exhibe diferentes comportamientos que requieren un estudio particularizado. Cuando el óxido es muy delgado (<5-6nm), la corriente de túnel a altas tensiones presenta unas oscilaciones que pueden interpretarse, a partir de la mecánica cuántica, como consecuencia de la reflexión parcial de la función de onda electrónica en la interfaz anódica de la estructura. Nosotros hemos propuesto un modelo semi-empírico que logra captar la forma de las características de conducción en todo el rango de tensiones permitidos y para todos los espesores en los que el fenómeno es observable. Al aplicar un estrés eléctrico, la corriente de túnel a bajas tensiones exhibe un crecimiento anómalo que puede atribuirse a la generación de trampas en el seno del aislante. Este mecanismo de conducción se denomina SILC (stress-induced leakage current). Por otro lado, para óxidos más gruesos (>10nm), es posible detectar un cambio en el estado de carga del aislante a partir del desplazamiento de la curvas características capacidad-tensión y corriente-tensión. Hemos propuesto una sencilla modificación de la expresión que se utiliza habitualmente para la corriente de túnel Fowler-Nordheim, la cual permite dar cuenta de dicho comportamiento. Finalmente, se presenta una ampliación de un modelo de conducción que permite explicar de manera consistente los dos modos de ruptura (SOFT y HARD) que tienen lugar en óxidos ultra-delgados. El modelo se basa en la física de los sistemas conductores mesoscópicos y las propiedades de transmisión de los denominados contactos puntuales cuánticos. Hasta ahora, este es el único modelo analítico disponible que puede explicar numerosos hechos experimentales relacionados con el fenómeno bajo estudio.