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S. marcescens es un patógeno oportunista causante de diversas infecciones nosocomiales. La incidencia de las afecciones originadas por esta bacteria ha incrementado en los últimos años debido a su capacidad de adherirse a superficies abióticas y por presentar resistencia a protocolos estándares de esterilización y desinfección. Asimismo, S. marcescens es capaz secretar varias exoproteínas, que han sido implicadas en la virulencia de este patógeno. Dentro de estos potenciales factores de virulencia, la hemolisina ShlA es el más extensamente descripto. La hemolisina es codificada por el operón shlBA y transportada mediante el sistema de dos compañeros. Cepas mutantes en ShlA mostraron ser menos virulentas en modelos de líneas celulares, C. elegans, D. melanogaster y ratones. Sin embargo, aún no se ha dilucidado cómo estos factores contribuyen a la capacidad adaptativa de la bacteria para sobrevivir a diferentes medios y alternar entre ambientes libres y asociados al hospedador. Resultados anteriores de este laboratorio, permitieron demostrar que Serratia requiere de la expresión flagelar para adherirse a la célula epitelial e induce el proceso de autofagia desde el espacio extracelular, probablemente a través o mediado por la acción de una exoproteína. El patógeno ingresa a la célula hospedadora contenido en una vacuola que rápidamente adquiere marcadores autofagosomales. Una población mayoritaria de las bacterias intracelulares se replica rápidamente y se mantiene estable hasta los 480 min p.i. En este trabajo de tesis, se ha profundizado en el tráfico intracelular que realiza S. marcescens en la célula epitelial y los mecanismos moleculares que utiliza esta bacteria para proliferar en el hospedador. Los ensayos aquí desarrollados demuestran que S. marcescens es capaz de invadir y multiplicarse en distintas células epiteliales y fibroblastos, y de disparar el proceso autofágico en estos tipos celulares. Este patógeno dispara un proceso autofágico no canónico que incluye la participación de Atg5 pero no de PI3K. La actividad PI3K y posiblemente Atg5 serían requeridos en el proceso de internalización en la célula hospedadora. Además, se requiere un ambiente con bajo pH para la acción de uno o más factores bacterianos involucrados en el mecanismo de internalización o los procesos tempranos de la invasión de S. marcescens. Asimismo, se demostró que Serratia evita o retrasa la fusión de las SeCV con los lisosomas, manipulando el tráfico vesicular normal de la célula y evitando su degradación. Adicionalmente, se demostró que la expresión de ShlA es responsable del fenotipo autofágico inducido por S. marcescens desde el espacio extracelular, pero no estaría involucrada en el reclutamiento de LC3 a la SeCV. Además, en una etapa más avanzada de la infección celular ShlA dañaría la membrana de la SeCV y está involucrada en la salida de las bacterias desde la célula eucariota y en la diseminación de S. marcescens al medio extracelular. Este mecanismo de salida no involucra un pasaje a través del citoplasma de la célula invadida y no provoca alteraciones en la integridad de dicha célula. Los resultados expuestos aquí permitieron profundizar en el modelo de infección de S. marcescens en células no fagocíticas y concluir que este patógeno oportunista es capaz de modular el proceso de autofagia celular, encontrando en vesículas con características autofagosomales un nicho apropiado donde replicarse. Además, se identificó a la hemolisina ShlA como el factor responsable de la inducción del proceso de autofagia desde el espacio extracelular y como un factor necesario para mediar la salida de la bacteria de la célula hospedadora. Por otro lado, los resultados obtenidos mediante los ensayos de infección en D. melanogaster, mostraron que éste constituye un excelente modelo de análisis en un organismo hospedador íntegro y permite el rápido y eficiente estudio de potenciales factores de virulencia de Serratia y su mecanismo de acción.

En las últimas décadas se demostró que la producción transitoria de peróxido de hidrógeno (H2O2) constituye un evento muy importante de señalización disparado a través de la activación de receptores de superficie o determinado por el estado metabólico mitocondrial, y que modula el grado de fosforilación de determinadas proteínas. En este contexto, estudios recientes han confirmado la presencia de kinasas en la mitocondria que hemos interpretado como un mecanismo modulatorio en la disponibilidad celular de las kinasas. Las mitocondrias normales poseen la mayor concentración celular de ATP y H2O2 en el estado estacionario y contribuyen naturalmente al grado de fosforilación y oxidación de proteínas, dos modificaciones post-traduccionales centrales en la activación de las kinasas. Sobre estas bases, formulamos la hipótesis que el estado redox produce efectos celulares diferenciales en consonancia con la activación de Akt1 y ERK1/2 en la mitocondria, y que en este compartimiento, el H2O2 determina cambios conformacionales que favorecen la fosforilación y posterior translocación nuclear de las mismas. Los estudios realizados en esta Tesis confirmaron que: 1) en la línea celular NIH/3T3, el H2O2 efectivamente modula la progresión del ciclo celular a través de la oxidación y fosforilación selectiva de Akt1 en mitocondrias; 2) en la línea tumoral LP07, el H2O2 asimismo promueve la oxidación selectiva de ERK1/2 o p38-JNK1/2 y posterior translocación al núcleo con efectos ulteriores en la proliferación celular; y 3) el sistema de tiorredoxinas (Trx) modula el destino celular regulando el nivel de oxidantes en las líneas celulares y provocando una activación selectiva en el eje central de Akt1 en el modelo tumoral analizado in vivo. En la línea NIH/3T3, la modulación por H2O2 involucró la entrada de P-Akt1 Ser473 a las mitocondrias, donde fue fosforilada en Thr308 por PDK1. A concentración celular limitada de H2O2, la fosforilación de Akt1 en Thr308 en mitocondrias fue significativa, determinó su pasaje al núcleo y disparó mecanismos genómicos que favorecieron la proliferación celular. En cambio, a elevadas concentraciones de H2O2, la asociación Akt1-PDK1 fue interrumpida y P-Akt1 Ser473 fue retenida en la mitocondria en detrimento de su translocación nuclear. La actividad disminuida de Akt1 favoreció la liberación de citocromo c al citosol conduciendo a la apoptosis. Los efectos diferenciales en la interacción Akt1-PDK1 dependieron de la oxidación selectiva de la Cys310 de Akt1 a ácido sulfénico y sulfónico. Las respuestas celulares observadas en la línea tumoral LP07 involucraron la activación selectiva de ERK1/2 y la interacción eficiente con MEK1/2 determinada por la oxidación de cisteínas conservadas pertenecientes a dominios redox sensibles. Estas modificaciones post-traduccionales que tuvieron lugar en la mitocondria determinaron el pasaje de la kinasa al núcleo. Considerando que las mitocondrias tumorales son disfuncionales, su incapacidad para incrementar la producción de H2O2 podría interrumpir la oxidación sincronizada de ERK1/2 y la regulación del ciclo celular causando la persistencia del fenotipo proliferante. En el mismo modelo tumoral analizado in vivo, el silenciamiento de Trx1 y 2 fue capaz de revertir el efecto de las condiciones redox proliferativas por una activación diferencial de Akt1. Los resultados obtenidos indicaron que al revertir la baja condición redox proliferante, P-Akt1 Ser473 aumentó en la mitocondria en detrimento de la translocación al núcleo, mientras que en los tumores que exhibieron bajo H2O2, P-Akt1 Ser473 se encontró predominantemente en el núcleo, sugiriendo una marcada modulación en la activación de la kinasa y su posterior translocación al núcleo. En esta Tesis, se demuestra el rol central del H2O2 en la activación y tráfico mitocondrial de Akt1 y ERK1/2 en la progresión del ciclo celular. Se concluye que la localización subcelular de estas kinasas en mitocondrias aporta un nuevo modelo para explicar la regulación de la activación por la oxidación de cisteínas específicas y la fosforilación en los residuos correspondientes. De esta forma, el ciclo intramitocondrial de Akt1 y ERK1/2 constituye un eje central para la modulación redox del destino celular en células normales o tumorales.

Tesis (Doctor en Ciencias Agropecuarias)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2011.

El cilio primario (CP) es una organela inmóvil que protruye del centro de la mayoría de las células eucariotas. Considerado por mucho tiempo una organela de tipo vestigial, recientemente se ha encontrado una relación directa entre su morfología y la patogénesis de numerosas enfermedades ahora conocidas como ciliopatías, entre las que se encuentran la retinitis pigmentosa, las poliquistosis renales autosómica dominante (PQRAD) y recesiva (PQRAR) y el síndrome de Bardet Biedl. La PQRAD en particular es causada mayoritariamente por mutaciones en los genes PKD1 y PKD2, que codifican a las Policistinas 1 y 2 (PC1 y PC2), respectivamente. La PC2 es un canal permeable al Ca2+ de la superfamilia de los TRP, que ha sido extensamente estudiado por nuestro laboratorio. Estudios previos han determinado la importancia de la localización de la PC2 en el CP de las células epiteliales renales, donde cumpliría una función sensorial todavía desconocida. La PC2 está asociada a un aumento del Ca2+ intracelular, lo que no podría ser explicado por su expresión ciliar, sino por su presencia en la membrana plasmática. Sin embargo, al presente, no hay modelos experimentales de expresión endógena de PC2 que permitan estudiar tanto su permeabilidad al Ca2+, así como los mecanismos dependientes del mismo para regular dicha función. Por lo tanto, el objetivo principal de la presente tesis consistió en estudiar los mecanismos por los cuales el Ca2+ regula la función de PC2. Los estudios de esta tesis permitieron demostrar por primera vez la función de la PC2 endógena en la membrana plasmática de las células epiteliales renales, y su regulación por cambios en el Ca2+ extracelular. Demostramos que un aumento del Ca 2+ externo incrementa la conductancia de las células epiteliales renales LLC-PK1 que usamos como modelo experimental, la que es bloqueada por silenciamiento del gen PKD2. En el desarrollo de los estudios del presente trabajo, hemos podido también demostrar por primera vez, la presencia y función reguladora del Receptor Sensor de Calcio (CaSR) sobre el canal PC2, y determinar el papel que tendría la PC2 sobre la longitud ciliar, sugiriendo un mecanismo regulador mediado por Ca2+, cuya desregulación podría ser esencial en el inicio de la PQRAD.Dada la importancia de la PC2 en la regulación de la longitud ciliar se evaluó también el efecto del transporte de Ca2+ por la PC2 en la modulación de la misma. Inhibidores de la PC2 como el Amiloride y el LiCl dieron lugar a un aumento de la longitud ciliar, mientras que el alto Ca2+externo indujo una reducción de la misma. Dada la importancia del conocimiento sobre la posible función sensorial de la actividad del canal PC2 en señalizaciones mediadas por Ca2+, hemos considerado también su función en otros modelos celulares. De amplia importancia odontológica, es la reciente demostración de la presencia de canales tipo TRP, incluida la PC2, en el odontoblasto (Ob), una célula de reconocida función sensorial.Hemos establecido técnicas de enriquecimiento y mantenimiento de odontoblastos murinos en cultivo, y hemos podido determinar la abundante expresión de PC2 en distintos aspectos celulares de los odontoblastos de rata, y la obtención de mediciones electrofisiológicas de los mismos. Nuestros estudios en este campo, si bien preliminares, permitirán determinar la presencia funcional de este canal, y su regulación por Ca2+ en el Ob, lo que abrirá una nueva ventana de exploración sobre la fisiología sensorial del dolor dental, y el papel funcional que tienen los canales de la superfamilia de los TRP, en dicha función.

El mantenimiento de la composición florística óptima, dada por la dominancia de las gramineas C3 perennes sobre las anuales, es altamente relevante en pasturas templado - húmedas. Las decisiones culturales, tales como los arreglos de siembra, las fertilizaciones y las frecuencias de defoliación, son clave para lograrlo. El objetivo de mi tesis fue analizar los mecanismos involucrados en la dinámica de las relaciones de competencia intra e interespecíficas entre los componentes de gramínea C3 perenne y anual/bianual y el efecto de diferentes frecuencias de defoliación y de la fertilización nitrogenada sobre la persistencia y la productividad de la graminea perenne. Se realizaron dos ensayos manipulativos en distintos niveles de organización y escalas temporales. En el primero, se analizaron los mecanismos morfogenéticos y estructurales involucrados en la dinámica de las relaciones de competencia entre Dactylis glomerata L. (pasto ovillo, perenne) y Bromus willdenowii Khunt (cebadilla, anual/bianual), durante el establecimiento temprano. Se establecieron cuatro combinaciones de siembra -solo cebadilla, solo pasto ovillo, y cada especie rodeada por vecinos de la otra - sin y con fertilización nitrogenada invernal. Las variables bajo estudio se registraron en tres cohortes de macollos de la planta objetivo, el principal y los aparecidos 20 y 30 días después de la fertilización. Ambas gramineas rodeadas por anuales fueron restringidas en la ocupación espacial horizontal y subterránea. Las mayores tasas de elongación foliar y la longitud total de láminas verdes y de pseudotallos indicaron una mayor jerarquía de la gramínea anual en captura de luz. Los vecinos anuales causaron disminución de la vida media foliar de los macollos más jóvenes y retrasaron la tasa de aparición de hojas en el macollo principal y en los aparecidos 20 días post-fertilización. Además, disminuyeron los números de hojas expandidas y vivas en los macollos de edad intermedia de las dos especies y redujeron la tasa de aparición de macollos, su densidad por planta y su biomasa radical. En el segundo ensayo las frecuencias de defoliación se definieron por el número de hojas presentes por macollo y por la especie guía. Las altas frecuencias de defoliación afectaron consistente y negativamente a la especie perenne. La desventaja de las defoliaciones frecuentes, habiendo o no fertilizado, se expresó en incrementos del filocrono y disminuciones en las tasas de acumulación de biomasa tanto radical como aerea y en el contenido de hidratos de carbono de reserva durante la implantación de la pastura. Se propone que los cuatro mecanismos principales de regulación del crecimiento y de la habilidad competitiva son la tasa de aparición de hojas, la tasa de elongación foliar, el número de hojas expandidas y la biomasa radical. El conocimiento de la respuesta de dichas variables ante cambios en el ambiente biótico y abiótico permitirá la toma de decisiones culturales y de manejo sobre bases objetivas.

La glicosilación de proteínas es la modificación postraduccional más abundante en las células. La biosíntesis de glicanos, a diferencia de la síntesis de ADN, se lleva a cabo de manera independiente de un templado. Los mecanismos que controlan y resguardan la fidelidad de los glicanos aún son poco conocidos. El objetivo general de esta tesis es contribuir al conocimiento de los mecanismos de regulación de glicosiltransferasas que inician la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc. La glicosilación de tipo O-GalNAc es iniciada por la familia de polipeptidil N-acetilgalactosaminil transferasas (ppGalNAc-Ts) constituída por 20 miembros, los cuales incorporan un residuo de N-acetilgalactosamina sobre residuos serina/treonina (αGalNAc-Ser/Thr) de un polipéptido aceptor. Estas glicosiltransferasas son proteínas de membrana tipo II que presentan en su porción luminal un dominio catalítico y en el extremo carboxilo terminal un dominio tipo lectina con un plegamiento característico de tipo β-trefoil. Uno de los objetivos específicos de esta tesis fue estudiar la influencia de estos dominios tipo lectina en la actividad enzimática de glicosiltransferasas que inician la glicosilación de tipo O-GalNAc. En primer lugar, se demostró que los dominios lectina de ppGalNAc-T3 y T4 (T3lec y T4lec) inhiben la actividad enzimática de las isoformas ppGalNAc-T2 y T3. Este efecto inhibitorio pudo ser corroborado in vivo utilizando la línea celular CHO ldlD. Los resultados mostraron que se trata de una interacción proteína-proteína en donde el dominio lectina de una ppGalNAc-T interacciona con el dominio catalítico de otra isoforma. A su vez, tanto T3lec como la enzima ppGalNAc-T3 (incluyendo el dominio catalítico y lectina) fueron capaces de activar la actividad de C1GalT, enzima que cataliza la incorporación de galactosa sobre αGalNAc-Ser/Thr. Esto pone de manifiesto el rol regulatorio diferencial de los dominios lectina sobre enzimas que catalizan reacciones consecutivas en esta biosíntesis de glicanos.Por otro lado, la acetilación de lisinas está emergiendo como un mecanismo de control postraduccional cada vez más frecuente que puede ocurrir en todos los compartimentos subcelulares. Múltiples glicosiltransferasas residentes en Golgi se han informado como enzimas blanco de la acetilación entre ellas las isoformas ppGalNAc-T2 y T9. Por eso, la segunda parte de esta tesis está abocada a estudiar el efecto de la acetilación de lisinas sobre las propiedades biológicas de las ppGalNAc-Ts. En particular, se focalizó en el efecto de una mutación puntual que simula acetilación en la K626 localizada en un motivo estructural conservado (QKW) del dominio lectina de ppGalNAc-T3. Esta mutación (K626Q) disminuyó la actividad catalítica de la enzima y su capacidad de interacción con glicanos de tipo O-GalNAc. En ensayos de interacción con el glicopéptido (MUC1-αGalNAc) y péptidos derivados de mucinas, la mutante incrementó su unión a los mismos en presencia de glicósidos de GlcNAc.En conclusión, ambos mecanismos de regulación estudiados en la presente tesis muestran al plegamiento β-trefoil de los dominios lectinas de ppGalNAc-Ts como estructura clave para la regulación de la glicosilación de tipo O-GalNAc dadas sus propiedades de interacción con múltiples moléculas.

La glicosilación de proteínas es la modificación postraduccional más abundante en las células. La biosíntesis de glicanos, a diferencia de la síntesis de ADN, se lleva a cabo de manera independiente de un templado. Los mecanismos que controlan y resguardan la fidelidad de los glicanos aún son poco conocidos. El objetivo general de esta tesis es contribuir al conocimiento de los mecanismos de regulación de glicosiltransferasas que inician la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc. La glicosilación de tipo O-GalNAc es iniciada por la familia de polipeptidil N-acetilgalactosaminil transferasas (ppGalNAc-Ts) constituída por 20 miembros, los cuales incorporan un residuo de N-acetilgalactosamina sobre residuos serina/treonina (αGalNAc-Ser/Thr) de un polipéptido aceptor. Estas glicosiltransferasas son proteínas de membrana tipo II que presentan en su porción luminal un dominio catalítico y en el extremo carboxilo terminal un dominio tipo lectina con un plegamiento característico de tipo β-trefoil. Uno de los objetivos específicos de esta tesis fue estudiar la influencia de estos dominios tipo lectina en la actividad enzimática de glicosiltransferasas que inician la glicosilación de tipo O-GalNAc. En primer lugar, se demostró que los dominios lectina de ppGalNAc-T3 y T4 (T3lec y T4lec) inhiben la actividad enzimática de las isoformas ppGalNAc-T2 y T3. Este efecto inhibitorio pudo ser corroborado in vivo utilizando la línea celular CHO ldlD. Los resultados mostraron que se trata de una interacción proteína-proteína en donde el dominio lectina de una ppGalNAc-T interacciona con el dominio catalítico de otra isoforma. A su vez, tanto T3lec como la enzima ppGalNAc-T3 (incluyendo el dominio catalítico y lectina) fueron capaces de activar la actividad de C1GalT, enzima que cataliza la incorporación de galactosa sobre αGalNAc-Ser/Thr. Esto pone de manifiesto el rol regulatorio diferencial de los dominios lectina sobre enzimas que catalizan reacciones consecutivas en esta biosíntesis de glicanos.Por otro lado, la acetilación de lisinas está emergiendo como un mecanismo de control postraduccional cada vez más frecuente que puede ocurrir en todos los compartimentos subcelulares. Múltiples glicosiltransferasas residentes en Golgi se han informado como enzimas blanco de la acetilación entre ellas las isoformas ppGalNAc-T2 y T9. Por eso, la segunda parte de esta tesis está abocada a estudiar el efecto de la acetilación de lisinas sobre las propiedades biológicas de las ppGalNAc-Ts. En particular, se focalizó en el efecto de una mutación puntual que simula acetilación en la K626 localizada en un motivo estructural conservado (QKW) del dominio lectina de ppGalNAc-T3. Esta mutación (K626Q) disminuyó la actividad catalítica de la enzima y su capacidad de interacción con glicanos de tipo O-GalNAc. En ensayos de interacción con el glicopéptido (MUC1-αGalNAc) y péptidos derivados de mucinas, la mutante incrementó su unión a los mismos en presencia de glicósidos de GlcNAc.En conclusión, ambos mecanismos de regulación estudiados en la presente tesis muestran al plegamiento β-trefoil de los dominios lectinas de ppGalNAc-Ts como estructura clave para la regulación de la glicosilación de tipo O-GalNAc dadas sus propiedades de interacción con múltiples moléculas.

La enfermedad de Chagas es causada por el parásito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y afecta alrededor de 10 millones de personas. Aproximadamente un 20 a 30% de los sujetos crónicamente infectados muestran la progresión a miocardiopatía, después de padecer infección asintomática durante un período de años a décadas. La miocardiopatía de la enfermedad de Chagas es la causa más frecuente de miocardiopatía infecciosa en el mundo. Las respuestas inmunes mediadas por células CD8 y células T CD4 son cruciales para el control de esta infección crónica. En el pasado, debido a la escasez de los parásitos en el corazón, prevaleció la hipótesis de que la miocarditis chagásica crónica era atribuible exclusivamente a reacción cruzada autoanticuerpos al tejido cardiaco, y que la presencia del parásito era dispensable para la inflamación y fisiopatogénesis. Esta idea, en combinación con la elevada toxicidad y la falta de estudios controlados sobre la eficacia del tratamiento, exacerbó el escepticismo sobre la conveniencia de un tratamiento antiparasitario durante la infección crónica. Este escepticismo se mantuvo hasta finales de la década de los 90. Por otra parte, las pruebas serológicas convencionales pueden mantenerse positivas durante años o incluso décadas después de tratamiento antiparasitario exitoso y los resultados de un ensayo clínico doble ciego controlado con placebo para determinar la eficacia del tratamiento benznidazol no están disponibles actualmente. En el presente trabajo hemos estudiado los mecanismos inmunoregulatorios presentes en células T de sangre periférica, específicas o no contra T. cruzi y también en el corazón de pacientes humanos infectados con este parásito. Así mismo evaluamos el impacto del tratamiento tripanocida (benznidazol) sobre, la expresión de las moléculas de inmunoregulatorias y sobre los niveles de subpoblaciones de células T (ítems 1, 2 y 3). 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. 2) Evaluación del impacto del tratamiento con benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T en pacientes con infección crónica. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. En los individuos infectados, más del 80% de los linfocitos T específicos contra el parásito productores de IFN-γ, presenta expresión del receptor inhibitorio CTLA-4, pero no de LIR-1. Por el contrario, en los mismos sujetos los linfocitos T específicos contra antígenos de la vacuna TetaDif productores de IFN-γ, no expresan ni CTLA-4 (3%), ni LIR-1 (5%). Además demostramos que la expresión de CTLA-4 en células T específicas contra T. cruzi tiene consecuencias funcionales, debido a la activación de CTLA-4 conduce a la disminución de la producción de IFN-γ en respuesta a antígenos de parásitos. Interesantemente, detectamos expresión de CTLA-4 en linfocitos T en el corazón de pacientes con miocarditis chagásica crónica. Luego de la activación policlonal, la expresión de CTLA-4 aumenta en mayor medida en pacientes sintomáticos en comparación con la inducción de la misma en sujetos asintomáticos y no infectados (P<0,001). La expresión de este receptor inhibitorio en células T específicas contra el parásito en repetidas ocasiones durante la exposición antigénica crónica, podría resultar en el agotamiento immunológico observado en el compartimento total de células T después de 10-20 años de la infección inicial. 2) Evaluación del impacto del benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T que se encuentran aumentadas en pecientes crónicamente infectados. La administración del fármaco tripanocida en adultos con infección crónica por T. cruzi induce una disminución temprana, duradera y significativa (5 años de seguimiento) en los niveles de linfocitos T altamente diferenciados, los cuales vuelven a niveles normales. Este cambio se observa en la mitad (7 de 14) de los individuos infectados tratados, pero en ninguno de los individuos infectados no tratados seguidos en el tiempo (0 de 12). La serología convencional acompaña a la disminución de los CD4 + LIR-1 + obtenido en los primeros tiempos después del tratamiento y, por tanto constituiría un marcador precoz subrogante de la eficacia del tratamiento. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. Con el fin de caracterizar los tipos celulares presentes y su posible rol durante la miocarditis de la enfermedad de Chagas, se analizaron la composición celular (i.e. CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD68, CD57), la expresión de moléculas coestimuladoras (i.e. CD27), receptores inhibitorios (i.e. HLA-G, PD-1, CTLA-4), factores de transcripción de TH1 o células T reguladoras (i.e. Tbet, FOXP3), marcadores de senescencia (i.e. CD57, CD45RA) y un marcador de ciclo celular activo (i.e. Ki67). 3a. El porcentaje de células T (CD3 + , CD4 + y CD8 + células) se encuentra incrementado significativamente en las regiones con mayor grado de inflamación (hasta 70% del total infiltrado). Por el contrario, el porcentaje de macrófagos (% CD68 + ) fue similar en regiones de alto y bajo nivel de infiltración (20% del infiltrado). Por otro lado, las células B (i.e. células CD20 + ) se observaron sólo en algunas áreas con alto grado de inflamación y en bajo porcentaje (i.e. mediana, rango; 2%, 0-13%). 3b. La mayoría de los linfocitos infiltrantes mostraron expresión de CD45RO y CD27, marcadores de células con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación. Por el contrario, la expresión de PD-1, CD57 y CD45RA fue muy baja o ausente en el corazón de pacientes con enfermedad de Chagas independientemente del grado de miocarditis. 3c. La expresión del factor de transcripción maestro de TH1, Tbet, se observó en una importante proporción de células durante la miocarditis chagásica. En contraste, el nivel de células T reguladoras (i.e. FOXP3 + ) mostró ser escaso. Se observaron altos niveles del células expresando el marcador del ciclo celular activo, Ki67, las cuales a su vez resultaron coexpresar CD3, pero no CD8. 3d. Mediante un análisis de estadística de dos dimensiones pudimos demostrar la infección del miocardiocito humano durante el curso natural de la infección induce un reclutamiento eficiente de linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación (i.e. CD45RO + CD57 – ). En resumen, hemos encontrado que las células T reclutadas por el corazón infectado de pacientes con Chagas miocarditis poseen bajo grado de diferenciación y un fenotipo similar al de los linfocitos T específicos contra T. cruzi en presentes en sangre periférica. Además, se observó que las células T proliferarían in situ, y que los linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación son reclutadas por los miocitos infectados de manera eficiente.

Se describe la presencia, distribución y algunas propiedades de las ADN polimerasas aisladas de linfocitos humanos de sangre perisféroca normal sin estimular y estimulados por fitoheoaglutinina. En los linfocitos no estimulados se encuentran dos ADN polimerasas citoplasmáticas que eluyen de columnas de DEAE celulosa a 0,07 M de ClNa (C IN) y a 0,13 M de ClNa (C IIN). En la fracción nuclear contiene dos actividades enzimáticas,la correspondiente a N Is que no se adsorbe a la DEAE celulosa y la N IIs que eluye de la DEAE celulosa a 0,07 M de ClNa.

La herbivoría es una de las principales amenazas para las plantas teniendo impactos negativos no solo en los sistemas naturales sino también en los agro-ecosistemas. De la coevolución con los insectos han surgido en las plantas numerosas estrategias para sortear las amenazas como barreras físicas y bioquímicas. Además, muchas plantas establecen relaciones simbióticas con microorganismos, como los hongos micorrízicos, rizobacterias y hongos endofitos, los cuales inducen los mecanismos de defensa de las plantas, o aportan mecanismos adicionales de defensa como los alcaloides producidos por los hongos endofitos en pastos. Para el caso en particular de la simbiosis pasto-endofito, no existen trabajos que exploren la posibilidad de que ambos mecanismos (los alcaloides fúngicos y los cambios inducidos por el simbionte sobre los mecanismos de resistencia de la planta) funcionen de forma conjunta frente al ataque de insectos. En esta tesis buscamos comprender la interacción entre los mecanismos de resistencia conferidos por la simbiosis con los endofitos y el sistema inmune de la planta frente al ataque de insectos herbívoros. Para ello, avanzamos en un modelo teórico que incorpora conjuntamente el impacto potencial de los endofitos sobre los mecanismos de defensa de las plantas, específicamente el de las homonas ácido salicílico y ácido jasmónico, y los compuestos tóxicos sintetizados por el hongo (i.e. alcaloides). La validación del modelo propuesto es abordada a través de dos aproximaciones. Primero, una síntesis y análisis cuantitativo de la información existente en la literatura. Segundo, las hipótesis del modelo serán puestas a prueba a través de experimentos manipulativos del estado de la simbiosis y de las hormonas, complementado con la evaluación del crecimiento y/o desarrollo de distintas especies de insectos herbívoros. Combinando experimentos fácticos con herramientas de la química ecológica, este proyecto constituye el primer esfuerzo en integrar el mecanismo de resistencia conferido por los hongos endofitos con los mecanismos de defensa de las plantas.