Catálogo de publicaciones

La enfermedad de Gaucher (EG) es una patología genética de almacenamiento lisosomal, de herencia autosómica recesiva, causada por la deficiencia de la enzima lisosomal beta-glucosidasa (GCasa). Esta deficiencia lleva a la acumulación de glucosilceramida, principalmente en macrófagos. Las manifestaciones clínicas principales son: anemia, trombopenia, hepatoesplenomegalia, fracturas óseas, dolores óseos, osteopenia, osteonecrosis. Si bien el daño óseo es una característica común de la EG, los mecanismos de la injuria y destrucción tisular son desconocidos. Por otro lado se sabe que la inflamación es un factor clave en la patogénesis de la EG. En el presente trabajo de tesis se propuso profundizar en los mecanismos celulares y moleculares que llevan al daño óseo en la EG. Para el estudio de estos mecanismos se emplearon muestras de pacientes con EG y dos modelos in vitro, uno humano y uno murino, en los cuales la actividad de la GCasa es inhibida mediante el uso de un epóxido, el CBE, que inhibe irreversiblemente la enzima. En el presente trabajo se pudo demostrar la participación de los osteoclastos en el daño óseo tanto en el caso de los modelos como también en los pacientes. Por otro lado se demostró que los linfocitos T estarían involucrados en el proceso de diferenciación y activación de los osteclastos en la enfermedad. Pudo observarse también que la citoquina TNF-a sería uno de los principales mediadores involucrados en el aumento del proceso de resorción que llevaría al daño óseo en la enfermedad.

Fil:Olabuenaga, Susana E.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Scian, R. (2013). Mecanismos inmunológicos implicados en la patología osteoarticular por Brucella spp (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

Fil:Ramhorst, Rosanna Elizabeth. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los mecanismos patogénicos subyacentes a las alteraciones neuromusculares producidas durante la infección con Trypanosoma cruzi fueron estudiados en un modelo murino empleando una cepa miotrópica de escasa virulencia (CA-I) y una cepa letal pantrópica (RA), mediante técnicas electrofisiológicas, histológicas e inmunológicas. Ratones C3H/HeN infectados con la cepa CA-I manifestaron un patrón electromiográfico de compromiso muscular primario, en tanto los infectados con RA, revelaron un patrón neuropático primario. Los estudios histopatológicos evidenciaron alteraciones inflamatorias de severidad creciente en los tejidos afectados estudiados en este modelo: músculo isquiotibial, nervio ciático y médula espinal. Las lesiones musculares eran de mayor intensidad en la infección con CA-I y las de tejido nervioso predominaban con RA, lo cual está de acuerdo con el tropismo parasitario. El fenotipo celular predominante en los infiltrados inflamatorios dependió de la cepa de T.cruzi, del tejido y del tiempo post-infección. Los rasgos más destacados en la infiección con la cepa CA-I fueron: a) Predominio de linfocitos T CD4 en músculo esquelético durante la fase aguda y crónica temprana y, b) Presencia de linfocitos B con IgM de superficie en la fase crónica tardía en todos los tejidos. Las características más relevantes de la infección con RA fueron: a) predominio de linfocitos T CD8 en tejido nervioso durante todo el curso de la infección, b) presencia de células NK (asialo-GMl+) en tejido muscular durante la fase crónica y, c) presencia células CD4-, CD8- en tejido nervioso durante la fase crónica. Estudios de proliferación linfocitaria realizados durante la infección crónica con el clon K-98 de CA-I demostraron la existencia de linfocitos T CD4 y CD8 autorreactivos frente a Ag de tejido muscular esquelético y sistema nervioso. En estudios similares con la cepa RA ambassubpoblaciones de linfocitos T sólo proliferaron frente a Ag de SN. La transferencia pasiva de linfocitos T CD4 de ratones infectados con K-98, indujo miositis con predominio de células T CD4+ y macrófagos en ratones singeneicos normales, sugiriendo el desarrollo de hipersensibilidad retardada (HR), frente a Ag musculares. Los linfocitos T CD8 de los mismos ratones no desencadenaron patología neuromuscular en los receptores. La transferencia de linfocitos T CD4 y CD8 de ratones infectados con RA, indujo neuritis y leptomeningitis, sugiriendo el desarrollo de mecanismos de HR como de citotoxicidad dependiente de linfocitos T frente a Ag de sisterna nervioso.

The overall objective of this thesis was to study the relationship between IL-10 and the mechanisms of resistance to Trypanosoma cruzi (T. cruzi), the causative agent of Chagas disease. For this, we used a model of experimental infection with T. cruzi in mice deficient in IL-10 (IL-10 KO) from Balb/c background. Unexpectedly, we found higher parasitemia levels, greater weight loss and mortality in mice deficient in IL-10, compared with WT mice infected with T. cruzi strains of high and moderate virulence. The kinetics of T cells in spleen and peripheral blood showed that infected IL-10 KO mice failed to expand the relative number of spleen and total circulating CD8+ T cells, a phenomenon observed from 21 dpi in WT mice. CD8+ T cells from IL-10 KO mice had diminished effector functions (cytotoxic potential and IFN-γ production) and decreases ex vivo proliferative response than those of WT mice, despite the increased producing of IL-2 by the latter. At 21 dpi, in the absence of IL-10, CD8+ T cells failed to reach critical infected organs such as the heart. Consistent with this, IL-10 KO mice presented higher parasite burden in heart tissue than WT mice, but not in quadriceps. At chronic infection (5 months pi.), the extension and number of infiltrates decreased globally, but the IL-10 still appeared to be required to drive the CD8+ T cells accumulation in target tissues. Hystopathological studies of cardiac and skeletal tissues confirmed that IL-10 is involved in controlling inflammation, preventing irreversible damage to the muscle fibers. Adoptive transfer assays showed an improvement in controlling parasitemia in mice receiving CD8+ T cells from both infected WT as IL-10 KO mice. This finding shows that the lower resistance to T. cruzi seen in IL-10 KO mice correlates with the lack of expansion of CD8+ Tcells and with the absence of IL-10 produced by this cell subpopulation. In conclusion, during acute infection with T. cruzi, IL-10 plays a previously unrecognized immunostimulatory role on CD8+ T cells (the most relevant lymphocyte population for the control of intracellular parasites). Understanding the mechanism that control the effector function of this cell population is critical to understand factors involved in the susceptibility to Chagas disease, and for the rational design of effective strategies for the prophylaxis against T. cruzi

Fil:Tezón, Jorge G.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En esta tesis se estudiaron los mecanismos asociados con la exocitosis vesicular altamente acoplada al estímulo, su recuperación, y su mantenimiento frente a la aplicación de potenciales de acción a bajas frecuencias de estimulación, propias del estado basal de estas células. En primer lugar, se evidenció que frente a la aplicación de un estímulo que simula un potencial de acción se libera un grupo de ≈ 8 vesículas, al que denominamos ETAP (por exocytosis triggered by action potential). Este pool vesicular está incluido en el pool inmediatamente liberable (IRP, ≈ 25 vesículas), y su exocitosis depende en un 50% de fuentes de Ca2+ extracelulares y en un 50% de un mecanismo independiente del influjo de Ca2+. Mientras que IRP recupera lentamente (τ ≈ 7 s) luego de ser deprimido, ETAP presenta una rápida cinética de recuperación (τ ≈ 0.7 s). Esta recuperación depende de dos procesos: (i) transferencia de vesículas desde pooles vesiculares río arriba, y (ii) una endocitosis rápida dependiente de dinamina y altamente acoplada a la exocitosis precedente. En la segunda parte de esta tesis se investigó el mecanismo de exocitosis independiente del influjo Ca2+ mencionado previamente. Utilizando despolarizaciones cuadradas de 100 ms (máxima respuesta), se determinaron la siguientes características para dicho fenómeno: (i) independencia de fuentes extracelulares e intracelulares de Ca2+; (ii) dependencia de la proteína SNARE sinaptobrevina; (iii) dependencia sigmoidea con el voltaje aplicado; (iv) los resultados sugieren que el sensor de voltaje sería el canal de Ca2+ tipo P/Q, y que interaccionaría con la maquinaria exocitótica a través de la secuencia synprint. En resumen, los resultados muestran que un potencial de acción induce una exocitosis altamente acoplada y sincrónica al estímulo que es dependiente en parte de un mecanismo activado por Ca2+ y en parte de otro activado directamente por voltaje. Finalmente, demostramos que esta exocitosis, gracias a su rápida velocidad de recuperación vesicular, es capaz de mantener la secreción de manera continua a frecuencias basales fisiológicas.

La activacion temprana de los linfocitos T humanos por PHA, les confiere la capacidad de modificar la actividad contráctil de la auricula aislada de rata. Los efectos estimulantes de la población linfocitaria T se deben a la contribución de los linfocitos CD4 y son mediados por factores solubles que desencadenan la liberacion de SRS-A del miocardio. Como en el proceso de activacion lintocitaria con lectinas aumenta la disponibilidad de AA libre, se estudió la accion de los linfocitos humanos normales expuestos al AA sobre la actividad espontánea contractil de la auricula de rata, prescindiendo de este modo de la etapa de estimulación por PHA. Tanto las subpoblaciones linfoideas T, como no T, CD4 y CD8 en presencia de AA, reaccionan in vitro con el miocardio aislado desviando el metabolismo del AA hacia la via de la lipoxigenasa. Así, los efectos inotrópicos y cronotrópicos observados estarían relacionados con la generación de la SRS-A. Por último se comprobó que las células de pacientes con LLC o células linfoblastoideas B (Raji), ejercen en ausencia de AA un efecto depresor sobre la tension contráctil. Evidencias directas e indirectas sugieren que la producción de Txs por estas celulas transformadas podrían estar involucrados en la respuesta inotrópica negativa, asi como podrían intervenir en la regulación de su proliferación.

En este trabajo de Tesis se evaluaron las siguientes hipótesis: 1. El receptor de progesterona (RP) está involucradoen el crecimiento tumoral progestágeno-independiente (PI). 2. Vias preliferativas activadas por factores de crecimiento activan al RP. 3. Factores del estrema tumoral participan en la transición hacia la hormono-independencia activando RP. 4. Los receptores de estrógenos alfa (REα) tienen un rol en el crecimiento tumoral pregestágeno-dependiente (PD). Los ensayos se realizaron en un modelo experimental de inducción de cáncer de mama por administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Los tumores utilizados fueron todos carcinomas ductales metastáticos con alto contenido de RE y RP, que se comportan como hormono-dependientes en los primeros pasajes subcutáneos singeneicos, creciendo sólo en presencia de progestágenos. En pasajes sucesivos pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, independizándose del requerimiento de hormonas, pero aún así mantienen la expresión de RE y RP. Un estudio de comportamiento de una serie de tumores PI, nos condujo a subclasificarlos en respondedores (PI-R) o no respondedores (PI-NR) (Helguero y col. Breast Cancer Res and Treat 79: 379-390, 2003) de acuerdo a la sensibilidad in vivo para regresionar con el tratamiento a antiprogestágenos. Para evaluar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar a los progestágenos en la estimulación de la proliferación celular en cultivos primarios de un tumor PD, el CC4-HD, usamos al bFGF y bloqueamos el RP mediante el uso de antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y mediante el uso de oligonucleótidos antisentido. En todos los casos el bloqueo del RP inhibió la proliferación celular inducida por MPA, factores séricos o bFGF, de manera específica. Resultados similares se obtuvieron utilizando cultivos primarios de 3 tumores PI diferentes: 59-2-HI, C7-2-HI y CC4-HI. Estudios de Mobility Gel Shift confirmaron que tanto el MPA como el bFGF pueden inducir la activación del RP en células en cultivo y que los mismos se encuentran constitutivamente activados en cultivos primarios de tumores PI. Por otra parte se demostró que in vivo la terapia con oligonucleótidos antisentido de RP fue capaz de inducir una inhibición del crecimiento tumoral. Los tumores de animales tratados mostraron una significativa reducción de células en fase proliferativa y en la expresión de RP. Se observó incremento de apoptosis sólo en un tumor en el cual el tratamiento indujo reducción de tamaño. Para evaluar la expresión del bFGF y los receptores (RFGF 1 al 4) en los tumores PD y PI procedimos a evaluar primero su expresión en distintos estadios del desarrollo de glándulas mamarias normales por inmunohistoquímica. Si bien la expresión de bFGF en la mama normal de ratón ya estaba reportada, nuestros estudios revelaron una regulación de la expresión en el desarrollo. Los 4 receptores también se expresan en las mamas normales y su expresión también está regulada en los distintos estadíos del desarrollo. Por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia no se detectaron diferencias evaluables de expresión de bFGF o de sus receptores entre tumores PD y PI-R; si bien se pudo determinar la marcación de bFGF predominantemente estromal y la de los receptores en el parénquima tumoral. Los RFGF 2 y 3 están ampliamente expresados con localización nuclear además de la convencional. Debido a que con la técnica inmunohistoquímica no se puede discriminar entre las distintas isoformas de bFGF, se hicieron estudios de Western blots para identificar la isofonna clásica de 16kDa. Se detectó una mayor expresión de esta isoforma cuando los tumores PD crecían en ausencia de progestágenos. Para poder evaluar mejor la contribución de las células epiteliales o los fibroblastos en la expresión de bFGF, separamos ambas poblaciones y se hicieron cultivos primarios. Observamos mayor expresión de bFGF en los fibroblastos estromales de tumores PI que en los de tumores PD. En su conjunto estos datos indicarían que el bFGF estromal podría contribuir a inducir la proliferación celular en tumores PI a través de la activación de RP. En co-cultivos de células epiteliales obtenidas de un tumor PD con fibroblastos estromales obtenidos de un tumor PD o de uno PI se demostró que ambos fibroblastos ejercían un efecto sinérgico de la proliferación celular y que este efecto era mayor con los fibroblastos PI. A la inversa, células epiteliales PI cultivadas con fibroblastos PD crecieron más lentamente que al cultivarlas con fibroblastos PI. En el primer capitlo concluímos que los tumores con fenotipo PD y los PI-R necesitan de un RP funcional para proliferar y que el estroma cumple una participación activa en el crecimiento tumoral. En el crecimiento PI-R, el bFGF junto con otros factores provenientes del estroma podría estar activando los RP presentes en el parénquima, contribuyendo al fenotipo PI. El estroma PI liberaría una mayor cantidad de factores en respuesta a señales del parénquima. En el segundo capítulo estudiamos la participación del RE en el crecimiento tumoral PD y para ello bloqueamos el REα con un antiestrógeno puro, el ICI 182.780 y oligonucleótidos antisentido de REα. Como resultado, en ambos casos obtuvimos una inhibición de la proliferación celular acompañada por una disminución de expresión de RP, sugiriendo que el REα participa en el crecimiento PD y que la alta expresión de RP pueda deberse a la presencia de RE activados. En el tercer y último capítulo estudiamos el efecto de dos SERMs, y del antiestrógeno puro ICI 182.780, utilizados en la clínica sobre el crecimiento de un tumor PD y sobre la síntesis de RP. El ICI 182.780, el tamoxifeno y el raloxifeno mostraron efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro al igual que el 17-β—estradiol (E2) pero en mayores concentraciones. El raloxifeno indujo una estimulación de la proliferación en presencia de progestágenos. EI ICI 182.780 y el raloxifeno revirtieron el efecto inhibitorio del E2 mientras que el tamoxifeno fue inhibitorio. El ICI 182.780 disminuyó la síntesis de RP mientras que el tamoxifeno y el E2 los aumentaron y el raloxifeno no tuvo efectos significativos. Concluimos que el tamoxifeno tiene un efecto similar al observado en la clínica en nuestro modelo experimental inhibiendo el crecimiento tumoral y aumentando la expresión de RP. Estos resultados nos llevan a hipotetizar que el tamoxifeno pueda ejercer efectos inhibitorios por su efecto estrogénico leve más que por su acción antiestrogénica. En conjunto estos resultados: a) jerarquizan el rol del receptor de progesterona en el crecimiento de carcinomas mamarios, b) brindan al estroma un posible rol protagónico en la adquisición de la hormono-independencia y c) la similitud entre los efectos del tamoxifeno obtenidos en la clínica y en estos tumores son interesantes para validar aún más los dos ítems anteriores en cuanto a su relevancia clínica.