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Queda claro que los efectos de la insulina son tan complejos, inter-relacionados y diversos que es muy difícil explicar el cambio final observado en nuestros pacientes DM2 tras la administración de la hormona. Esto se agrava por la falta de estudios previos de este tipo de problemática desde una perspectiva mecanística. Por un lado la hormona podría ejercer efectos pro-aterogénicos, pero por otro sus actividades directa o indirectamente anti-aterogénicas se hacen prevalentes y el resultado final resulta ser protectivo. Esta conclusión debe ser necesariamente acompañada de una consideración especial sobre el nivel de hiperinsulinismo y resistencia periférica a la hormona que exhiba el paciente. La suplementación estaría indicada cuando el nivel de insulina circulante no es excesivo o en términos mas sencillos cuando los marcadores convencionales superen ciertos valores de referencia que aún no han sido investigados (por ejemplo Hb A1c ≥ 7%). De modo que se requieren estudios más exhaustivos y con un mayor n para decidir cual sería la línea de corte y la condición de hiper-insulinismo que desacosejarían su implementación. En general, podemos decir que la administración de insulina en combinación con hipoglucemiantes orales modifica significativamente y de manera beneficiosa a todos los biomarcadores de inflamación, y a la mayoría de los marcadores de riesgo aterogénico y disfunción endotelial. Estos efectos son independientes del tipo de insulina administrada, pero correlacionan con otras variables sustentando la idea de obtener un beneficio tras su administración. Existe una clara dependencia entre el deterioro evaluado por cualquiera de los marcadores y el tiempo de evolución clínica, y una compleja inter-relación entre ellos que se ve mejorada por efecto de la hormona siempre y cuando se considere exceptuar a los pacientes con muy significativa hiperinsulinemia. Los resultados apoyan la implementación de una terapia combinada de hipoglucemiantes orales e insulina como una mejor opción para disminuir las complicaciones de la DM2, siempre que se tomen los recaudos pertinentes para evitar el riesgo de hipoglucemia (sobre todo en pacientes susceptibles). Asimismo, podría favorecer una mayor expectativa funcional de las células beta que de este modo no se verían tempranamente agotadas para acometer con la demanda creciente de insulina a nivel periférico. Se justificaría ampliar este tipo de investigaciones longitudinales a grandes poblaciones de pacientes DM2 cuidadosamente seleccionadas a fin de rectificar o ratificar estos hallazgos como generadores de hipótesis de trabajo, las cuales conducirían finalmente a una descripción mecanística clara sobre los eventos sobre los cuales se sustentan. Tras la dilucidación de estas cuestiones podría ser posible entonces admitir su inclusión como un protocolo o una recomendación farmacológica sentada sobre bases mucho más convincentes.

La escasez de nutrientes es probablemente la condición de crecimiento más parecida al hábitat natural de los rizobios en el suelo. Por lo tanto, estos microorganismos deben estar habituados a sobrevivir en entornos con condiciones fluctuantes de “hambre y abundancia” y a los diferentes estreses ambientales que soportan. Durante estas modificaciones, las bacterias regulan sus actividades metabólicas para dar lugar a un fenotipo de adaptación al entorno desfavorable. En este sentido, se sabe que las condiciones óptimas de infección de las raíces de soja y formación de los nódulos que permiten la FBN se observan cuando la relación C/N es alta en la rizósfera. Nuestro grupo de investigación ha observado que los rizobios cultivados bajo escasez de la fuente de N son más persistentes, infectivos y competitivos. Estos resultados nos llevaron a pensar que esta condición de cultivo podría utilizarse con ventaja en la elaboración de inoculantes más efectivos para soja. El estado de limitación de N probablemente se asemeje más a las condiciones en las que se encuentran los rizobios en el suelo, a diferencia de las bacterias del inoculante que se elaboran cultivando los rizobios en medios ricos. Con todas estas premisas, podría plantearse la alternativa de preparar inoculantes en medios de alta relación C/N, para lo cual es necesario conocer cómo ésta relación C/N modifica el metabolismo general de los rizobios para luego encarar un diseño racional de inoculantes con alta eficiencia simbiótica. Por lo tanto, nuestra hipótesis de trabajo consiste en que es posible mantener estas buenas propiedades simbióticas, alcanzadas en la situación de escasez de N, estudiando cómo los reguladores más importantes involucrados en el metabolismo de N en B. diazoefficiens se expresan y controlan otros genes para adaptarse a esta situación particular, tanto en vida libre como en simbiosis. Para ello, es necesario conocer cómo funcionan los mecanismos de regulación del N en este rizobio (NSR) y su influencia en la FBN. Es interesante señalar que al momento en que se inició este trabajo de Tesis Doctoral contábamos con muy poca información sobre las principales proteínas involucradas en la cascada de respuesta al estrés por N y en la asimilación de NH4+ en B. diazoefficiens. Las últimas publicaciones se remontaban a los años 1987/1988 y se basaban en el estudio de la expresión de los genes glnA y glnII, que codifican las glutamino sintetasas, cuyas secuencias se habían encontrado por homología con otros microorganismos previamente descriptos como E. coli (Carlson et al., 1987; Martin et al., 1988). En cuanto a las proteínas de señalización PII, Martin y col. (1989) pudieron describir la presencia del gen glnB y la regulación de la expresión del mismo a partir de dos promotores en tándem. Sin embargo, la caracterización funcional de GlnB continuaba siendo una incógnita ya que la deleción de dicho gen no fue posible con las técnicas de la época. Incluso, nada se conocía de la presencia del gen glnK en B. diazoefficiens hasta la secuenciación de su genoma (Kaneko et al., 2002). Dada la relevancia de aumentar el rendimiento del cultivo de soja en forma sustentable, en este trabajo de Tesis Doctoral se plantea profundizar el conocimiento sobre cómo los sistemas regulatorios se activan para adaptarse a la escasez de N en B. diazoefficiens tanto en vida libre como en simbiosis, así como también proponemos profundizar en la regulación global del metabolismo de N en estas bacterias ya que parece ser un factor clave para una simbiosis exitosa. Objetivos de este trabajo de Tesis Doctoral Objetivo General: En este trabajo de Tesis nos planteamos como objetivo principal caracterizar la cascada regulatoria del metabolismo de N en B. diazoefficiens, tanto en vida libre como en simbiosis con plantas de soja, y comprender y estudiar en qué condiciones metabólicas se activa la respuesta al estrés por N en este rizobio. Asimismo, es nuestro objetivo a fututo establecer, con los conocimientos ganados, condiciones de cultivo favorables para el desarrollo de formulaciones de inoculantes para soja con mayor eficiencia simbiótica. Objetivos específicos: 1- Evaluar la fisiología del crecimiento de B. diazoefficiens en medios definidos desarrollados para generar condiciones de exceso o limitación de N. 2- Obtener, mediante mutagénesis dirigida, cepas mutantes en las proteínas de señalización PII: GlnB, GlnK1 y GlnK2, involucradas en la regulación del metabolismo del N en B. diazoefficiens, y estudiar el entorno génico de cada una de ellas, así como también las características de sus secuencias proteicas mediante análisis in sílico. 3- Analizar la posible función de las diversas copias de la enzima glutamino sintetasa GS, realizando un análisis comparativo de sus secuencias a partir de herramientas bioinformáticas, así como también obteniendo cepas mutantes en los genes glnA1, glnA2, glnA3 y glnII. 4- Caracterizar fenotípicamente los distintos mutantes obtenidos en B. diazoefficiens con el fin de evaluar el posible rol de cada una de las proteínas mutadas en la regulación del metabolismo de N en este rizobio en vida libre. 5- Evaluar los mutantes obtenidos en relación a su interacción simbiótica con las plantas de soja.

En una amplia variedad de microorganismos, el reparto de la glucosa para producir oligo- y polisacáridos estructurales o de reserva es una etapa central del metabolismo, y la producción de compuestos con diferentes funciones celulares está determinada en relación a cómo la Glc-1P es utilizada por diferentes enzimas. La enzima UDP-GlcPPasa cumple una función relevante para la producción de distintos glicoconjugados en los microorganismos que son objeto de estudio en la presente Tesis (Streptococcus mutans, Entamoeba histolytica, Trypanosoma cruzi, y Trypanosoma brucei). En este trabajo de Tesis se presenta la caracterización de la UDP-GlcPPasa de los cuatro microorganismos, realizando de un análisis comparativo de las propiedades de la enzima con las de otras pirofosforilasas, para poder comprender cómo la Glc-1P es fraccionada metabólicamente y cómo este proceso es regulado en diferentes células. Así, se clonaron los genes que codifican para las distintas UDP-GlcPPasas. Las enzimas se expresaron en forma recombinante, pudiendo obtener a las proteínas de interés solubles, activas. Se realizó la caracterización cinética y estructural de cada una de ellas y se detectaron posibles mecanismos regulatorios de las actividades de estas enzimas. Parte de los resultados indican que en parásitos protozoarios existiría un mecanismo de regulación de la actividad de las UDP-GlcPPasas por modificación post-traduccional redox. Así, algunas de las especies químicas producidas por reducción incompleta del oxígeno, no sólo generarían condiciones de estrés oxidativo sino que actuarían como reguladores redox de la actividad de enzimas que, como las UDP-GlcPPasas, forman parte de otras rutas metabólicas en los parásitos.

El corazón, para poder suplir la demanda metabólica y contráctil, depende de las concentraciones de O2 y ATP. Las mitocondrias son las organelas encargadas de producir ATP y son los sitios subcelulares más activos en cuanto a la producción de especies reactivas derivadas del oxígeno (O2- y H2O2) y del nitrógeno (NO y ONOO-). Por lo cual, alteraciones en su función pueden llevar a la disfunción bioenergética del corazón y falla cardiaca. El complejo I es el primer complejo multienzimático de la cadena respiratoria, con un papel central en la producción de energía celular, siendo, a su vez, uno de los sitios de generación de O2-. El NO es generado por la óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS), localizada en la membrana interna mitocondrial, cuya actividad y/o expresión es regulada en situaciones fisiológicas, patológicas y farmacológicas. El NO modula la función y el metabolismo energético ya que inhibe la actividad de citocromo oxidasa y la transferencia de electrones entre los citocromos b y c, impactando, de esta forma, en las concentraciones en estado estacionario del propio NO y de otras especies reactivas, tales como O2-, H2O2 y ONOO-.La hipótesis de trabajo sostiene que la mtNOS interacciona física y funcionalmente con subunidades del complejo I mitocondrial, explicando otro de los mecanismos reguladores del NO sobre la cadena respiratoria en situaciones fisiológicas, y la disfunción del complejo I asociada a cambios en la producción mitocondrial de NO, observada en situaciones fisiopatológicas.El objetivo fue estudiar la relación funcional entre el complejo I y la mtNOS, en situaciones fisiológicas y patológicas, desde un aspecto bioenergético y haciendo hincapié en el metabolismo de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, en mitocondrias de corazón. Se abordó el estudio desde un punto de vista fisiológico (capítulo I) y a través de dos modelos experimentales, que simulan situaciones fisiopatológicas de estrés oxidativo: atontamiento miocárdico (capítulo II) y diabetes (capítulo III).En el capítulo I se analizó la interacción funcional entre la mtNOS y las proteínas del complejo I utilizando partículas fosforilantes invertidas (ETPH). Se observó que dichas partículas producen NO, utilizando tanto los electrones cedidos por el sustrato fisiológico de las NOS, el NADPH, como los electrones provenientes de la cadena respiratoria funcionando en condiciones de flujo reverso. Tanto la actividad NAD+ reductasa como la producción de NO en condiciones de flujo reverso, se inhibieron por el agregado de rotenona. Adicionalmente, la actividad de mtNOS fue detectada en la fracción mitocondrial enriquecida en complejo I, la cual fue reconocida por anticuerpos anti-nNOS. Estos resultados avalan que la mtNOS y proteínas del complejo I estarían contiguas, interaccionando funcionalmente, permitiendo a la mtNOS aceptar electrones provenientes de la cadena respiratoria para su actividad enzimática.En el capítulo II se estudió la funcionalidad mitocondrial en un modelo de atontamiento miocárdico. La disfunción ventricular se acompañó de disfunción mitocondrial, caracterizada por disminución del consumo de O2 en estado 3 sustentado por malato-glutamato y de las actividades de complejo I y de mtNOS; y por aumento en la generación de H2O2, en la oxidación a proteínas y lípidos y en la nitración de tirosinas. Los cambios en la función mitocondrial son compatibles con los descriptos para el ?síndrome del complejo I?, situación previamente observada en mitocondrias de áreas cerebrales en enfermedades neurodegenerativas. Cabe mencionar que la actividad del complejo I y las actividades bioquímica y funcional de mtNOS disminuyeron en forma conjunta y progresiva, alcanzando un máximo de reducción a los 30 min de reperfusión. Estos resultados refuerzan la idea de la interacción estructural y funcional entre el complejo I y la mtNOS, así como de la co-localización en la producción de O2- y NO, generando ONOO-, llevando a modificaciones reversibles o irreversibles de dicho complejo. Por otro lado, la administración de adenosina revirtió las alteraciones ventriculares y mitocondriales observadas en el atontamiento miocárdico, preservando a las mitocondrias de la aparición del ?síndrome del complejo I?.En el capítulo III se evaluó la funcionalidad y biogénesis mitocondrial cardiaca en diabetes inducida por estreptozotocina. En los corazones de los animales diabéticos se observó disfunción en la reserva contráctil y lusitrópica ante una sobrecarga de trabajo, acompañada de una disminución en el consumo de O2 tisular y mitocondrial, en las actividades de los complejos mitocondriales, en la producción de ATP, y en la eficiencia de la fosforilación oxidativa; así como de un aumento en la generación de H2O2 y NO. Asimismo, se evidenció incremento en la masa mitocondrial, en la densidad numérica y volumétrica y en la expresión del factor PCG-1α, junto con la presencia de daño mitocondrialUna diferencia a enfatizar entre el modelo de atontamiento miocárdico y el de diabetes es que aunque en ambos se observó disfunción mitocondrial, en el primero, la disfunción mitocondrial fue acompañada de una reducción en la actividad de mtNOS y en el estado estacionario de NO, mientras que en el segundo, la disfunción mitocondrial conlleva a un aumento en la producción y estado estacionario de NO, con incrementada expresión de mtNOS. Esto explicaría que en el atontamiento miocárdico, en donde la disfunción ventricular revierte, el NO podría estar ejerciendo su función regulatoria sobre la cadena de transferencia de electrones, a través de una menor inhibición sobre la citocromo oxidasa, de modo de restaurar el balance redox y energético mitocondrial. Por el contrario, en el modelo de diabetes, el aumento en la generación de NO mitocondrial y su difusión al citosol, sería la señal ?distintiva? que activaría al factor PGC-1α y desencadenaría la biogénesis mitocondrial. Ante la persistencia de la hiperglucemia, las nuevas mitocondrias generadas no serían funcionalmente activas, pudiendo explicar el daño en el metabolismo energético cardíaco observado en la Diabetes.Para concluir, perturbaciones del estado redox y energético mitocondrial pueden transmitirse al núcleo y/o al citosol e inducir una respuesta compensatoria inmediata o adaptativa. En este proceso, modificaciones en la producción y/o estado estacionario de los segundos mensajeros H2O2 y/o NO, serían parte del mecanismo bioquímico subyacente a enfermedades cardiovasculares asociadas a fallas energéticas cardíacas. En este contexto, la asociación funcional entre el complejo I y la mtNOS podría explicar el papel del NO y/o ONOO- en la regulación fisiológica de la cadena respiratoria, y en la inactivación irreversible del complejo I en situaciones fisiopatológicas.

En este trabajo, se han caracterizado distintos aspectos del metabolismo de poliaminas en el parásito tripanosomátido Crithidia fasciculata, poniendo especial énfasis en la enzima ornitina decarboxilasa (ODC), que cataliza el primer paso en la síntesis de estas sustancias. El transporte de poliaminas al interior del parásito es muy bajo, y solo se ve aumentado cuando se expone a los cultivos a un inhibidor de la ODC, como es el difluorometilornitina (DFMO). Este dato indicaría que en condiciones normales, la maquinaria biosintética del parásito es suficiente para satisfacer sus requerimientos, pero que al someter a C.fasciculata a un ayuno de poliaminas por bloqueo de su biosíntesis se produce una marcada inducción de la entrada de estas sustancias desde el medio externo. La enzima fue ampliamente caracterizada dsde el punto de vista bioquímico y molecular. Se clonó y secuenció en su totalidad, determinandose a partir de estos datos su PM y las zonas que podrían ser importantes desde el punto de vista de su regulación "in vivo". Por último se estudió la resistencia a DFMO del parásito, y se determinó que este fenómeno no produce diferencias sustanciales en la expresión del gen de ODC. Todas estas observaciones nos llevan a pensar que la enzima ODC de este parásito tiene propiedades que la hacen distintiva entre las estudiadas hasta el momento en otras células, y abren un nuevo capítulo en el estudio general de la estabilidad enzimática.

Las poliaminas son compuestos esenciales para el crecimiento y la proliferación celular: por este motivo se realizan grandes esfuerzos para la búsqueda de inhibidores selectivos de la biosíntesis de estas sustancias con el objeto de detener el crecimiento de células tumorales, así como de los microorganismos causantes de infecciones. Estudios recientes han propuesto el empleo de inhibidores de la biosíntesis de putrescina como una herramienta terapéutica útil para controlar el crecimiento de parásitos intracelulares. Por esta razón se decidió estudiar el metabolismo de poliaminas en Trypanosoma cruzi y Leishmania mexicana con el fin de encontrar diferencias en la biosíntesis de estos policationes entre el protozoo y la célula del mamífero huesped con el objeto de encontrar blancos específicos que al ser inhibidos determinen el bloqueo de la proliferación permitiendo desarrollar nuevas estrategias quimioterápicas contra el Mal de Chagas y la Leishmaniasis. Se ha observado que los niveles intracelulares de poliaminas en T.cruzi en su forma epimastigote correlacionan con la fase de crecimiento. La putrescina, espermidina, espermina y cadaverina alcanzan los valores máximos en la etapa logarítmica y luego disminuyen hacia la fase estacionaria de crecimiento. En L. mexicana se observó un resultado similar pero en este parásito sólo se detectó putrescina y espermidina. La captación de poliaminas y sus probables precursores (ornitina, arginina y lisina) por T. cruzi y L. mexicana, como la conversión in vivo de dichos aminoácidos en poliaminas sugieren que en los tripanosomas la mayor parte de estas sustancias son transportadas al interior de las células desde el medio externo, mientras que en Laishmania parece prevalecer la biosíntesis de los policationes a partir de ornitina. Se determinó que los extractos de L. mexicana poseen una alta actividad de Ornitina decarboxilasa (ODC). Se caracterizaron los requerimientos para la máxima actividad catalítica, así como diferentes propiedades de la enzima en relación a su estructura y la regulación de su actividad. La adición de cicloheximida y de poliaminas a los cultivos mostraron que la ODC de L. mexicana es estable y que su degradación no es regulada por poliaminas. La ODC es inhibida tanto in vivo como in vitro por la adición de a DFMO. Se observó que la actividad enzimática es fuertemente dependiente de la presencia de su coenzima, el piridoxal 5'-fosfato. La enzima preparada en presencia de concentraciones saturantes de PLP es más resistente a la inactivación por efecto de la temperatura y es menos sensible a la acción de inhibidores. Por otra parte, se observó que la enzima obtenida en ausencia del cofactor contiene PLP endógeno, ya que la remoción total de la coenzima por tratamiento con hidroxilamina produce la apoenzima inactiva, la cual requiere PLP para recobrar su actividad enzimática mediante una unión que parece inducir cambios conformacionales de la proteína. Probablemente, la ODC no presenta homología estructural en sus regiones antigénicas con la enzima aislada de células animales, ya que no se observó reacción cruzada cuando se inmunoprecipitó la OCD del parásito con un anticuerpo policlonal contra ODC de riñón de ratón. La enzima se purificó parcialmente a partir de promastigotes de L. mexicana mediante la precipitación con acetona y cromatografías de intercambio iónico en DEAE Sepharosa, de hidroboficidad en Phenyl Superosa, de exclusión molecular en Superosa 6 y en fase reversa con una columna C4, lográndose una purificación de 2300 veces. Los análisis en geles desnaturalizantcs de poliacrilamida y de cromatografía en Sephacryl S-200 indican que la subunidad proteica o el principal producto de su proteólisis tendría un peso molecular aparente de 60 kDa, mientras que el de la proteína nativa sería de aproximadamente 200 kDa. listos resultados sugirirían que la ODC estaría formada por tres o cuatro subunidades.

En los estados de intoxicación por plomo se observa una serie de trastornos metabólicos relacionados con la biosíntesis del hemo. Los principales son : a) elevada concentración de ácido delta-amino levúlico en suero y concomitante excreción por orina. b) elevados niveles de Coproporfirinógeno III en todo el sistema eritropoyético, que luego deriva en una excreción aumentada de este metabolito por orina. c) gran cantidad de Protoporfirina IX en el sistema eritropoyético, excreción posterior por materias fecales. A fin de aclarar los mecanismos responsables de estas anomalías, procedió a estudiar sistemáticamente los pasos metabólicos que median entre Glicocola y Hemo, empleando para ésto sistemas de incubación "in vitro" derivados de sangre de conejos con saturnismo y distintos sustratos. La secuencia de operaciones fué como sigue: se drogaban conejos con (AcO)2Pb durante 7 - 15 dias y a los 20-30 días de la última inyección se los sangraba a blanco. La sangre se recogía sobre heparina y se efectuaban luego los pasos necesarios para obtener un sistema adecuado a normales o conejos con anemia post-hemorrágica, con alta reticulocitosis. Este estado se lograba con 2-4 punciones cardíacas de 15 - 30 ml cada una espaciadas 3 - 5 días. Las incubaciones se efectuaron entre 37 y 38°C en baño termostatizado, con agitación constante, a tiempos variables que se consignarán en cada experiencia. Una vez terminadas las incubaciones, se procedía a aislar los productos biosintetizados. Las porfirinas libres eran extraídas de las mezclas originales, purificadas, separadas en sus componentes e identificadas por cromatografía en columna de CaCO3 y/o cromatografía sobre papel. Se efectuaban luego dosajes cuantitativos de los productos aislados y se hallaban las proporciones relativas de los distintos componentes dentro de las mezclas. También se aisló Protoporfirina IX a partir de hemo, al trabajar con compuestos marcados y se dosó su actividad. Podemos esquematizar en esta forma las experiencias y los resultados. A. Incorporación de Glic-2-C14 en hemo de reticulocitis de conejos: Se efectuaron experiencias con sangre total en presencia de Glic-2-C14 e iones de Fe, agregados como SO4Fe.7H2O. Se incubó durante 4 horas, en aerobiosis. En todos los casos se aislaron las escasas porfirinas libres y la Protoporfirina X a partir de hemo. Los resultados indican que los reticulocitos de los conejos con saturnismo conservan algo de capacidad de biosintetizar hemo "in vitro" a partir de hierro y glicocola. Como se esperaba, los reticulocitos de conejos con anemia posthemorrágica poseen una capacidad elevada para sintetizar hemo "de novo". Hemos controlado los métodos de trabajo con la incubación de sangre de conejos normales, sin reticulocitos y observamos la escasa neoformación de hemo. Creemos que además de la inhibición, ya reconocida y documentada, de la incorporación de Fe al anillo protoporfirínico para dar hemo, existiría algún otro bloqueo en la cadena biosintética de Protoporfirina IX. Uno de esos pasos podría ser la conversión enzimática de Glicocola a ALA. B. Biosíntesis de porfirinógenos a partir de ácido delta-amino levúlico (ALA): Se incubó sobrenadante de hemolizado de glóbulos rojos de conejos con saturnismo en presencia de ALA como sustrato. Se trabajó durante 90′ en anaerobiosis. Los resultados de estas experiencias permiten concluir que en los sistemas provenientes de intoxicados por plomo, la capacidad de biosintetizar "in vitro" PBG y porforinógenos, a partir de ALA, está muy disminuída. Las fracciones de Uroporfirinógeno III y Firiaporfirinógeno III se encuentran marcadamente disminuídas y sólo se observa una acumulación de Coproporfirinógeno III. Nótese que al trabajar con sistemas libres de partículas y en anaerobiosis, no hay conversión de Coproporfirinógeno III a Protoporfirina IX ni a hemo. Creemos que este freno de la cadena biosintética es la causa de la acumulación semejante de Copro-G-III en ambos sistemas, el intoxicado y el normal. C. Incorporación de Acido delta-amino levúlico marcado (ALA-4-C14) en profirinógenos y en hemo de reticulocitos de conejos: Este tipo de experiencia difiere del anterior en que se trabajó con suspensión de glóbulos rojos en solución fisiológica, en presencia de ALA-4-C14 y de iones ferrosos. Además, el tiempo fué de 4 hs y en condiciones aerobias. Con sistemas provenientes de glóbulos rojos de conejos con saturnismo se obtuvo una sintesis total de porfirinas muy inferior a lo hallado en el sistema control, como también una incorporación muy pobre en hemo. De las series B y C de experiencias "in vitro" se deduce que la enzima ALA-dehidrasa presenta una inhibición marcada de su actividad en los estados de intoxicación por plomo. Suponiendo que el proceso "in vitro" sea representativo de lo que sucede "in vivo", tendríamos una explicación satisfactoria del origen de la elevada cantidad de ALA en suero y en orina de conejos y pacientes son saturnismo. D. Biosíntesis de porfirinógenos a partir de Porfobilinógeno (PBG) Se incubaron sobrenadantes de hemolizados de conejos con saturnisno, en presencia de PBG, durante 90' y en anaerobiosis. De estas experiencias se deduciría que los sistemas enzimáticos capaces de transfornar PBG en Uroporfirinógeno III y Firiaporfirinógeno III, no se encuentran alterados; ahora el pasaje de Firiaporfirinógeno III a Coproporfirinógeno III parecería algo disminuído. Cuantitativamente, los porfirinógenos biosintetizados son del mismo orden en ambos sistemas. E. Conversión enzimática de Uroporfirinógeno III C14 (URO G III-C14) en otros porfirinógenos intermediarios en la biosíntesis del hemo: Se incubaron sobrenadantes de hemolizados de conejos en presencia de URO G III-C14, durante 30 y 60' respectivamente, en anaerobiosis. Los resultados de estas experiencias nos dicen que, a los 30', parece haber una menor velocidad de transformación de URO G III en FIRIA G III y COPRO G III en los sistemas provenientes de conejos con saturnismo. Esta diferencia no es muy notoria en la experiencia de 60'. En esta última se observa una transformación menor de FIRIA G III a COPRO G III. Notemos que en ningún paso se observa aceleración de procesos enzimáticos. F. Conversión enzimática de Coproporfirinógeno III-C14 (Copro G III-C14) en Protoporfirina IX C14 libre e incorporación en hemo de reticulocitos de conejos: Se trabajó durante 4 horas, en aerobiosis, con hemolizados totales de conejos, en presencia de COPRO G III-C14, como sustrato. Los resultados de estas experiencias nos indican que no habría una hipersíntesis de Proto IX a partir de Copro G III, más aún, se cree que hay una cierta disminución de la actividad del complejo enzimático CPG-decarboxilasa-CPG oxidasa, lo que llevaría a una acumulación de Copro G III en el sistema eritropoyético y a su posterior excreción por orina. La acumulación de Proto IX, por su escasa incorporación al hemo de glóbulos rojos de conejos con saturnismo causaría el aumento de Copro G III, como resultado de un mecanismo de autoregulación enzimática de tipo represivo. Descartaríamos así toda similitud del saturnismo con estados de porfiria, como fuera sugerido por algunos autores, estados aquéllos donde hay un exceso de síntesis de porfirinas y precursores. La anemia saturnina sería causada por bloqueo de la incorporación de Fe al anillo protoporfirínico para dar hemo y por una inhibición principal de la biosíntesis de Proto IX a la altura de la ALAD, aunque no podemos descartar que haya otros bloqueos secundarios.

Fil:Stoppani, Andrés Oscar Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El ácido delta amino levúlico (ALA) es un precursor metabólico, intermediario natural en la biosíntesis de porfirinas. En este trabajo de tesis se analizan detalladamente los antecedentes metabólicos de la biosíntesis del ALA a partir de los trabajos de Shemin y Rittenberg en 1945 con glicina marcada N^15, mencionando las experiencias principales mediante las cuales se conocieron los primeros pasos metabólicos de la biosíntesis de porfirinas, hasta que Shamin y Russell en 1953 demuestran que el ALA es un paso obligado en el camino de la biosíntesis de estos compuestos tetrapirrólicos. Se analiza también el curso metabólico del ALA vía porfobilinógeno (PBG), como así también su posible conversión en purinas a través del denominado ciclo glicina- succinato de Shemin. La biosíntesis del ALA se realiza a partir de glicina y succinil Co A, o de glicina y ácido succínico con la presencia de diferentes factores necesarios para el proceso como ser fosfato de pyridoxal, Mg^++, Co A, oxígeno, etc. El mecanismo por el cual se realiza este proceso, también es comentado en este trabajo. La enzima encargada de llevar a cabo esta reacción es la ácido delta amino levúlico sintetasa (ALAS) y se encuentra presente en la fracción mitocondrial de los eritrocitos y de otras células, como así tambien en la fracción sobrenadante de centrifugar a 100.000 x g las partículsubcelulares de las bacterias fotosintéticas Rhodopseudomonas spheraides. Se hace mención a algunos metabolitos activadores e inhibidores de esta enzima. La ácido delta amino levúlico dehidrasa (ALAD), es la enzima responsable de la conversión del ALA en PBG; es una enzima sulfhídrica típica y parece realizar los dos pasos necesarios para la unión de dos moléculas de ALA. El ciclo succinato-glicina es otro cacmino metabólico del ALA; dirigido por la ácido delta amino levúlico transaminasa (ALAT) enzima ésta que parece ser limitante de la síntesis de hemo, y que está presente en las células de los tejidos con altas velocidades de metabolismo de ácidos nucleicos, como los eritroblastos de la médula ósea. En 1952 comienzan a publicarse los primeros trabajos sobre porfiria experimental en los Estados Unidos, bajo la dirección de Watson. Desde entonces, distintos grupos de investigadores han encarado el estudio de este tópico desde enfoques diferentes, que son comentados en este trabajo. Con el acopio de ideas que estos grupos de investigación exponen hasta 1960, en la Cátedra de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales se plantea un trabajo sobre porfiria experimental, para estudiar en detalle el cuadro químico correspondiente a las porfirinas y precursores. Utilizando métodos más exactos y específicos que en los trabajos anteriores, se estudia la excreción urinaria de ALA (por primera vez hasta entonces en porfiria experimental), PBG y porfirinas en animales sometidos a la porfiria experimental. También se encara el estudio comparativo de la incorporación de glicocola 2-C^14 en proteínas de homogenatos de hígados normales y porfíricos, basándonos en observaciones de Schwartz y colaboradores sobre la disminución de la catalasa hepática en animales porfíricos. Se realiza el estudio experimental de los métodos de valoración del ALA. Se estudia exhaustivamente el método de las resinas de intercambio iónico que permite separar PBG y ALA de orina, pasando ésta simultáneamente por una resina aniónica Dowex 2 que retiene el PBG y una catiónica fuerte, Dowex 50 que retiene el ALA. Este es eluído de la resina y convertido en el compuesto 2 metil-3 acetil-4 (3 ácido propiónico) pirrol mediante una síntesis de Knorr con acetil acetona a pH 4,6. Este derivado pirrólico se reconoce luego colorimétricamente mediante el reactivo de Ehrlich con para dimetil amino benzaldehido (DMAB) en medio fuertemente ácido. Se ensayan distintos tipos de reactivos de Ehrlich, adoptandose el llamado reactivo de Ehrlich modificado con DMAB y ácido perclórico (2N) en medio acético glacial. La reacción de Ehrlich se produce con todos los derivados pirrólicos con una posición alfa libre, y se comenta su mecanismo y los distintos factores que influyen para lograr condiciones óptimas de reacción. Se determina la curva de absorción para el compuesto coloreado resultante de la reacción de Ehrlich con el 2 metil-3 acetil-4 (3 ácido propiónico) pirrol y se calcula su coeficiente de extinción molar. Se estudian las características y preparación de las resinas especialmente de Dowex 50, determinándose las curvas de saturación y de elución del ALA frente a esta resina. Se realizan ensayos de recuperación de ALA de soluciones standard de concentración conocida y de orinas normales y porfíricas. De soluciones standard se recupera alrededor del 90% y de orinas humanas y de conejos porfíricos alrededor del 80% y 90% respectivamente. El ALA puede ser valorado también mediante una reacción con pricato alcalino, con el que forma un compuesto coloreado hasta hoy desconocido. Se estudia el método original debido a Shuster, y las posteriores modificaciones introducidas por otros autores, determinándose el coeficiente de extinción molar para el compuesto resultante de una de las modificaciones al método. El ALA fue identificado por dos métodos diferentes de cromatografía sobre papel. Las experiencias de porfiria experimental fueron realizadas sobre ratas Wistar machos, de un peso aproximado a los 400 g y sobre conejos de ambos sexos cuyo peso oscilaba entre los 1700 y 2700 g. Los animales fueron drogados diariamente por vía intragástrica o parenteral según se describe, con Sedormid (alil isopropil acetil carbamida) o con ALA (alil isopropil acetamida). Mediante el suministro de estas drogas de indujo a los animales un estado que mimetiza a la porfiria aguda. Se describen los métodos de identificación y dosaje de porfirinas, como la purificación de las mismas por cromatografía de adsorción sobre carbonato de calcio de sus ésteres metílicos. Se emplean métodos de cromatografía sobre papel de ésteres metílicos de porfirinas y de porfirinas libres, previa hidrólisis y descarboxilación de los primeros. Se aislan profirinas de algunos órganos de estos animales. Se encara también, como ya se mencionó el estudio comparativo de la incorporación de glicina -2-C^14 en las proteínas de hígados normales y porfíricos, con el objeto de determinar si la disminución de la catalasa hepática es debida o no a una síntesis disminuida de las proteínas totales del hígado en los casos de porfiria experimental. De los estudios relacionados con la porfiria experimental puede inferirse los siguiente: a) Las ratas porfíricas registran una excreción urinaria ALA grandemente incrementada con respecto a las uro- y coproporfirinas. Los conejos porfíricos, en cambio, presentan un gran ALA, y cantidades significativas de uroporfirina. b) El cuadro químico presentado por ambas especies de animales en el mismo, ya sea que hayan sido tratados con A.I.A o Sedormid. Los resultados obtenidos coinciden con los de otros autores. La mayor parte de las uro- y coproporfirinas excretadas son del tipo isomérico III y también se han encontrado cantidades proporcionales de porfirinas hepta, hexa y pentacarboxílicas. La totalidad de la fracción heptacarboxílica está formada por firiaporfirina III. Con estos resultados podría explicarse la elevada producción de compuestos pirrólicos producidos en la porfiria experimental, postulando una hipótesis que considera la biosíntesis exagerada de ALA como responsable de la mayor producción de pirroles. La acumulación de ALA, por un mecanismo de "Feed back" positivo originaría un incremento en la biosíntesis de PBG Y PORFIRINAS. De los estudios relacionados con la biosíntesis de proteínas marcadas en animales normales y porfíricos no se puede sacar mayores conclusiones, pues presentan resultados algo inciertos. Ello podría deberse a la existencia de un pool diferente de glicina en los homogenatos individuales de cada experiencia. Esta glicina podría preexistir o sintetizarse durante la experiencia. En definitiva, se concluye que existe gran similitud entre la porfiria experimental y la porfiria aguda humana y que el principal error metabólico se debe a una biosíntesis exagerada de precursores. Aclaración- La mayor parte de estas experiencias fueron realizadas en colaboración con el Dr Horacio Tigier y figuran en parte en su trabajo de tesis titulado "Metabolismo del porfobilinógeno".

Fil:Egidy, Giorgia Anna Rosa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.