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1) La levadura Saccharomyces Cerevisiae incorpora al formato-C^14. El agregado de un segundo sustrato aumenta la radioactividad fijada; el más efectivo es la glucosa, y le siguen en orden el acetaldehído, ácido pirúvico y ácido acético. En la fracción metanólica la sustancia más radicactiva es la serina (40-70%), salvo en la incubación con formato-C^14 sólo. Se marcan también las bases púricas de los ácidos nucleicos y las proteínas; en el hidrolizado de estas últimas, la serina contiene el mayor porcentaje del C^14 incorporado. El formato C^14 se oxida en parte a C^14O2, mucho más en ausencia de otro sustrato. 2) La incorporación del formato-C^14 medida por el C^14 fijado depende de la concentración y actividad específica del mismo; una mayor concentración la favorece, y se traduce en un aumento de la radioactividad en los metabolitos solubles en metanol y en los ácidos nucleicos. 3) Las cinéticas realizadas con células de levadura en reposo y proliferativas, con y sin el agregado de otro sustrato, demuestran que la incorporación de formato aumenta con el tiempo de incubación. La distribución del C^14 en las distintas fracciones a lo largo del tiempo cambia. Inicialmente el mayor porcentaje corresponde a las sustancias solubles en metanol, el que va disminuyendo a medida que aumenta la incorporación de C^14 en los ácidos nucleicos y en las proteínas, en las que se acumula. 4) En iguales condiciones, la levadura fija más formato-C^14 que carbonato-C^14. Con el primero la sustancia soluble en metanol más marcada es la serina, que no aparece en cambio con el segundo. En presencia de glucosa la serina mantiene el porcentaje de radioactividad incorporada a la fracción soluble en metanol. En ausencia de ésta, desciende al mismo tiempo que aumenta en el ácido glutámico. El bicarbonato-C^14, asimismo, no marca los ácidos nucleicos ni las proteínas. 5) Durante la incorporación de formato el carbono β de la serina concentra la casi totalidad del C^14. Con el tiempo se marca tambien el α. La serina sería el primer compuesto de condensación del formato-C^14 dentro de la célula producido por formilación de la glicina. 6) Ka seruba-3C^14 es incorporada en mayor proporción que el formato-C^14, y se traduce en una mayor radioactividad en todas las fracciones. En presencia de glucosa y seruba-3C^14, la incorporación de C^14 a la serina, que es inicialmente el metabolito soluble en metanol más marcado, desciende para dar lugar a un aumento en el porcentaje de C^14 en el ácido glutámico. 7) La presencia de glucosa acentúa el efecto de inhibidores enzimáticos y antibióticos sobre la incorporación del formato-C^14 por la levadura. La azida, el fluoruro y la hidroxilamina producen disminución en la fijación de C^14. La azida y el fluoruro afectan notablemente la incorporación a proteínas. El dinitrofenol y la antimicina afectan tanto a las proteínas como a los ácidos nucleicos. El actidione inhibe totalmente la incorporación a las proteínas.

La Terapia Fotodinámica del cáncer (TFD) es un tratamiento que se basa en la acumulación selectiva de un fotosensibilizante en las células tumorales. Este, luego de ser excitado por acción de la luz roja, desencadena una serie de reacciones mediadas por radicales libres, que finalmente destruyen el tejido. El empleo del ácido 5-aminolevúlico (ALA) como precursor de la síntesis de porfirinas, ha cobrado especial interés en los últimos años tanto en la TFD usando las porfirinas como fotosensibilizantes, como en la fotodetección de tumores, empleando la propiedad de estos pigmentos de fluorescer con la luz UV. Por otra parte, se ha observado que algunos tejidos neoplásicos acumulan porfirinas, por lo cual se ha postulado que el camino biosintético de los tetrapirroles se encuentra alterado en los pacientes con neoplasias. En el presente trabajo se caracterizaron las actividades de algunas de las enzimas del camino biosintético del hemo en un adenocarcinoma mamario de ratón y en el hígado de los animales portadores de dicha neoplasia. Se estudió la biosíntesis de porfirinas in vitro a partir de ALA en tumor y otros tejidos, empleando para ello la técnica de explantes tisulares, y se encontró que la acumulación de porfirinas se hace más selectiva para el tumor cuando el precursor se administra encapsulado en liposomas o cuando se agrega cinc en el medio de incubación. Se desarrolló un modelo in vitro-in vivo para estudiar la efectividad de la acción fotodinámica de las porfirinas sintetizadas endógenamente a partir de ALA, en el cual se monitorea el crecimiento de los tumores irradiados, luego de su reimplantación en animales receptores. Se encontró que los explantes incubados 2 hs con ALA, y que por lo tanto sintetizaron 4,6 (g de porfirinas/g tej., al ser irradiados sufrieron una reducción desde un 60% de la masa tumoral, hasta la falta completa de crecimiento del tumor en el ratón receptor. Además se observó una correlación entre el nivel de porfirinas acumuladas y el daño celular. El mismo modelo fue utilizado para investigar la efectividad del daño fotodinámico inducido por ALA en combinación con los antineoplásicos 5-Fluorouracilo, Ciclofosfamida y Doxorubicina.. Se encontró un aumento en la eficacia de la TFD, cuando se emplearon Ciclofosfamida y Doxorubicina; no así cuando se usó 5-Fluorouracilo. Con nuestro modelo in vitro-in vivo se ha demostrado que ocurre una importante y hasta una completa destrucción de las células tumorales mediante la combinación de la síntesis endógena de porfirinas a partir de ALA y un tratamiento lumínico de baja potencia. Los resultados presentados en este trabajo indican que el empleo del ALA en la detección temprana de las células alignas y en la TFD es sumamente prometedor. Nuestros hallazgos plantean también la posibilidad del uso combinado de antineoplásicos con la TFD inducida por ALA.

La primera parte de este trabajo de tesis es de caracter bibliográfico y consiste en una puesta al día acerca de los estudios realizados sobre porfobilinógeno (PGB) y porfiria experimental, desde las primeras observaciones de Sachs, hasta los trabajos de los grupos de Watson; Aldrich de Labbe; Rimington; Bénard, Gajdos & Gajdos-Torok y otros laboratorios en el período que va desde 1931 hasta los primeros meses de 1960 (1 al 74).- En la segunda parte del segundo trabajo, se ha realizado un estudio experimental exhaustivo de la metodología relacionada con el PBG. Se ha adaptado el método de aislamiento de PBG de orina porfirica descripto por Cookson & Rimington (24), así como distintas técnicas de identificación y valoración cuantitativa de PBG (forma cristalina, cromatografía en papel, determinaciones espectrofotométricas y comportamiento frente a resinas de intercambio iónico). Se determinaron coeficientes de extinción molar específica con distintos reactivos de Ehrlich y con material cristalino aislado de orina porfírica; los valores obtenidos coínciden con los de la literatura (27 y 28). Se han estudiado las condiciones óptimas de absorción, elución y recuperación de soluciones puras de PBG, o mezclado previamente , con orinas normales y porfíricas; en columnas de resina de intercambio Dowex 2, empleadas en la técnica de Mauserall & Granick (28). Se ha encontrado como dato interesante que, aún con cantidades del orden de 1 mg de PBG absorbido en la columna, no se llega al punto de saturación, trabajando las condiciones descriptas por los autores arriba citados. En la tercera parte se han realizado estudios relativos al dosaje cuantitativo de ácido delta amino leválico (δAL), PBG y porfirinas en orina de ratas y conejos sometidos a la porfiria experimental, mediante el suministro de alil isopropil acetamida (AIA) o Sedormid (Alil isopropil acetil carbamida) y en orina de una paciente afectada de porfiria aguda. Para tal fin se han aplicado técnicas descriptas por Mauzeral & Dranick (28), Schwartz, Zieve & Watson (75) y otros autores (76, 77, 78). Además se ha efectuado una identificación de los distintos tipos de porfirinas urinarias que se excretan en porfiria experimental y aguda, aplicando técnicas cromatográficas en columna y papel descriptas por Watson, Falk & Benson y otros autores con algunas modificaciones introducidas en nuestro laboratorio (37, 78, 79, 80, 81 y 82). En estos estudios se han obtenido los siguientes resultados: 1°: Tanto en las ratas como en los conejos llama la atención la gran desproporción en los aumentos de δAL y PBG, con respecto a los uro- y coproporfirina, aunque la excreción de δ AL en los conejos estuvo por debajo de la de las ratas. Además en los primeros se notó una mayor excreción de uroporfirinas que en las segundas. 2°: El cuadro químico ofrecido por la administación de AIA en ambas especies de animales, resultó prácticamente similar al producido por Sedormid. 3°: La medición comparativa de PBG por el método de Vahquist (6), con la técnica de las recisas descriptas por Mauserall & Granick (28), ha demostrado que los resultados obtenidos por el método directo pueden dar errores por exceso hasta de un 100%. Además conviene hacer notar que los estudios realizados en la fracción "uroporfirina" fueron hechos en orina sin precalentar, a diferencia de los efectuados por otros autores. Los resultados obtenidos son coincidentes con los comunicados por Abbet y Rudolph (94) en 1961 y discrepan con los de Stich (73) que sugiere una diferencia entre la porfiria aguda humana y la porfiria experimental, basada en los distintos niveles de excreción de δAL. Con respecto al tipo de las distintas porfirinas encontradas en la orina, tanto porcedentes de porfiria experimental como del caso humano se ha demostrado que la mayor parte de la uro-y coproporfirinas de 7, 6 y 5 carboxilos. La de siete carboxilos fue identificada como firiaporfirina III (37) cuyo porfirinógeno se considera precursor metabólico de la protoporfirina IX según Batlde & Grinstein (95) Todo este conjunto de resultados pueden ser interpretados mediante una hipótesis que considera la biósintesis exagerada de δAL, como responsable de la mayor producción de compuestos pirrólicos observada en la porfirina aguda. La acumulación de δAL favorecería una mayor formación de PBG, através de un mecanismo de la actividad enzimática; en este caso sobre la dehidrasa del δAL. Esto se realizaria por un mecanismo similar al que se distingue como "feed back" positivo (Davidson, 1960) (107). Los aumentos registrados en la escreción de porfirinas podrían de acuerdo con los resultados de Gibson (1955) (96), que encuentran una mayor actividad de la dehidrasa de δAL en hígado de conejo tratado con Sedormid, y de Scott (1955) (97), que constata que en porfirias agudas humanas la transformación de δAL en PBG es más rápida. Las variaciones que se pueden observar en uro. y coproporfirinas pueden deberse a diferencias de actividad de las enzimas que regulan su aparición o a diferentes niveles de su velocidad de excreción. En una rata porfirica a la que se le suministro glicocola, ácido sucéinico y algunos cofactores, entre los que se encontraba ATP, se hallo una disminución en la eliminación de porfirinas y precursores. Este hecho no tiene una explicación muy clara pero como los últimos tiempos se ha encontrado AMP (Bénard, Gajdos-TOROK & Gallistin) (98) y la inosina (Lottafeldt, Labbe & Aldrich) (99) producen un descenso en los niveles de excreción de porfirina y precursores; esta disminución podria explicarse como un efecto del ATP. En la cuarta parte de este trabajo se han efectuado determinaciones de actividad enzimática de cítrico deshidrogenasa, málico deshidrogenasa, glutámatico deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa en polvos acetónicos de hígado de ratas y plasma de conejos normales y sometidos a la porfiria experimental, no encontrándose alteraciones significativas de las mismas (85 al 93). Esto aparentemente excluiría la posibilidad de que una formación anormal de succinil CoA fuera la responsable de la biosisntesis exagerada de δAL y PBG. Por otra parte como conclusión general, se confirma una vez más la similitud de la porfiria experimental con la porfiria aguda humana, como ya fuera señalado en anteriores trabajos.- Finalmente, en el apéndice, se hace una puesta al día de las últimas investigaciones en el campo de la porfiria experimental en los últimos dos años (98 al 106)

Muchas bacterias son capaces de moverse en forma autopropulsada tanto en medio líquido como semisólido, siendo la natación o swimming uno de los tipos de movimiento más estudiados. Para este tipo de movimiento se requieren unos apéndices llamados flagelos, estructuras filamentosas que protruyen del cuerpo de la bacteria y se caracterizan por tener una longitud de varias veces la de la célula. Es mediante la rotación de estos filamentos que la bacteria puede nadar alcanzando velocidades de hasta 30 μm.seg−1. La rotación de estos flagelos es producida por un motor celular inserto en la membrana de la bacteria, que rota gracias a un flujo de protones desde el periplasma hacia el citoplasma. El flujo de protones en los motores celulares es posible gracias a una diferencia de potencial de protones en este sentido, al que llamaremos p. El potencial p se mantiene por la translocación de protones desde el interior de la bacteria hacia el exterior en la cadena de transporte de electrones (CTE). Este potencial es utilizado también para la síntesis de ATP, metabolito que interviene en múltiples reacciones bioquímicas, y es conocido como moneda de energía de la célula. Entonces, una bacteria que posee flagelos debe administrar p entre la síntesis de ATP y el movimiento de los flagelos. En este sentido construimos un modelo basado en la quimiosmótica y la termodinámica de no-equilibrio que relaciona el consumo de O2 en la CTE con la formación de ATP y el flujo de protones a través de los motores flagelares, para estudiar la contribución de p en uno u otro proceso. Como resultado, observamos que al incrementarse el número de flagelos manteniendo constante la tasa de consumo de ATP, se incrementa la tasa de consumo de O2, siendo estos procesos dependientes de la regulación de la relación NADH/NAD+. Bradyrhizobium diazoefficiens utiliza para nadar dos sistemas de flagelos: el flagelo subpolar y los flagelos laterales, ambos son activados por p. El primero es constitutivo y los segundos se inducen en ciertas fuentes de carbono (como L-arabinosa) y en otras no (como D-manitol). Para estudiar los parámetros energéticos de B. diazoefficiens con relación a la presencia de los flagelos laterales, realizamos cultivos en biorreactor de la cepa salvaje y de una mutante carente de flagelos laterales. Observamos que en la cepa salvaje la tasa de consumo de O2 era tres veces mayor con L-arabinosa que con D-manitol, en concordancia con la predicción del modelo matemático. Por su parte, el mutante no mostró diferencias entre los cultivos con L-arabinosa o D-manitol, corroborando que la diferencia en la tasa de consumo de O2 se debió a la actividad de los flagelos laterales. También realizamos una comparación del proteoma de cultivos de la cepa salvaje en L-arabinosa o D-manitol, de lo cual dedujimos que estos dos azúcares se oxidan por rutas muy diferentes. La L-arabinosa se oxida por la ruta L-KDA (similar a la de Entner-Doudoroff) seguida de la oxidación de oxalato, mientras que el D-manitol primero debe ser oxidado a D-fructuosa y luego pasa por la ruta de las pentosas-fosfato o el ciclo de Calvin-Benson-Bassham. Estas diferentes rutas podrían arrojar rendimientos energéticos distintos los cuales podrían explicar por qué en una fuente de carbono la bacteria puede mantener estructuras tan costosas como los flagelos laterales y en la otra no. Sin embargo, nuestras observaciones indicaron que el rendimiento energético de ambas rutas es similar, con lo cual la diferencia en la tasa de consumo de O2 parece ser más una consecuencia que la causa de la expresión diferencial de los flagelos laterales en L-arabinosa. Curiosamente, los cultivos en D-manitol expresaron diferencialmente la ribulosabisfosfato- carboxilasa-oxigenasa (RuBisCO) y la ribuloquinasa, indicando que en esas condiciones estaría activo el ciclo Calvin-Benson-Bassham. Para determinar en qué podría requerirse la actividad RuBisCO, obtuvimos un mutante delecional en cbbL, que codifica la subunidad catalítica de dicha enzima, y observamos que la mutación produjo defectos en el crecimiento y en la competitividad para nodular raices de soja.

Muchas bacterias son capaces de moverse en forma autopropulsada tanto en medio líquido como semisólido, siendo la natación o swimming uno de los tipos de movimiento más estudiados. Para este tipo de movimiento se requieren unos apéndices llamados flagelos, estructuras filamentosas que protruyen del cuerpo de la bacteria y se caracterizan por tener una longitud de varias veces la de la célula. Es mediante la rotación de estos filamentos que la bacteria puede nadar alcanzando velocidades de hasta 30 μm.seg−1. La rotación de estos flagelos es producida por un motor celular inserto en la membrana de la bacteria, que rota gracias a un flujo de protones desde el periplasma hacia el citoplasma. El flujo de protones en los motores celulares es posible gracias a una diferencia de potencial de protones en este sentido, al que llamaremos p. El potencial p se mantiene por la translocación de protones desde el interior de la bacteria hacia el exterior en la cadena de transporte de electrones (CTE). Este potencial es utilizado también para la síntesis de ATP, metabolito que interviene en múltiples reacciones bioquímicas, y es conocido como moneda de energía de la célula. Entonces, una bacteria que posee flagelos debe administrar p entre la síntesis de ATP y el movimiento de los flagelos. En este sentido construimos un modelo basado en la quimiosmótica y la termodinámica de no-equilibrio que relaciona el consumo de O2 en la CTE con la formación de ATP y el flujo de protones a través de los motores flagelares, para estudiar la contribución de p en uno u otro proceso. Como resultado, observamos que al incrementarse el número de flagelos manteniendo constante la tasa de consumo de ATP, se incrementa la tasa de consumo de O2, siendo estos procesos dependientes de la regulación de la relación NADH/NAD+. Bradyrhizobium diazoefficiens utiliza para nadar dos sistemas de flagelos: el flagelo subpolar y los flagelos laterales, ambos son activados por p. El primero es constitutivo y los segundos se inducen en ciertas fuentes de carbono (como L-arabinosa) y en otras no (como D-manitol). Para estudiar los parámetros energéticos de B. diazoefficiens con relación a la presencia de los flagelos laterales, realizamos cultivos en biorreactor de la cepa salvaje y de una mutante carente de flagelos laterales. Observamos que en la cepa salvaje la tasa de consumo de O2 era tres veces mayor con L-arabinosa que con D-manitol, en concordancia con la predicción del modelo matemático. Por su parte, el mutante no mostró diferencias entre los cultivos con L-arabinosa o D-manitol, corroborando que la diferencia en la tasa de consumo de O2 se debió a la actividad de los flagelos laterales. También realizamos una comparación del proteoma de cultivos de la cepa salvaje en L-arabinosa o D-manitol, de lo cual dedujimos que estos dos azúcares se oxidan por rutas muy diferentes. La L-arabinosa se oxida por la ruta L-KDA (similar a la de Entner-Doudoroff) seguida de la oxidación de oxalato, mientras que el D-manitol primero debe ser oxidado a D-fructuosa y luego pasa por la ruta de las pentosas-fosfato o el ciclo de Calvin-Benson-Bassham. Estas diferentes rutas podrían arrojar rendimientos energéticos distintos los cuales podrían explicar por qué en una fuente de carbono la bacteria puede mantener estructuras tan costosas como los flagelos laterales y en la otra no. Sin embargo, nuestras observaciones indicaron que el rendimiento energético de ambas rutas es similar, con lo cual la diferencia en la tasa de consumo de O2 parece ser más una consecuencia que la causa de la expresión diferencial de los flagelos laterales en L-arabinosa. Curiosamente, los cultivos en D-manitol expresaron diferencialmente la ribulosabisfosfato- carboxilasa-oxigenasa (RuBisCO) y la ribuloquinasa, indicando que en esas condiciones estaría activo el ciclo Calvin-Benson-Bassham. Para determinar en qué podría requerirse la actividad RuBisCO, obtuvimos un mutante delecional en cbbL, que codifica la subunidad catalítica de dicha enzima, y observamos que la mutación produjo defectos en el crecimiento y en la competitividad para nodular raices de soja.

Fil:Carrizo, Patricia H.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Muchas formas de vida han desarrollado mecanismos para resistir al desafío impuesto por las especies reactivas del oxígeno, o para utilizar estas especies con fines regulatorios o de señalización. En los parásitos tripanosomátidos, el metabolismo redox constituye una compleja red dependiente fundamentalmente de tripanotión, aunque otros tioles como la glutationil espermidina y el glutatión también están presentes. En esta tesis, se aborda la caracterización de proteínas redox de Trypanosoma cruzi, y la dependencia de las mismas con el glutatión. Se presenta el estudio de una glutationil espermidina sintetasa, a través del análisis cinético de la proteína recombinante. El análisis de la expresión de esta proteína permitió concluir sobre su ocurrencia en el estadio replicativo del parásito en el huésped. Se presentan también estudios realizados con el objetivo de caracterizar funcionalmente dos glutarredoxinas presentes en el parásito: una monotiólica (formando parte de una proteína multidominio), y una ditiólica. Mediante ensayos cinéticos se pudo establecer la capacidad de estas proteínas como mediadores en la reducción de diversos sustratos y la utilización de diversos sistemas reductores, como los dependientes de tripanotión y glutatión, de relevancia fisiológica en el parásito. Mediante técnicas basadas en la inmunodetección, fue posible establecer localización subcelular de estas proteínas en T. cruzi. El análisis funcional empleando cultivos del parásito permitió poner de manifiesto los posibles roles que podrían cumplir la glutarredoxina ditiólica en procesos vinculados con el ciclo de vida del tripanosoma. Los resultados presentados en esta tesis aportan al conocimiento sobre la biología redox en este parásito.

Se estudió la suplementación energética contrastante en carbohidratos: grano de maíz (MZ; almidón) vs. cascarilla de soja (CS; hemicelulosa y celulosa), sobre la biohidrogenación ruminal (BH) de los ácidos grasos (AG) de cadena larga, el microbioma y la calidad de la leche de ovejas en un sistema de base pastoril. En el experimento I se evaluó el consumo (CMS), la digestibilidad (DMS) y la producción (PL), composición química y perfil de AG de leche de ovejas consumiendo raigrás (50:50 F:C). Se utilizaron diez ovejas lecheras (30 DEL; 65.8 ± 8.67 kg de PV) en un DCA con medidas repetidas, con dos tratamientos: CS o MZ (14 d de adaptación y 3 semanas de medición). Los resultados fueron analizados por ANVA con un procedimiento de modelos mixtos (animal como efecto aleatorio y el tratamiento, semana y la interacción como efectos fijos) y las medias comparadas por Tukey (α= 0,05). El CMS y de forraje y digestibilidad de FDA fue superior en CS, aunque la DMS fue mayor para MZ (P menor a 0.05). La PL fue un 24% superior en CS (aunque sin diferencias estadísticas), con mayores contenidos de omega-3 y PUFA (P menor a 0.05). En el experimento II, se evaluaron las variables de ambiente ruminal y perfil de AG en rumen. Se utilizaron seis ovejas lecheras con cánula ruminal (78,19 ± 13,53 kg de PV), en un diseño cross-over 2x3, bajo la misma dieta y tratamientos que en I. Sobre muestras de licor ruminal (08:00, 12:00, 16:00, 20:00, 00:00 y 04:00 hs) se determinó pH, nitrógeno amoniacal (N-NH4) y ácidos grasos volátiles (AGV). Los resultados fueron analizados igual que en I para un cross-over. La relación Ac:Prop, el N-NH4 y el pH ruminal fueron mayores en CS (P menor a 0.05). El trans-11 y el C18:1cis-9 fueron superiores en CS (P menor a 0.05) y el C18:2 y C18:2 cis-9, trans-11 CLA tendieron a ser mayores en MZ (mayor consumo de linoleico; P menor a 0.05). El C18:2 trans-10, cis-12 CLA tendió a ser superior en CS (0,14 vs. 0,09 g/100g AG) (P menor a 0.1). El análisis de microbioma ruminal se hizo a través de la secuenciación de la región V4 del gen 16S rRNA (bacterias y archaeas) de 18 muestras del Exp. II, utilizando plataforma Illumina MiSeq. Se identificaron 20 phylum bacterianos, lo más abundantes fueron Firmicutes y Bacteroidetes (RA; 54,86% y 34,81% en CS y 69% y 21,15% en MZ; P menor a 0.05) y 90 asignaciones taxonómicas (mayor RA: Clostridiales, Prevotella, Bacteroidales, Methanobrevibacter, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Butyrivibrio, Ruminococcus, Coprococcus, Treponema y Methanosphaera). Sólo 23 difirieron entre dietas y Ruminococcus, Butyrivibrio y Shuttleworthia fueron superiores en MZ (P < 0.05). Estos dos estuvieron correlacionados entre sí y con el cis-9, trans-11 CLA (P menor a 0.01; r=0.79) y con el trans-10, cis-12 CLA se correlacionó Blautia en CS (P menor a 0.01; r=0.84). La suplementación con CS resultó en mayor PL y % de grasa, con un perfil más saludable. La BH difirió entre suplementos, posiblemente por la composicion del microbioma. Las correlaciones entre AG y ciertos géneros entre sí podrían contribuir a dilucidar la composicion bacteriana de los llamados “grupos A y B” del proceso de BH.

Las poliaminas son policationes orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular, ampliamente distribuidos en todos los seres vivos, que participan en numerosos procesos metabólicos y fisiológicos. Si bien estos compuestos tienen una importante participación en la proliferación celular, no se conoce su papel fisiológico exacto. Una de las tres estrategias fundamentales para determinar las posibles funciones de las poliaminas en los seres vivos es el estudio de las alteraciones que se producen en celulas u organismos que carecen o tienen disminuido el contenido endógeno de poliaminas, siendo por diversas razones la mejor estrategia. Se han desarrollado dos sistemas para disminuir el contenido endógeno de estos policationes: 1.-la utilización de inhibidores dc la biosíntcsis de poliaminas y 2.- la obtención de mutantes auxótrofas para estas bases orgánicas. El uso de las mutantes constituye una muy buena herramienta de trabajo y ha permitido determinar algunos de los papeles fisiológicos de las poliaminas en los seres vivos. La levadura Saccharomyces cerevisiae es un excelente modelo para el estudio de la bioquímica y de la biología celular y molecular en eucariotes. En los últimos años se han aislado mutantes de este organismo auxótrofas para poliaminas^21,32,33,116, pero han sido poco estudiadas y nos permitirían determinar los papeles fisisológicos de estos compuestos en la proliferación celular. Estas mutantes crecen deficientemente^32,33,116, no pueden esporular^32, no mantienen el plásmido "killer"^118 y tienen alterado el transporte de colina^33. En el presente trabajo se utilizó la cepa de levaduras S.cerevisiae 179-5 auxótrofa para poliaminas obtenida por Hosaka et al^33. El estudio de las alteraciones que se producen en ausencia de estos policationes permitió asignarles nuevas funciones en este organismo. Hemos encontrado que se producen una serie de deficiencias en ausencia de poliaminas, además de las descriptas previamente^32,33,116,118. a.- La síntesis de macromoléculas, ADN, ARN, y proteínas está disminuida, recuperándose primero la síntesis proteica por reagregado de poliaminas. b.-Los ribosomas se encuentran disociados, siendo el índice de asociación dependiente del grado de ayuno; muestran además una mayor sensibilidad al efecto disociante de la presión hidrostática durante la corrida. Además, responden menos al efecto asociante del catión Mg²+; el catión monovalente K+, por el contrario, los disocia más facilmente. El agregado in vitro de poliaminas no altera el equilibrio de subunidades ribosomales. También se observan alteraciones en los polisomas, hay una menor proporción de monosomas involucrados en la síntesis proteica y aparecen estructuras denominadas "halfmers" que son acúmulos de la subunidad 40S sobre el ARNm. Todas estas evidencias demuestran por primera vez un papel fisiológico de las poliaminas en el ensamblado y/o biogénesis del ribosoma eucariótico, previamente hallado en procariotes. c.- La pared celular se vuelve más resistente al ataque de diversas enzimas líticas, dependiendo del grado y tiempo de ayuno de los cultivos. La lisis producida por estas enzimas aumenta parcialmente por agregado de distintos agentes que favorecen su acceso al sustrato, que es la capa más interna de glucano β1-3. La composición química de la pared se encuentra alterada, pues disminuye drásticamente la cantidad de glucano β1-3, aumentan ligeramente las manoproteínas y se incrementa moderadamente el glucano β1-6. La estructura de la pared celular, analizada por microscopía electrónica, no es homogénea, es de mayor espesor y aparecen microcuerpos electrodensos dentro de la misma de probable origen ciloplasmático. Por lo tanto, se pudo ver que las poliaminas participan en la síntesis y/o estructura de la pared celular, siendo la primera vez que se describe este papel para estos compuestos. d.- Se observaron por microscopía de contraste de fase y electrónica una serie de cambios morfológicos en la célula que sugieren que las poliaminas participan y/o regulan algunos de los eventos específicos del ciclo celular. Los cultivos se arrestan en fase G1, como organismos no brotados, pero un porcentaje (5-15%) posee multibrotaciones, algunas de ellas en sitios anormales. Las células son más grandes, lo que se confirmó por análisis de los tamaños de poblaciones celulares con un Coulter Analyzer. Además, utilizando un colorante fluorescente específico para ADN que tiñe los núcleos celulares, se observaron alteraciones en la mitosis. La septación también se encuentra alterada como se observa por microscopía electrónica.

Fil:Cataldi, Angel Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.