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Los xenobióticos, son compuestos de naturaleza química muy variada, que se encuentran en el medio ambiente de forma natural o surgen como resultado de la actividad humana. Los organismos vivos se encuentran constantemente expuestos a una gran variedad de estos compuestos, que al ingresar al organismo, se distribuyen en los distintos compartimentos pudiendo ser metabolizados y/o acumulados (Kovacic y Somanathan, 2009; Bhattacharya y Keating, 2011; Lima y col., 2011). Estos compuestos son generalmente apolares y lipofílicos, característica que les permite atravesar con facilidad las membranas biológicas, imposibilitando su excreción por orina o heces y acumulándose en tejidos grasos. Por esto, suelen sufrir procesos de biotransformación, o metabolización, generando metabolitos más hidrosolubles, que facilitan su eliminación. La biotransformación es definida entonces como la suma de todas las reacciones químicas que alteran la estructura, solubilidad en agua y eventual distribución de endo- y xenobióticos. Los organismos biológicos poseen sistemas enzimáticos que catalizan estos procesos de biotransformación que procuran disminuir la toxicidad global de los xenobióticos, aunque en algunos casos se generan intermediarios aún más tóxicos o activos (Martinez-Cabot y col., 2005; Zhou y col., 2007). Las reacciones de biotransformación han sido clasificadas en: reacciones de fase I (como aquellas catalizadas por el sistema de citocromo P450 -CYP-); y reacciones de fase II (catalizadas por familias de enzimas denominadas: glutation- S-transferasas -GST- y uridín-difosfo-glucuronosiltransferasa -UGT-, entre otras). Por otra parte, la magnitud de acumulación de una droga y/o sus metabolitos, en un determinado tejido, es frecuentemente limitada no tanto por su habilidad para entrar a la célula sino como su tendencia a dejarla. Esto está relacionado con los mecanismos de eflujo presentes en la membrana celular que juegan un rol crítico en limitar la absorción y acumulación de sustancias potencialmente tóxicas o de uso terapéutico, y que pueden conferir resistencia a esos compuestos. Se define entonces la fase III del metabolismo o la eliminación de endo- o xenobióticos y/o sus metabolitos, que está representada por los procesos de transporte. Los transportadores involucrados en los mecanismos de excreción de la fase III, son miembros de la familia de transportadores ABC que comprenden aquéllas proteínas denominadas MDR (del inglés: “multidrug resistance protein”, como P-glicoproteína, P-gp) y MRP (del inglés: “multidrug resistance-associated protein”, como la proteína asociada a resistencia a múltiples drogas 2, Mrp2), entre otros. Estos proveen una importante barrera contra la penetración de drogas y/o un eficiente mecanismo de eliminación (Mottino y col., 2000; Ayrton y Morgan, 2001; Chan y col., 2004). Luego del hígado, la mucosa gastrointestinal y la corteza renal son los tejidos más activos en la biotransformación y eliminación de compuestos tanto endógenos como exógenos (Rowland y Walter, 1983; Chhabra y Eastin, 1984). Si bien los sistemas de biotransformación y transportadores ABC se expresan diferencialmente en distintos tipos celulares (macrófagos, epitelios absortivos o secretores, etc.), esta expresión no es estática ya que las células tienen una remarcable capacidad para regular la cantidad de estas proteínas tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. El tratamiento con determinados compuestos es capaz de alterar la expresión y actividad de los mismos en distintos tejidos y con ello modificar su farmacocinética y biodisponibilidad, como así también la de drogas co-administradas que son también sus sustratos (Ibrahim y col., 2001). Por otra parte, la enfermedad de Chagas es una enfermedad endémica en América Latina, que afecta a 15 millones de personas (OMS, 2007, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/es/). En la Argentina y otros países endémicos, la única droga disponible para el tratamiento de la fase aguda de esta enfermedad es el benznidazol (BZL). Sin embargo, sus efectos tóxicos pueden llevar a suspender el tratamiento, con la consiguiente progresión de la enfermedad a la fase crónica. Además, uno de los mayores obstáculos en el éxito del tratamiento de enfermedades neoplásicas e infecciones por microorganismos o parásitos es el desarrollo de resistencia a multidrogas. Entre los mecanismos propuestos caben destacar la sobre-expresión y mayor actividad de sistemas enzimáticos de biotransformación de dichas drogas así como de proteínas transportadoras capaces de facilitar su excreción (o de sus metabolitos) (Catania y col., 2004). La resistencia a drogas tiene también un alto impacto en la quimioterapia de la enfermedad de Chagas, limitando las opciones al tratamiento e incrementando el número de tratamientos fallidos. Como antecedentes de nuestro grupo de trabajo, observamos que BZL induce la expresión y actividad de CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2 de manera dependiente de la concentración, en células HepG2 utilizadas como modelo de célula hepática (Rigalli y col., 2012). Sin embargo, hasta el presente no existe información concerniente a la expresión y actividad de sistemas de biotransformación y transportadores en un modelo in vivo y sus potenciales consecuencias en la farmacocinética de BZL o de drogas co-administradas. Por todo esto, en este trabajo de Tesis nos propusimos evaluar el impacto del pretratamiento con BZL (25; 50 y 100 mg/kg/día i.p., por 3 días consecutivos) sobre la expresión y actividad de proteínas involucradas en el metabolismo de Fase I (CYP3A), de Fase II (UGT1A, GSTs), eliminación (P-gp y Mrp2) y sobre la biodisponibilidad del propio BZL (evaluando la farmacocinética de una dosis testigo de BZL: 5 mg/kg, intraduodenal, pos-tratamiento). Observamos que el tratamiento con BZL incrementa el flujo biliar, sin alterar la velocidad de excreción biliar de glutation total ni GSSG, determinantes mayoritarios del flujo biliar independiente de sales biliares; permitiéndonos sugerir que el incremento observado en el flujo biliar podría deberse a la excreción biliar de metabolitos de BZL vía Mrp2 y/o P-gp. Además, las ratas tratadas con BZL presentan un leve aumento en los niveles de GPT sin alteraciones en la excreción biliar de bilirrubina, ni de niveles séricos de otras enzimas utilizadas como marcadores de daño hepático (LDH, FA, GOT). Al presente, poco es conocido sobre los efectos de BZL sobre los sistemas de biotransformación. En nuestro trabajo, el tratamiento con BZL produjo un aumento en la expresión de la familia de CYP3A (responsable de la primera etapa de biotransformación en hígado del 50 % de las drogas de uso clínico, Köhle y Bock, 2009), con un concomitante aumento en la actividad de CYP3A4. Por otro lado, mientras que la expresión de UGT1A no se vio alterada por BZL en ninguno de los tejidos analizados, observamos inducción de la expresión de GSTμ en hígado y GSTα en intestino, y de la actividad global, pudiendo ser un mecanismo compensatorio pre-sistémico contra derivados electrofílicos resultantes del metabolismo de BZL. Además de los sistemas de biotransformación, el incremento en la depuración de endo- y xenobióticos puede asociarse frecuentemente a altos niveles de expresión de proteínas transportadoras de eflujo, como P-gp y/o MRPs (Greiner y col., 1999; Fromm y col., 2000). Al evaluar el efecto de BZL sobre la expresión y actividad de P-gp y Mrp2, en órganos involucrados en la absorción y excreción de distintos fármacos que pudieran administrarse simultáneamente con BZL, observamos que el tratamiento de ratas Wistar macho adultas con BZL indujo un aumento en los niveles de expresión y actividad de ambos transportadores en hígado y yeyuno, no así en íleon ni en riñón. Estos resultados nos sugieren que la inducción de P-gp y Mrp2 en hígado, podría alterar la capacidad de excreción biliar de diversos compuestos y llevar a interacciones droga-droga a nivel hepático. Además, el sustancial incremento en los niveles de expresión y actividad de P-gp y Mrp2 observados en el intestino proximal podría llevar a un incremento en la secreción de sustancias presentes en la sangre o a una reducción de la absorción de drogas que son administradas oralmente, como el propio BZL. Estos resultados sugieren que bajo tratamiento con BZL, podrían ser observadas interacciones droga-droga, especialmente en los niveles de excreción, alterando las vías de depuración de compuestos endógenos y exógenos. El hecho de que el pre-tratamiento con BZL no haya producido alteraciones en la expresión de CYP3A, GST, P-gp y Mrp2 en riñón es desconocido, poniéndose en evidencia un efecto órgano-específico, mediado posiblemente por el receptor de pregnanos X, un receptor nuclear que regula la expresión tanto de enzimas de biotransformación de Fase I y Fase II como así también de transportadores de xenobióticos (Kliewer y col., 2002; Klaassen y Aleksunes, 2010;) y cuya expresión en riñón es baja en comparación con los otros tejidos (Kliewer y col., 1998). Adicionalmente, nos propusimos estudiar si las alteraciones en las proteínas transportadoras observadas podrían tener algún efecto sobre la biodisponibilidad de una dosis testigo de BZL (5 mg/kg) en ratas. Los parámetros farmacocinéticos de la dosis testigo de BZL calculados mostraron un aumento en la velocidad de eliminación plasmática (k) y una menor AUC plasmática en el grupo pre-tratado con BZL en comparación al grupo control, indicando un aumento en la depuración plasmática. Además, la Cmáx de BZL en plasma fue menor en los animales pre-tratados con BZL, sugiriendo una menor absorción intestinal de BZL. Cuando evaluamos la cantidad de BZL excretada por la vía biliar observamos un aumento significativo en este parámetro en animales pre-tratados con BZL en comparación a los animales controles. La cantidad de BZL excretada en orina fue similar entre ambos grupos experimentales, por lo sugerimos que el aumento en la depuración plasmática podría deberse al menos en parte debido a la vía biliar. Al observar además una disminución en la Cmáx alcanzada durante la administración de la dosis testigo de BZL en animales pre-tratados con BZL en comparación al grupo control, decidimos evaluar si la capacidad de absorción intestinal podría estar afectada estudiando el transporte intestinal seroso-mucoso de BZL mediante el modelo de saquitos intestinales. Los resultados obtenidos confirmaron nuestra hipótesis, dado que la velocidad de transporte de BZL desde el lado mucoso al lado seroso fueron menores en el grupo pre-tratado con BZL, que en el grupo control, a lo largo de todo el experimento. Este efecto fue revertido por el co-tratamiento con PSC833 (inhibidor específico de P-gp, análogo no inmunosupresivo de la ciclosporina A), indicando que P-gp podría estar mediando dicho efecto. Antecedentes previos de nuestro grupo de investigación, confirmaron la participación de P-gp en el eflujo de BZL en células (Rigalli y col., 2012). La información obtenida durante esta tesis sugiere la posibilidad de una disminución progresiva en la absorción de BZL y/o incremento en la metabolización/eliminación después de su administración terapéutica. Desafortunadamente, no encontramos evidencia en la literatura de esta posibilidad, o una conexión con la disminución en la eficacia terapéutica. Al presente, también se desconoce si podría existir una inducción de sistemas de biotransformación y transportadores en pacientes tratados con BZL. En conclusión, el incremento de la expresión y actividad de P-gp y Mrp2 en hígado y yeyuno proximal junto con el aumento en la expresión y actividad de CYP3A4 en hígado, y GST hepática e intestinal, debidas al pretratamiento con BZL, podrían dar lugar a la aparición de interacciones droga-droga con otros fármacos que pudieran ser co-administrados durante el tratamiento, pudiendo implicar principalmente sistemas involucrados en la depuración de compuestos endógenos y exógenos; así como modificar la farmacocinética del propio BZL, en pacientes tratados con BZL.

El efecto de un fármaco depende de su concentración en su sitio de acción. La misma se encuentra definida por la absorción, la distribución y la depuración del mismo. En el organismo pueden definirse órganos de relevancia farmacológica que cumplen una función importante en los procesos mencionados anteriormente. El hígado y el riñón cumplen un rol clave en la depuración de fármacos. El intestino participa además en la absorción de compuestos administrados en forma oral. Tanto en la limitación de la absorción a nivel intestinal como en la excreción en todos los tejidos mencionados intervienen sistemas de biotransformación y transportadores de drogas, proteínas que modifican químicamente los fármacos llevando en la mayoría de los casos a su inactivación y facilitando su posterior transporte fuera de la célula. Los sistemas de biotransformación pueden dividirse en sistemas de fase I y sistemas de fase II. Los sistemas de fase I incluyen a las proteínas de la familia del citocromo P450 y catalizan diversas reacciones de oxidoreducción. El miembro más representativo es el CYP3A4, responsable del metabolismo de aproximadamente el 50% de las drogas de aplicación clínica. Los sistemas de fase II catalizan reacciones de conjugación de los fármacos o los productos de la reacciones de fase I con compuestos como glutation (reacciones catalizadas por las glutation-S-transferasas, GSTs) o ácido glucurónico (reacciones catalizadas por las UDP-glucuronosiltransferasas, UGTs) entre otros. Las proteínas transportadoras suelen ser de carácter multiespecífico. Entre los transportadores de eflujo pueden mencionarse a la P-glicoproteína (P-gp), la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) y la proteína de resistencia de cáncer de mama (BCRP) de localización apical en hepatocitos, enterocitos y células de los túbulos renales. La proteína asociada a resistencia a multidrogas 3 (MRP3), por su parte, se localiza en las membranas basolaterales de los mencionados tipos celulares. La expresión y función de los sistemas anteriores no es constante sino que existe una regulación, por los mismos sustratos y por otras drogas, representando la base molecular de las interacciones droga-droga. La regulación puede cursar a nivel transcripcional (cambios en la síntesis de ARNm), nivel post-transcripcional (cambios en la estabilidad del ARNm o en su procesamiento), nivel traduccional (cambios en la síntesis de proteína) o a nivel post-traduccional (cambios en la actividad de la proteína sin cambios en su expresión). En el caso de la regulación por fármacos, la regulación transcripcional mediada por receptores nucleares suele ser uno de los mecanismos más importantes. El receptor de pregnanos X (PXR) es un receptor nuclear de elevada promiscuidad. El mismo es activado por un gran número de fármacos y otros xenobióticos y regula la expresión de diversos genes que codifican sistemas de biotransformación y transportadores de drogas. El Benznidazol (BZL) es el fármaco de elección para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Actualmente se dispone de escasa información acerca de los efectos del BZL sobre los sistemas de biotransformación y transportadores de drogas. Su coadministración con otros compuestos y, por ende, la aparición de interacciones droga-droga no puede ser descartada. Los objetivos del presente trabajo de tesis fueron: 1) establecer el efecto del tratamiento con BZL sobre la expresión y actividad de sistemas de biotransformación de fase I (CYP3A4), sistemas de biotransformación de fase II (GST y UGT) y proteínas transportadoras de drogas (P-gp, MRP2, BCRP y MRP3); 2) establecer el/los mediadores moleculares de tal efecto, en especial la participación de PXR y determinar el rol del BZL como activador de PXR y 3) estudiar el/los transportadores responsables del eflujo de BZL al exterior celular y cómo el pretratamiento con BZL afecta tal proceso. Los estudios se realizaron en la línea celular HepG2. La misma deriva de un hepatocarcinoma celular humano y conserva diversas propiedades bioquímicas, morfológicas y fisiológicas de los hepatocitos lo que la convierte en un modelo adecuado para estudiar la regulación de proteínas hepáticas humanas. En primer lugar se realizó un estudio concentración-respuesta (0-1000 μM) de la expresión de los transportadores en respuesta al tratamiento con BZL. Se observó una inducción significativa a nivel proteico (por inmunocuantificación) de P-gp por BZL 200 y 1000 μM (160 ± 27 y 282 ± 94% respectivamente vs 100 ± 7%). Un patrón similar se observó en la expresión de MRP2 (175 ± 15 y 491 ± 5% para 200 y 1000 μM de BZL respectivamente vs 100 ± 14%). BCRP y MRP3 no mostraron diferencias significativas a ninguna de las concentraciones estudiadas. La inducción de P-gp y MRP2 se verificó tanto en lisados celulares como en membrana plasmática. Para los estudios posteriores se escogió la concentración de BZL 200 μM por ser la mínima concentración a la que se observa un efecto. A nivel de ARNm (por PCR cuantitativa a tiempo real), se observó también una inducción de P-gp y MRP2 por BZL (200 μM). Concretamente la expresión fue de 332 ± 151 vs 100 ± 69% en el caso del mensajero de P-gp y 293 ± 137 vs 100 ± 57% en el caso de MRP2. La inducción observada en la expresión se correlacionó con un aumento en la actividad tanto para P-gp como para MRP2. En el primer caso la actividad se determinó por acumulación del sustrato modelo Rhodamina 123. Las células tratadas con BZL mostraron una acumulación significativamente menor (85 ± 2 vs 100 ± 6%) que las células controles, lo que indica un mayor eflujo del mismo, y esto una mayor actividad de P-gp. En el caso de MRP2, la actividad se determinó midiendo el eflujo del sustrato dinitrofenil-S-glutation (DNP-SG) observándose un eflujo significativamente mayor (181 ± 1 vs 100 ± 7%) en las células tratadas que en las células controles. A nivel de las enzimas de biotransformación, BZL (200 μM) indujo la expresión proteica de CYP3A4 y GSTπ (143 ± 1 vs 100 ± 22% y 175 ± 12 vs 100 ± 35%, respectivamente). La inducción se observó también a nivel del ARNm (150 ± 23 vs 100 ± 21% y 178 ± 94 vs 100 ± 11% para CYP3A4 y GSTπ respectivamente). También se observó una inducción en la actividad de GST, cuantificada a través de la formación de DNP-SG (204 ± 32 vs 100 ± 7%). La actividad de CYP3A4 se determinó por la formación de un derivado luminiscente a partir de un sustrato modelo de la enzima. Se observó una disminución en la actividad (58 ± 6 vs 100 ± 4%) que indica inhibición de la misma por BZL. A fin de caracterizar el mecanismo de acción del BZL en el modelo celular empleado se verificó por inmunocuantificación la expresión de PXR, el receptor X de retinoides α (RXRα) con el cual heterodimeriza PXR y del coactivador p300, necesario para la función de los mismos. Mediante sobreexpresión de PXR se observó una inducción en la expresión de genes blanco de PXR como ser P-gp, MRP2, MRP3 y BCRP, lo que indicaría funcionalidad de PXR en el modelo y posibilidad de mediación del efecto de BZL por el mismo. Para confirmar tal hipótesis, se procedió al silenciamiento de PXR empleando un ARN de interferencia específico dirigido contra el ARNm del receptor nuclear lográndose un silenciamiento de PXR a nivel de proteína del 74% con respecto a las células transfectadas con un ARN de interferencia no silenciante. En estas condiciones se repitió el tratamiento con BZL y se cuantificó la expresión de las proteínas cuya expresión había resultado previamente inducida (CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2). En todos los casos, el silenciamiento de PXR resultó en la ausencia de inducción por BZL confirmando la participación de PXR como mediador del efecto de BZL. A fin de determinar si el mecanismo por el cual PXR media el efecto de BZL consiste en una activación del mismo, se determinó la actividad del mismo en presencia de distintas concentraciones de BZL. Para ello se utilizaron células LS180-PXRRE, derivadas a partir de un adenocarcinoma de colon humano, que expresan en forma estable un gen reportero sensible a la activación de PXR. Por regresión sigmoidea se obtuvo un valor de concentración efectiva 50 (EC50) de 259 ± 38 μM corroborándose así el rol de BZL como activador de PXR y sugiriendo su rol como ligando del mismo. A fin de determinar el/los transportadores que mediarían el eflujo de BZL al exterior celular, se corroboró en primer lugar si el BZL sufre metabolización en las condiciones experimentales empleadas. Al no observarse metabolismo significativo, se procedió a realizar los estudios posteriores cuantificando la droga sin modificar (por HPLC). En primer lugar se determinó la acumulación intracelular de BZL luego de 2 h de incubación en presencia de verapamilo (como inhibidor de P-gp) o de probenecid (como inhibidor de las MRPs). Se observó una acumulación significativamente mayor en las células coincubadas con verapamilo respecto de las células controles no expuestas a ningún inhibidor (128 ± 16 vs 100 ± 3%) sugiriendo la dependencia del transporte de BZL, al menos en parte, de P-gp. No se observaron cambios significativos en la acumulación de BZL en las células coincubadas con probenecid (88 ± 8 vs 100 ± 3%) permitiendo descartar la participación de una MRP en el transporte de BZL, al menos en su forma sin modificar. A fin de confirmar la participación de P-gp en el transporte de BZL en células HepG2, se procedió a su silenciamiento mediante transfección con un ARN de interferencia. Se observó una acumulación significativamente mayor de BZL en las células P-gp-, transfectadas con un ARN de interferencia específico contra P-gp, que en células P-gp+, transfectadas con un ARN de interferencia no silenciante (115 ± 2 vs 100 ± 3%) confirmando la participación de P-gp en el transporte de BZL. Teniendo en cuenta que P-gp participa en el transporte de BZL y que el pretratamiento con BZL induce la expresión de P-gp, es esperable que el pretratamiento con BZL modifique su propia concentración intracelular. A fin de corroborarlo se repitió determinó la acumulación de BZL en condiciones de inducción de P-gp por el fármaco (200 μM, 48 h). Se observó una acumulación significativamente menor de BZL en las células que fueron pretratadas con respecto a las células controles expuestas al vehículo (73 ± 15 vs 100 ± 2%). El efecto desaparece ante el agregado de verapamilo (inhibidor de P-gp), donde la acumulación en células controles y pretratadas con BZL no difiere estadísticamente (120 ± 4 y 115 ± 5% respectivamente) confirmando así la participación de P-gp. Los resultados del presente trabajo de tesis demuestran un efecto inductor del tratamiento con BZL sobre la expresión de CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2. La inducción de la expresión en GSTπ, P-gp y MRP2 se refleja en un aumento en la actividad de las proteínas empleando sustratos modelos de cada proteína. La inducción sugeriría un aumento en la depuración de fármacos sustratos de los mismos cuando estos son coadministrados con BZL. Además se confirmó el rol de P-gp en el transporte de BZL, lo que podría también representar la base de interacciones droga-droga en el caso de que el BZL sea administrado en condiciones de inducción de P-gp por otra droga. Simultáneamente, dado su carácter inductor de P-gp, BZL por si solo sería capaz de aumentar su propia depuración. En el caso de CYP3A4 por el contrario se observa un efecto inhibitorio sobre la actividad. Teniendo en cuenta que el CYP3A4 es responsable del metabolismo de aproximadamente el 50% de los fármacos de empleo en la práctica clínica, de observarse un efecto similar in vivo, el tratamiento con BZL podría disminuir la depuración de sustratos coadministrados propiciando la aparición de interacciones droga-droga y efectos potencialmente tóxicos. Además, se demostró la participación de PXR en la regulación del efecto y se confirmó la activación del receptor nuclear por BZL. Teniendo en cuenta que el mecanismo de activación descrito para PXR implica unión del sustrato al bolsillo hidrofóbico del dominio de unión a ligando, los resultados sugerirían un rol de BZL como ligando del mismo. No obstante, se requeriría la confirmación mediante ensayos de competición. Por otro lado, PXR cumple un rol regulador clave sobre un gran número de sistemas de biotransformación y transportadores de drogas como así también sobre genes que regulan otras vías metabólicas (ej. síntesis de ácidos biliares) e interacciona con otras vías de transducción de señales (ej. respuesta inflamatoria, ciclo celular). Por lo tanto, no pueden descartarse potenciales interacciones entre BZL y las mencionadas vías de señalización.

Fil:Crespi, Martín Darío. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La alimentación es un comportamiento complejo cuya regulación involucra la integración de factores externos e internos. En insectos sociales este comportamiento no solo varía de acuerdo a las características del alimento y las condiciones ambientales sino que también de acuerdo a los requerimientos de la colonia. En este trabajo combinamos estudios de comportamiento, electrofisiológicos, farmacológicos e inmunocitoquímicos para estudiar cómo distintos factores afectan la ingestión de soluciones azucaradas en la hormiga Camponotus mus. Nuestros estudios mostraron que el ayuno de la colonia determina la motivación recolectora de la hormiga forrajera modificando la concentración umbral de aceptación y su comportamiento de ingestión no solo de soluciones azucaradas sino también de cebos tóxicos. Durante la ingestión, el accionar de la bomba de succión estuvo determinado por el ayuno de la colonia, la temperatura ambiental, la concentración de sacarosa y la presencia de tóxico en la solución. Cambios en estas variables dieron lugar a variaciones en la velocidad y el tiempo de ingestión a través de la modulación de la frecuencia de bombeo, el volumen de solución incorporado por cada bombeo o el número de bombeos totales. Indagamos sobre los mecanismos neuroendócrinos involucrados y encontramos un efecto depresivo de la serotonina sobre la ingestión. También observamos la presencia de neuronas serotoninérgicas en los centros nerviosos involucrados en el control de la alimentación e inervaciones serotoninérgicas a lo largo del tubo digestivo. En conjunto, estos resultados nos permiten una comprensión integral de cómo distintos factores modelan el comportamiento de ingestión en hormigas y cómo esto se integra con estratégias de recolección eficientes en condiciones siempre cambiantes.

Actualmente, la inhibición se considera como una de las principales funciones ejecutivas. No obstante, aún persisten debates sobre su naturaleza y estructura. En tal sentido, se han postulado distintos procesos inhibitorios, entre los que suele distinguirse a los siguientes: inhibición perceptual, inhibición cognitiva e inhibición de la respuesta. Los tres experimentarían importantes cambios en su desarrollo durante la infancia, integrándose con otros procesos cognitivos. En base a ello, se ha planteado que la intervención sobre la inhibición en niños con desarrollo típico podría promover el progreso de su funcionamiento y generar efectos en las habilidades en las que participa, tanto a corto como a largo plazo. Sin embargo, no se registran estudios en los que se haya intervenido de manera específica sobre los diferentes tipos inhibitorios, analizado conjuntamente distintos efectos de transferencia. Por ello, el presente trabajo se propuso diseñar, implementar y analizar la eficacia de tres actividades de entrenamiento inhibitorio (una por cada tipo), a través de un diseño experimental con pre-test, dos post-test, tres grupos experimentales y un grupo control activo. En el estudio participaron niños con desarrollo típico, alumnos de 1º, 2º y 3º de Educación Primaria. Se analizó la eficacia de las intervenciones sobre el desempeño en tareas inhibitorias, de memoria de trabajo, de flexibilidad cognitiva y de inteligencia fluida, a corto y largo plazo. Los principales resultados indican efectos bajos a corto plazo sobre el desempeño en una tarea de memoria de trabajo viso-espacial luego de la intervención sobre lainhibición de la respuesta y la inhibición cognitiva; y efectos a corto y largo plazo sobre el desempeño en una tarea de inteligencia fluida luego del entrenamiento en inhibición cognitiva. Los resultados contribuyen con el conocimiento sobre el desarrollo de lasfunciones ejecutivas y otras habilidades, la posibilidad de cambio por intervención; y en particular sobre las potenciales contribuciones de los procesos inhibitorios.

Actualmente, la inhibición se considera como una de las principales funciones ejecutivas. No obstante, aún persisten debates sobre su naturaleza y estructura. En tal sentido, se han postulado distintos procesos inhibitorios, entre los que suele distinguirse a los siguientes: inhibición perceptual, inhibición cognitiva e inhibición de la respuesta. Los tres experimentarían importantes cambios en su desarrollo durante la infancia, integrándose con otros procesos cognitivos. En base a ello, se ha planteado que la intervención sobre la inhibición en niños con desarrollo típico podría promover el progreso de su funcionamiento y generar efectos en las habilidades en las que participa, tanto a corto como a largo plazo. Sin embargo, no se registran estudios en los que se haya intervenido de manera específica sobre los diferentes tipos inhibitorios, analizado conjuntamente distintos efectos de transferencia. Por ello, el presente trabajo se propuso diseñar, implementar y analizar la eficacia de tres actividades de entrenamiento inhibitorio (una por cada tipo), a través de un diseño experimental con pre-test, dos post-test, tres grupos experimentales y un grupo control activo. En el estudio participaron niños con desarrollo típico, alumnos de 1º, 2º y 3º de Educación Primaria. Se analizó la eficacia de las intervenciones sobre el desempeño en tareas inhibitorias, de memoria de trabajo, de flexibilidad cognitiva y de inteligencia fluida, a corto y largo plazo. Los principales resultados indican efectos bajos a corto plazo sobre el desempeño en una tarea de memoria de trabajo viso-espacial luego de la intervención sobre lainhibición de la respuesta y la inhibición cognitiva; y efectos a corto y largo plazo sobre el desempeño en una tarea de inteligencia fluida luego del entrenamiento en inhibición cognitiva. Los resultados contribuyen con el conocimiento sobre el desarrollo de lasfunciones ejecutivas y otras habilidades, la posibilidad de cambio por intervención; y en particular sobre las potenciales contribuciones de los procesos inhibitorios.

Tesis (Doctor)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas, 2009

Existen evidencias que tanto las células endoteliales presentes en la vasculatura de un tumor como las propias células tumorales liberan factores que promueven la mutua proliferación. Asimismo, los leucocitos que llegan al sitio tumoral atraídos por estímulos quimiotácticos pueden contribuir de manera importante a la progresión o regresión del tumor, lo que pone de manifiesto un alto grado de dependencia entre estos tres grupos celulares. El objetivo de este trabajo de Tesis fue investigar la interrelación entre las células endoteliales (CE) y las células inflamatorias responsables de la inmunidad innata en el desarrollo tumoral. Para ello, se estudió el desarrollo de la neovascularización en tumores mamarios murinos de distinto comportamiento biológico, observándose que el tipo histológico (lobulillar o ductal) no guarda relación con ningún perfil angiogéníco particular. Sin embargo, se encontró que la tasa de crecimiento y la capacidad de producir metástasis están acompañadas por un desarrollo microvascular más activo. Esto evidencia un comportamiento de valor pronóstico como lo observado para tumores humanos y destaca la utilidad del anticuerpo monoclonal MEC 13.3 anti-CD31. Este mismo anticuerpo se utilizó acoplado a esferas inmunomagnéticas para el aislamiento de CE de tejidos normales y neoplásicos con el objeto de establecer líneas que permitan estudiar la heterogeneidad fenotípica y funcional de las CE. Si bien no se logró reproducir el microambiente tumoral en cultivo para perpetuar el crecimiento in vitro de las CE derivada de tumores, se logró establecer una línea de CE derivadas de tejido normal renal. Características como la expresión de CD31, moléculas de adhesión como VCAM-1, ICAM-1 y ELAM-1, expresión del factor de von Willebrand, la captación con avidez de LDL acetílado y la sensibilidad a Shigatoxina-1 (13-20%) definen el perfil de la que es hasta el presente la primera línea descripta de endotelio microvascular renal murino. La vasculatura no sólo provee perfusión de oxígeno y nutrientes al tumor, sino que permite la llegada y extravasación de células inflamatorias que según sus características pueden tener efectos positivos o negativos en el desarrollo tumoral. Con el objeto de estudiar y modular el aflujo de células inflamatorias al tumor, se analizó si la generación de necrosis por crioterapia en melanomas, a partir del daño producido en las células tumorales, podría inducir la llegada de células inflamatorias al sitio y particularmente de células presentadoras de antígenos. Se encontró que la inducción de necrosis por crioterapia (77-100% de la masa tumoral) en melanomas humanos (IIB-MEL-J) crecidos en ratones nude produjo activación temprana del endotelio y una rápida llegada de células polimorfonucleares (PMN) al sitio tumoral, seguidos del reclutamiento más tardío de macrófagos que persistieron hasta 15 días después del tratamiento. Estas manifestaciones condujeron a la formación de un infiltrado peritumoral muy importante pero sin infiltración intratumoral. La administración intralesional de una dosis de 500U de la citoquina GM-CSF aumentó el infiltrado intratumoral de macrófagos y PMN post tratamiento. El aumento en el número de células dendríticas (DEC205+) y su movilización a capas más profundas de la dermis cercanas a las zonas peritumorales, además de la formación de anticuerpos sugieren que la necrosis inducida con la crioterapia y la adyuvancia con GMCSF pueden resultar una estrategia útil para aumentar el infiltrado intratumoral. Lograr la llegada de células presentadoras de antígenos DEC 205+ y macrófagos F4/80+ al tumor podría contribuir a captar los antígenos liberados durante la necrosis para ser llevados a los ganglios cercanos para la presentación antigénica. A las 4 hs de la administración de GM-CSF, la citoquina es retenida en el tumor cuatro veces más que la inyectada subcutáneamente, lo que podría contribuir al reclutamiento intratumoral observado. El melanoma utilizado en estos estudios secreta cantidades no detectables (inferiores a 12 pg/ml) de la quemoquina MCP-1 (monocyte chemotactic protein), una de las principales responsables de conducir a la formación de infiltrados monocito/macrofágicos en tumores. En biopsias de melanomas metastásicos humanos encontramos que 100% de ellos producen MCP-1 con variada intensidad de expresión y número de células positivas. La intensidad de expresión se correlacionó con la vascularización, sugiriendo un efecto directo de la quemoquina sobre la angiogénesis. La presencia de importantes focos de macrófagos infiltrantes dentro del tumor se encontró particularmente asociada a áreas de activa angiogénesis pero no asociado a estructuras vasculares de gran calibre. Esto podría ser un indicio de la ruta de extravasación de los macrófagos frente al estimulo quimiotáctico o a un efecto proangiogénico de los macrófagos reclutados. Para disponer de un modelo que nos permita estudiar mejor el rol de los macrófagos infiltrantes al tumor, se transfectó la línea IIB-MEL-J con el cDNA correspondiente al MCP-1 humano, obteniéndose así una línea que produce 940 pg/ml/10^6 células/48 hs. Las células transfectadas son de menor tamaño, mayor capacidad migratoria frente a medios condicionados ricos en componente de matriz, menor adhesión al endotelio y no presentan diferencias en la tasa de crecimiento in vitro. Los tumores producidos por inyección subcutánea de las células productoras presentan un infiltrado de macrófagos tanto intra como peritumoral significativamente mayor que los tumores parentales, hasta 30 días de la inoculación de las células. Sin embargo, son similares en tamaño a los originados por la línea parental, lo que sugeriría que, a diferencia de otros modelos experimentales, la presencia de macrófagos es necesaria pero no suficiente para inducir regresión, para la cual se requeriría de la respuesta efectora, ausente en ratones nude. Por lo tanto, hemos generado un modelo muy interesante que nos permitirá continuar con el estudio del rol de los macrófagos y extrapolar los ensayos de modulación del infiltrado con GM-CSF en tumores productores de MCP-1.

El presente estudio está dirigido a estudiar la modulación del NCX por la vía autocrina Ang II/ET a través del registro de la corriente generada por este intercambiador (I_NCX). Esto se realizará en miocitos cardíacos de ventrículo de gato utilizando la técnica de patch-clamp. Se medirá el acortamiento celular mediante un detector de bordes en forma simultánea con el registro de la I_NCX. Estudiaremos los efectos de la Ang II y la ET-1 sobre la contractilidad basal de miocitos aislados intactos midiendo el acortamiento de los sarcómeros mediante una video-cámara asociada a un software específico. Estudiaremos también la influencia de la activación del NHE por la vía Ang II/ET sobre los efectos de esta vía sobre la I_NCX y la contractilidad. La I_NCX y la contractilidad se determinará en presencia y ausencia de KB-R7943 (un bloqueante específico del modo inverso del NCX), de TAK044 (bloqueante de receptores de ET) y de HOE642 (bloqueante del NHE).

La competencia y la herbivoría son dos fuerzas selectivas en la evolución de las plantas terrestres. Éstas deben crecer lo suficientemente rápido como para ser competitivas con sus vecinos y, al mismo tiempo, asignar recursos a las defensas para poder sobrevivir a los organismos consumidores. Estudios recientes mostraron que las señales lumínicas asociadas a la competencia, p. ej. una baja relación rojo:rojo lejano (R:RL) produce la represión del sistema de defensas, tornando a las plantas más susceptibles al ataque de insectos herbívoros y microorganismos patógenos. Bajo condiciones de competencia por luz, se produce la inactivación del fitocromo B (phyB) lo cual en plantas intolerantes a la sombra promueve el crecimiento y regula negativamente los sistemas de defensa antiherbívoro. Poco se sabe sobre los efectos que tiene el phyB en la emisión de compuestos orgánicos volátiles (VOCs) involucrados en las defensas indirectas. En esta tesis se investigó el efecto de phyB en las defensas directas e indirectas de tomate (Solanum lycopersicum). Para esto se utilizaron dos aproximaciones diferentes para inactivar el phyB: suplementación con luz rojo lejana (RL), y genotipos mutantes de los dos genes PHYB presentes en el genoma de tomate. La inactivación del phyB produjo una disminución en los niveles de defensas constitutivas como así también una atenuación de las defensas directas inducibles por MeJA. Adicionalmente, se observó que la inactivación de phyB tuvo efectos en los blends de VOCs emitidos por las plantas inducidas con MeJA. En ensayos de elección en olfatómetro con plantas inducidas con MeJA observamos que la chinche Macrolophus pygmaeus tuvo mayor preferencia por los blends de VOCs emitidos por plantas con phyB inactivos que por los blends de las wild-type. Estos resultados sugieren que la inactivación del phyB además de reprimir las defensas directas tiene consecuencias sobre las interacciones tritróficas mediadas por VOCs presumiblemente atrayendo a los predadores a plantas con defensas atenuadas donde existe mayor chance de encontrar a su presa. Es tentador pensar que las plantas bajo un stress de competencia por luz puedan hacer un switch entre sus defensas directas a indirectas y así atraer a enemigos naturales.