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Verificar que un sistema de software realiza correctamente las tareas para las cuales fue desarrollado es una de las actividades de mayor importancia en Ingeniería de Software, y concentra un significativo esfuerzo de investigación en esta área. El testing, el cual consiste en ejecutar un programa a evaluar en un conjunto de escenarios particulares y contrastar el comportamiento esperado del programa con el efectivamente obtenido, es una de las técnicas más utilizadas como forma de comprobación del correcto comportamiento del software. Dada la inherente incompletitud de testing, resulta necesario realizar una selección adecuada de los escenarios bajos los cuales realizar la evaluación. Claramente, como esta evaluación es realizada va a afectar la confianza que genere el proceso de testing, cuando la ejecución real del software coincida con la esperada, y las chances de detectar defectos en el software durante este proceso. Concretamente, se espera que el conjunto de escenarios seleccionado para el proceso de testing sea un buen representante de todos los posibles escenarios de ejecución del software en cuestión. Los criterios de testing permiten medir la calidad de un conjunto de tests generando objetivos a ser cubiertos, y evaluando cuántos de estos son satisfechos (cubiertos) por los tests. Mutation testing es uno de estos criterios, y consiste en inyectar fallas artificiales en el software bajo evaluación, y evaluar la capacidad de detección, por parte de los tests, de estas fallas. Las fallas generadas por mutation testing se basan en operadores de mutación.Estos operadores deben ser buenos representantes de fallas reales, y tradicionalmente involucran cambios simples, tales como el reemplazo de operadores aritméticos y relacionales. Algunos estudios recientes muestran sin embargo que algunas clases de fallas no se ven representadas por los operadores de mutación tradicionales, motivando así la introducción de nuevos operadores.En esta tesis presentaremos un nuevo operador de mutación, que aplica a expresiones de navegación, un tipo de expresiones ampliamente utilizadas en programas orientados a objetos, y que no se ven afectadas por los operadores de mutación clásicos. Daremos una definición precisa del operador, y evaluaremos su aplicación tanto en el contexto de testing (mutation testing), como en el contexto de reparación de programas.

El presente trabajo tuvo por finalidad investigar los posibles efectos mutagénicos y antimutagénicos de dos variedades de Ilex (Ilex paraguariensis var. paraguariensis e Ilex dumosa var. dumosa) empleadas corrientemente en la elaboración de infusiones utilizando ensayos de mutagenicidad in vitro (Ensayo de Salmonella microsoma) e in vivo (Test de Micronúcleo). Se trabajó con Ilex paraguariensis St Hil. var. paraguariensis e Ilex dumosa Reissek var. dumosa, ejemplares frescos provenientes de la Estación Experimental del INTA Cerro Azul (Misiones). Se prepararon extractos acuosos a partir de la infusión empleando 5g de hojas secas trituradas de Ilex en 70 ml de agua a 80ºC. Se filtraron y llevaron a volumen de 100 ml. Luego se liofilizaron y se conservaron congelados hasta el momento del ensayo. Para la obtención de los extractos orgánicos se partió de 120 g de hojas secas trituradas de ambas plantas y se realizaron extracciones sucesivas con cloroformo. El polvo remanente fue sometido a extracciones sucesivas con acetona. Luego los extractos secos se conservaron congelados hasta el momento del ensayo. Los extractos acuosos se solubilizaron en agua destilada y los orgánicos en dimetilsulfóxido (DMSO), solvente compatible con el ensayo de mutagenicidad. La investigación de la mutagenicidad y antimutagenicidad de los extractos se realizó según el procedimiento descripto por Maron y Ames (1983) con preincubación, utilizando cepas de Salmonella typhimurium TA98 (sensible a mutágenos que cambian el marco de lectura) y TA100 (sensible a mutágenos que producen sustituciones de pares de bases). Estas cepas han demostrado ser las de mayor sensibilidad para sustancias químicas. El ensayo se realizó con y sin activación metabólica, cofactores y solución reguladora.

Las infecciones entéricas que derivan en enfermedades diarreicas representan uno de los principales problemas de la salud mundial. En los países del tercer mundo, ocurren por lo menos mil millones de casos por año, resultando en 5 a 10 millones de muertes. Muchas de estas infecciones son transmitidas por alimentos contaminados, dentro de las cuales esta la salmonelosis. El género Salmonella comprende a bacilos gram-negativos anaeróbicos facultativos, agentes etiológicos de diferentes enfermedades referidas colectivamente como salmonelosis. La salmonelosis representa un importante problema de salud en todas partes del mundo. A diferencia de lo que ocurre en humanos no se dispone de una vacuna comercial contra Salmonella para uso animal. Las mutantes bacterianas termosensibles (ts), en su crecimiento son una herramienta promisoria para la producción de vacunas vivas contra enfermedades bacterianas. La atenuación de estas cepas se basa en la característica de las mutantes de poder replicarse a bajas temperaturas (26°C/ 28°C) pero de cesar su duplicación a la temperatura corporal (37°C). La sensibilidad a la temperatura como método de atenuación ofrecería la ventaja sobre otras atenuaciones de ser aplicable, en principio, para cualquier patógeno de mamíferos. En este trabajo se obtuvieron mutantes ts de diferentes fenotipos. Las mutantes analizadas en los estudios in vivo presentaron características bien diferenciables, en cuanto a sus propiedadaes inmunogénicas y en cuanto a sus patrones de permanencia en el huésped. La administración de los microorganismos por la vía i.g., incrementó el grado de colonización así como la permanencia de las distintas cepas ts. Sin embargo la distribución de las diferentes mutantes en los distintos órganos del huéped fue similar para las dos vías de inoculación ensayadas. La cepa ts que confirió una protección adecuada al ser administrada por la vía i.g. fue capaz de colonizar tanto las PP como el bazo, en cambio las otras dos cepas ts se las detectó en PP o en el bazo solamente. La inmunización i.g., tanto con la cepa protectiva E/l/3 como con la mutante C/2/2, que no otorgó una inmunidad protectiva adecuada, indujeron IgA en intestino. Solamente la cepa E/1/3 indujo niveles significativos de IgM circulante los que se hallaron al día 21 postinmunización. Las dos mutantes produjeron una respuesta IgG específica circulante, cuyos niveles aumentaron con el tiempo detectándose los niveles más altos en el día 21, resultando mayores en los animales inmunizados con la mutante E/l/3. La inmunización i. g. con la mutante E/1/3 indujo una respuesta celular de memoria, que se evidenció por la proliferación celular in vitro frente al antígeno específico. Al inmunizar los animales con la cepa C/2/2, la células tanto de ganglio mesentérico como de bazo presentaron índices de estimulación que no fueron diferentes cuando se enfrentaron con el antígeno específico con respecto a otro antígeno no relacionado. En presencia del antígeno específico, los sobrenadantes de las células provenientes de animales inmunizados con E/1/3 presentaron altos niveles de IFN-t (>4100 pg/ml), comparados con los de los animales controles (200-500 pg/ml). Tanto en los estudios de inmunización sistémica, p.o., o i.g. la mutante E/1/3 confirió la protección más adecuada, por este motivo es que se seleccionó a esta cepa como posible cepa vacuna. Se incorporó una segunda mutación atenuada al genoma de la cepas E/1/3L y E/1/3. Al analizar la atenuación de la cepa doble mutante, se vió que la alta inocuidad presentada por la cepa ts E/l/3, se siguió conservando al incorporarle una segunda mutación al genoma. El índice de reversión de las dos mutaciones en forma conjunta, resultó menor a 10-10), niveles tan bajos de reversión propiciarían a esta cepa para ser utilizada como vacuna en animales de consumo.

La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente.

La tesis es una sistematización de la experiencia de la Mutual de transporte "El Colmenar". Esta sistematización se realiza desde una perspectiva comunicacional y poniendo especial atención a la reconstrucción del proceso de organización y participación de esta experiencia, dando cuenta de sus potencialidades y límites.

El Mycobacterium bovis (M. bovis), agente causal de la tuberculosis bovina (TBb), produce infecciones en animales domésticos, silvestres y en el hombre, por lo cual constituye un grave problema en salud pública. En las últimas décadas varios países ejecutaron programas de control y erradicación de TBb en sus rodeos bovinos, basándose en la detección de los animales infectados y su inmediata faena (“test and slaughter”). A pesar de haberse lorado progresos satisfactorios, en algunas áreas geográficas persistieron las reinfecciones en los rodeos saneados. Una de las principales causas para que esto ocurriera fue la presencia de fauna silvestre infectada. En Argentina existe desde 1999 un plan oficial de control y erradicación de TBb basado en la misma premisa. Desde su puesta en marcha el número de rodeos bovinos declarados libres ha ido en constante aumento, destacándose los lecheros. Sin embargo, el nivel de infección del rodeo nacional sigue siendo elevado. El factor ambiental ha sido poco estudiado en Argentina, especialmente el que involucra a la participación de la fauna silvestre local. Se seleccionaron 8 rodeos lecheros ubicados en la denominada Cuenca lechera Santa Fe–Córdoba. Seis de ellos presentaban prevalencias elevadas en sus vacas a la prueba de tuberculina y en los dos restantes se había detectado reinfección luego de haber finalizado un programa de saneamiento. Las labores de muestreo de fauna se realizaron durante 2007, 2008 y parte del 2009, capturándose un total de 146 mamíferos silvestres. Se aisló M. bovis en 12 individuos, resultando en una prevalencia de infección del 8,2 %. Diez de estos aislamientos se realizaron en comadreja overa (Didelphys albiventris) y los restantes se obtuvieron de un zorro gris (lycolapex gimnocercus) y de una rata (Rattus norvegicus). La prevalencia de infección en comadrejas resultó del 12,8 %, involucrando mayoritariamente a los individuos machos, sin ser este hallazgo estadísticamente significativo (P=0,18). Ninguno de los individuos en donde se aisló M.bovis, presentó lesiones macroscópicas de tuberculosis. Los aislamientos obtenidos en comadrejas fueron a partir de ganglios de cabeza, pulmón y pool de hígado, bazo y riñón. En el zorro se obtuvo solo a partir de ganglios mesentéricos y en la rata a partir de pulmón. No se encontraron asociaciones significativas entre los aislamientos de M. bovis en fauna y la prevalencia de TBb en los rodeos bovinos (P= 0,097), ni en el tamaño de los mismos (P= 0,422). Los rodeos que sufrieron reinfección tuvieron 3,79 veces más riesgo de aislamiento de M. bovis en la fauna silvestre que aquellos donde la infección permaneció estable (P= 0,0264). La tipificación molecular de los aislamientos correspondió en cinco ocasiones a los spoligotipos 34 y al 12. Estos aislamientos se obtuvieron sobre 9 comadrejas y una rata. En una sola oportunidad se aislaron los spoligotipos 96 y 122, el primero a partir de un zorro y el segundo de una comadreja. Solo dos aislamientos de M. bovis se obtuvieron de los rodeos bovinos involucrados en los muestreos de fauna, correspondiendo a los spoligotipos 21 y 98. Debido a que la mayoría de los aislamientos se obtuvieron a partir de ganglios de la cabeza y de pool de órganos como bazo, hígado y riñón, la vía digestiva sería la principal vía por la cual las comadrejas (Didelphis alvibentris) adquieren la infección. Estos hallazgos son coincidentes con los realizados en USA sobre otra especie del mismo género, como la comadreja de América del Norte o Didelphis virginiana. Se puede considerar que Didelphis alvibentris podría jugar el papel de hospedador circunstancial o “spillover hosts” del M. bovis. Esto se sostiene por la coincidencia de spoligotipos aislados sobre esta especie y los más frecuentemente aislados en bovinos de Argentina.

El Mycobacterium bovis (M. bovis), agente causal de la tuberculosis bovina (TBb), produce infecciones en animales domésticos, silvestres y en el hombre, por lo cual constituye un grave problema en salud pública. En las últimas décadas varios países ejecutaron programas de control y erradicación de TBb en sus rodeos bovinos, basándose en la detección de los animales infectados y su inmediata faena (“test and slaughter”). A pesar de haberse lorado progresos satisfactorios, en algunas áreas geográficas persistieron las reinfecciones en los rodeos saneados. Una de las principales causas para que esto ocurriera fue la presencia de fauna silvestre infectada. En Argentina existe desde 1999 un plan oficial de control y erradicación de TBb basado en la misma premisa. Desde su puesta en marcha el número de rodeos bovinos declarados libres ha ido en constante aumento, destacándose los lecheros. Sin embargo, el nivel de infección del rodeo nacional sigue siendo elevado. El factor ambiental ha sido poco estudiado en Argentina, especialmente el que involucra a la participación de la fauna silvestre local. Se seleccionaron 8 rodeos lecheros ubicados en la denominada Cuenca lechera Santa Fe–Córdoba. Seis de ellos presentaban prevalencias elevadas en sus vacas a la prueba de tuberculina y en los dos restantes se había detectado reinfección luego de haber finalizado un programa de saneamiento. Las labores de muestreo de fauna se realizaron durante 2007, 2008 y parte del 2009, capturándose un total de 146 mamíferos silvestres. Se aisló M. bovis en 12 individuos, resultando en una prevalencia de infección del 8,2 %. Diez de estos aislamientos se realizaron en comadreja overa (Didelphys albiventris) y los restantes se obtuvieron de un zorro gris (lycolapex gimnocercus) y de una rata (Rattus norvegicus). La prevalencia de infección en comadrejas resultó del 12,8 %, involucrando mayoritariamente a los individuos machos, sin ser este hallazgo estadísticamente significativo (P=0,18). Ninguno de los individuos en donde se aisló M.bovis, presentó lesiones macroscópicas de tuberculosis. Los aislamientos obtenidos en comadrejas fueron a partir de ganglios de cabeza, pulmón y pool de hígado, bazo y riñón. En el zorro se obtuvo solo a partir de ganglios mesentéricos y en la rata a partir de pulmón. No se encontraron asociaciones significativas entre los aislamientos de M. bovis en fauna y la prevalencia de TBb en los rodeos bovinos (P= 0,097), ni en el tamaño de los mismos (P= 0,422). Los rodeos que sufrieron reinfección tuvieron 3,79 veces más riesgo de aislamiento de M. bovis en la fauna silvestre que aquellos donde la infección permaneció estable (P= 0,0264). La tipificación molecular de los aislamientos correspondió en cinco ocasiones a los spoligotipos 34 y al 12. Estos aislamientos se obtuvieron sobre 9 comadrejas y una rata. En una sola oportunidad se aislaron los spoligotipos 96 y 122, el primero a partir de un zorro y el segundo de una comadreja. Solo dos aislamientos de M. bovis se obtuvieron de los rodeos bovinos involucrados en los muestreos de fauna, correspondiendo a los spoligotipos 21 y 98. Debido a que la mayoría de los aislamientos se obtuvieron a partir de ganglios de la cabeza y de pool de órganos como bazo, hígado y riñón, la vía digestiva sería la principal vía por la cual las comadrejas (Didelphis alvibentris) adquieren la infección. Estos hallazgos son coincidentes con los realizados en USA sobre otra especie del mismo género, como la comadreja de América del Norte o Didelphis virginiana. Se puede considerar que Didelphis alvibentris podría jugar el papel de hospedador circunstancial o “spillover hosts” del M. bovis. Esto se sostiene por la coincidencia de spoligotipos aislados sobre esta especie y los más frecuentemente aislados en bovinos de Argentina.

La hiperhomocisteinemia, concentración elevada de homocisteína (Hcy) plasmática, constituye un factor de riesgo independiente para la enfermedad vascular. En plasma la Hcy se encuentra unida a proteínas, formando dímeros, como Hcy reducida y como homocisteína-tiolactona (HTL). La reacción entre los grupos ε-amino de los residuos lisina de las proteínas y el grupo carbonilo de la HTL se denomina N-homocisteinilación. Este proceso alteraría la estructura y función de compuestos biológicos. En la presente tesis, los estudios realizados con plasma humano demostraron que la HTL provocó un proceso de coagulación más lento que el control. Sin embargo, las redes de fibrina obtenidas resultaron más densas, con fibras más cortas y ramificadas, mostrando mayor resistencia a la lisis. Estos resultados sugirieron que componentes del sistema hemostático podrían ser N-homocisteinilados. En particular, se estudió el efecto de la HTL sobre albúmina, fibrinógeno, factor XIII y fibronectina. Se detectaron importantes alteraciones estructurales y funcionales en los compuestos mencionados como consecuencia de la exposición a soluciones de HTL, dependientes del tiempo de tratamiento y de la concentración del tioéster. Se evidenció la N-homocisteinilación de la albúmina por el aumento del número de grupos sulfhidrilo libres, modificando la carga neta positiva de la proteína y consecuentemente, alterando los perfiles electroforéticos obtenidos por diversas técnicas. La N-homocisteinilación del fibrinógeno produjo cambios en los procesos de formación y lisis de la fibrina similares a los observados con plasma N-homocisteinilado. Además, se demostró que la matriz de fibrina N-homocisteinilada favoreció el proceso angiogénico. La HTL provocó un aumento de la actividad de transglutaminasa del factor XIII y también de la unión de la fibronectina a fibrina. Por otro lado, se evidenció un importante efecto reductor de la HTL sobre las moléculas de fibrinógeno y fibronectina. Por lo tanto, las alteraciones mediadas por HTL detectadas en las proteínas de los sistemas puros analizados, serían responsables de los cambios observados en el proceso de coagulación del sistema plasmático. Los procesos de N-homocisteinilación in vitro descriptos en la presente tesis contribuyen al esclarecimiento de uno de los posibles mecanismos involucrados en la consecuencias fisiopatológicas de la hiperhomocisteinemia.

Objetivo del trabajo: Evaluar el éxito del tratamiento con butyl cianoacrilato en la hemostasia primaria, el resangrado y la erradicación de varices gástricas. Materiales y Metodos: Desde enero de 1999 a enero de 2008 fueron analizados en forma retrospectiva 65 casos de pacientes con varices gástricas que fueron tratados en nuestra unidad con N-Butyl-2-cianoacrilato (Histoacryl®). Se utilizó una solución de 0.5 ml histoacryl y 0.8 ml de lipiodol con un promedio de 3.46 ml de dicha mezcla por sesión (rango: 1 a 6 ml). Se emplearon agujas de esclerosis de 21 gauge, y neuroleptoanalgesia. Los datos se analizaron con el test de chi-cuadrado.

Fil:Iusem, Norberto Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.