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Dado que la transcripción en Tripanosomátidos es policistrónica, la regulación de la expresión génica en estos organismos se da principalmente a nivel post-transcripcional mediante proteínas de unión a ARN. Nuestra proteína de estudio, TbRRM1, presenta tres dominios RRM de unión a ARN y forma parte del grupo de proteínas SR-relacionadas. Previamente, se ha demostrado en nuestro laboratorio que TbRRM1 es esencial para la sobrevida en el estadio procíclico de Trypanosoma brucei ya que su silenciamiento por ARNi afecta la curva de crecimiento y produce morfologías aberrantes. En este trabajo, se propuso caracterizar a la proteína de unión a ARN TbRRM1 y estudiarla como posible blanco terapéutico para el tratamiento de las Tripanosomiasis. Para ello, se generó un sistema estable para el silenciamiento inducible de TbRRM1 en el estadio sanguíneo de T. brucei. Los resultados demostraron que, al igual que en el estadio procíclico, TbRRM1 resultaesencial en el estadio del mamífero ya que su silenciamiento produce unadisminución en la curva de crecimiento. Además, se demostró que la muerte de los parásitos se produce por un mecanismo compatible con apoptosis en ambos estadios de T. brucei. Los estudios de la cuantificación de núcleos y kinetoplastos en ambos estadios junto con el análisis del ciclo celular por marcación con ioduro de propidio y citometría de flujo demostraron queTbRRM1 es necesaria para la progresión normal del ciclo celular. Además, el silenciamiento de TbRRM1 en el estadio sanguíneo produjo la aparición de parásitos con flagelo desprendido y de células conectadas por su extremo posterior, lo que indica que TbRRM1 es necesaria para la correcta citoquinesis. Por otra parte, se evaluaron los efectos de la sobreexpresión de TbRRM1 en el estadio procíclico y se determinó que la elevada sobreexpresión de la proteína produce un fenotipo letal similar al observado luego del silenciamiento de TbRRM1.Mediante los ensayos llevados a cabo en esta Tesis Doctoral, se caracterizó a la proteína de unión a ARN TbRRM1 demostrando que es esencial para la sobrevida en ambos estadios de T. brucei. Además, dado que TbRRM1 es esencial para el parásito y que no posee ortólogos en humanos, puede ser considerada un blanco potencial para el desarrollo de drogas que permitan mejorar la calidad de vida de pacientes que padecen enfermedades causadas por Tripanosomátidos

La carcinogénesis es un proceso de múltiples pasos por el cual células normales se transforman en células tumorales. Las señales que facilitan estos procesos están lideradas en su mayoría por factores de crecimiento que actúan sobre receptores específicos regulando la progresión del ciclo celular y crecimiento e influenciando también su metabolismo y supervivencia. La interacción de las células tumorales y las células del estroma tumoral está involucrada tanto en el establecimiento como en la adquisición de determinadas características como invasividad y capacidad de generar metástasis. Por lo tanto, los cambios patológicos que se dan en el microambiente son tan importantes para el progreso de la enfermedad como las características de la célula tumoral en sí.Los factores de crecimiento insulino-símiles (IGFs) son polipéptidos relacionados estructuralmente con la Insulina, que juegan un papel importante en la regulación de la proliferación celular y en la inhibición de la apoptosis. La disrupción del balance entre los distintos componentes del sistema de los IGFs y su vinculación con el crecimiento, mantenimiento y progresión tumoral ha sido demostrada en diferentes tipos tumorales y se ha sugerido que dicho sistema tendría un rol en las etapas tempranas de transformación celular y carcinogénesis. La importancia del sistema de los IGFs en la iniciación, progresión y metástasis tumoral ha sido también confirmada mediante estudios utilizando animales modificados genéticamente.El objetivo del presente trabajo de tesis fue caracterizar el papel del sistema de los IGFs en diferentes etapas del proceso tumoral en dos modelos con importancia en pediatría. Nuestra hipótesis es que el sistema de los IGFs tiene un papel en el desarrollo tumoral tanto a nivel del establecimiento inicial del tumor como en su crecimiento y progresión. Para el estudio de las primeras etapas del establecimiento tumoral nos interesamos en el circuito local del IGF-1/ IGF-1R en las células que componen el microambiente tumoral en un modelo de feocromocitoma. Para el estudio del crecimiento y progresión tumoral nos enfocamos en los efectos de los IGFs en las células tumorales, particularmente en tumores de sistema nervioso central.El feocromocitoma es un tumor asociado con frecuencia a enfermedad endocrina familiar. Estudios previos de nuestro grupo de trabajo han demostrado la sobreexpresión del IGF-1R en feocromocitomas malignos y su valor pronóstico para la sobrevida de los pacientes con esta enfermedad. Estudios in vivo e in vitro demostraron la importancia del IGF-1 como factor de supervivencia en las células del feocromocitoma. En esta oportunidad estudiamos el IGF-1R presente en las células que componen el microambiente tumoral. Nuestros resultados in vivo, utilizando un modelo murino generado por la inyección de células de feocromocitoma (MPC) en ratones haploinsuficientes para el IGF-1R, muestran que la incidencia de tumores en estos ratones disminuye y la aparición tumoral se ve retrasada. Una vez establecidos, la proliferación, apoptosis y vascularización de estos tumores no varía respecto de los generados en ratones control. In vitro, se cultivaron los fibroblastos de ratones controles y haploinsuficientes para el IGF-1R para generar medios condicionados y matrices diferenciales con los que se cultivaron las células MPC. Encontramos que la proliferación celular fue menor cuando las MPC eran cultivadas con medios condicionados o matrices diferenciales provenientes de fibroblastos haploinsuficientes para el IGF-1R. El estudio molecular permitió confirmar en estos fibroblastos la diminución en la secreción de factores solubles, IGF-1 e IGFBP2, y de fibronectina como factor de matriz, la cual se asoció a la disminución en la expresión de integrinas en las células MPC. Nuestros datos sugieren que el IGF-1, a través del IGF-1R estaría involucrado en las etapas tempranas del establecimiento tumoral, contribuyendo al anclaje y sobrevida de las células MPC mediante la interacción con factores de solubles y de matriz producidos por los fibroblastos del microambiente.Por otro lado, los tumores de SNC son los tumores sólidos de mayor frecuencia en pediatría, siendo los gliomas el grupo mayoritario. Nuestro grupo ha demostrado que en gliomas la localización nuclear del receptor IGF-1R se asocia a un mayor grado tumoral y a menor sobrevida de estos pacientes. En el presente trabajo se caracterizó la expresión de los genes del sistema de los IGFs en tumores gliales de pacientes pediátricos separándolos según grados de malignidad. Encontramos una mayor expresión de IGF-1 en tumores de alto grado, lo que podría estar indicando un papel preponderante del circuito IGF-1/IGF-1R en esta patología.En un enfoque experimental se realizó la caracterización in vitro de la localización diferencial del IGF-1R en una línea celular de glioblastoma humano y se demostró que la localización nuclear del receptor no modifica la proliferación ni apoptosis de estas células, pero si incrementa su motilidad y metabolismo. La mayor tasa metabólica queda evidenciada por el aumento en la expresión del transportador de glucosa GLUT1, aumento en la entrada de piruvato a la mitocondria y el aumento en la síntesis de ácidos grasos. Por otro lado, en las células con IGF-1R nuclear se observa una baja acumulación de los lípidos sintetizados, por lo que se asume que estos son oxidados para obtener energía que es luego utilizada en procesos como la síntesis de proteínas, que también se encuentra aumentada. La ventaja metabólica queda manifestada in vivo con la aparición de tumores más tempranamente y de crecimiento más rápido en los casos en que el IGF-1R puede traslocar al núcleo. Estos resultados permitirían explicar, al menos en parte, el comportamiento de estos tumores de alto grado en la población pediátrica estudiada, asociado a un peor pronóstico.

Crocodilians exhibit strongly marked social behaviors and responses to stressors that can trigger serious disputes between co-specifics, predators and, even, conflict with human activities. As a result, they could show trauma, serious injuries and the loss of members. Generally, these animals live in environments containing a high concentration of pathogenic microorganisms in both, natural and captive systems. In many cases, crocodilians tolerate these situations and generally, without showing signs of illness. In this work, it was found that Caiman latirostris plasma has antibacterial properties higher than human and chicken (Gallus gallus) plasma, suggesting that the complement system (CS) could be a cause of the inhibitory effects observed. Colorimetric assay was used to detect and characterize complement system. Moreover, the CS was used as an indicator of pesticide and ultraviolet radiation effects. Finally, we performed the detection and characterization of two enzymes involved in the immune system, DPPIV and PLA2, demonstrating that both of them have higher activities in caimans compared with other vertebrates and similar to other crocodilians studied. In conclusion, we might suggest that the caimans studied have efficient and well developed innate immune system that could resist the attack of some microorganisms. The powerful complement system would be one of the components mainly involved. Such resistance could be one of the reasons for the successful and longevity of crocodilians. This work should continue leading to the detection and characterization of the components of the complement system, taking into account a possible therapeutic application in the veterinary industry.

Esta Tesis se enfoca en las manifestaciones geotermales del Valle del Cura, ubicado a los 29,5°S y 69,5°O en la Cordillera Frontal de los Andes y sobre el segmento de subducción subhorizontal pampeano-chileno. Se realizó un estudio de prospección geotérmica que incluyó métodos geofísicos (especialmente magnetotelúrica), análisis de la composición química e isotópica de fluidos (fase liquida y gaseosa), modelado geoquímico de los fluidos termales profundos, mediciones de gases en suelos, dataciones radiocarbono, análisis morfoestructural y geomorfológico, litoestratigráfico mediante testigos de pozos y de isotermas locales. Se pudo caracterizar los reservorios, zona de recarga y surgencia, tipo de fluidos, procesos profundos y controles principales y con los resultados integrados al contexto geológico-estructural se confeccionó un modelo conceptual de un sistema geotermal que incluyo su variabilidad espacial y clasificación. Los fluidos termales en Valle del Cura son de origen meteórico y el principal aporte proviene del deshielo (según δ18O, δD y Tritio). Las zonas de recarga tienen un fuerte control estructural-litoestratigráfico y la infiltración puede ser somera o hasta niveles basales de la cuenca (anomalía conductiva identificada a 5 km de profundidad infiere la presencia de salmueras), activando un sistema de circulación profunda conductivo-dominado. El reservorio está constituido por rocas volcaniclásticas del Grupo Choiyoi, es del tipo líquido-dominado y su temperatura alcanza los 180°C y hacia el sur de Despoblados experimenta un incremento en su profundidad, en la fugacidad de CO2 y una disminución de la permeabilidad. Los modelos magnetotelúricos muestran imágenes de la geometría de las zonas de surgencia: están controladas por estructuras permeables enraizadas en la corteza que actúan como conductos de circulación de fluidos termales profundos hasta niveles superficiales fríos. Durante el ascenso, los fluidos termales interactúan con acuíferos someros saturados en componentes atmosféricas a partir de procesos de mezcla, dilución y precipitación de fases minerales (más intensamente en Gollete y Bañitos). Los fluidos termales que alcanzan la superficie descargan aguas cloruradas sódicas con pH neutro y forman manantiales, suelos calcretizados y terrazas de travertino. Los manantiales están comúnmente asociados a intensa emanación de gases (principalmente CO2; mayor a 96%) y se destaca la ausencia de vapor de agua (por enfriamiento conductivo durante el ascenso) y de especies acidas en general (p.ej. H2S). Se propone la existencia de una anomalía térmica que activa la convección local, posiblemente vinculada a cuerpos subvolcánicos recientes con características similares a los emplazados en Despoblados durante el Cuaternario. La magnitud del flujo de CO2, de He y de actividad de Rn es consistente con sistemas convectivos-volcánicos. Además, el aporte de CO2 magmático al sistema geotermal fue confirmado con las composiciones isotópicas del Carbono y del Helio de las manifestaciones termales de Valle del Cura (δ13C ~-6‰ vs. PDB y R/Ra~1,45). La permeabilidad efectiva y el gradiente térmico local controlan selectivamente el dominio de la convección térmica sobre la conducción térmica de las áreas termales estudiadas. La dinámica del sistema es más intensa en Despoblados (mayor complejidad estructural, relación e interacción fluido-roca, temperatura del reservorio y aguas menos evolucionadas, con menor shift de δ18O y un reservorio más superficial) que en Gollete y Bañitos. El área de Bañitos es considerada una posición distal del sistema convectivo y no se descartan celdas de circulación de fluidos parcialmente compartimentalizadas por los lineamientos N120° del basamento. Las características químicas de los fluidos termales y del reservorio son típicas de un sistema geotermal evolucionado –maduro- y consistentes con un cuerpo magmático desgasado que originó la anomalía térmica. La neotectónica regional moderada asegura un ambiente geológicoestructural y magmático suficientemente activo para imponer una evolución del sistema geotermal mediante pulsos de actividad. Como conclusión, el sistema geotermal de Valle del Cura está caracterizado por a) una leve anomalía térmica local que vigoriza una convección tenue sobreimpuesta al sistema termal conductivo-dominado, b) reservorios de media a alta entalpía, líquido-dominados y por debajo de los 800 m de profundidad y c) una dinámica modulada por la permeabilidad efectiva y por la cercanía a la anomalía térmica, con mayor intensidad en Despoblados y que se atenúa hacia el sur. En general, se comprobó que un sistema de fallas enraizados en niveles corticales medios que favorecen la infiltración de agua en profundidad sumado a pequeñas anomalías térmicas vinculadas a la actividad magmática modulada por la neotectónica pueden generar sistemas hidrotermales profundos y sistemas geotermales de alta entalpía. Por consiguiente, el ejemplo del sistema geotermal de Valle del Cura fuerza a reevaluar el potencial geotérmico de los segmentos de subducción subhorizontal actuales, hasta el momento considerado de baja entalpía-conducción-dominados, y abre nuevas perspectivas en la exploración de estos recursos a lo largo de los Andes en zonas previamente desestimadas.

La actividad desarrollada en el campo de las lipasas vegetales es considerablemente menor que la que se lleva a cabo en el de las lipasas de mamíferos y de microorganismos, a pesar de la importancia que tiene el conocimiento de aquéllas, tanto para comprender su rol fisiológico como para analizar su posible aplicación en procesos biotecnológicos. En razón de ello, las semillas de oleaginosas deberían constituir la fuente de elección de lipasas vegetales, dado que los aceites representan su mayor sustrato energético. Por otra parte, su condición de cultivo intensivo asegura una fácil disponibilidad de material de bajo costo y elevada homogeneidad . Como ya ha sido mencionado, el girasol es la principal oleaginosa cultivada en nuestro país, correspondiendo a la Provincia de Buenos Aires más de la mitad de su producción. Sin embargo, más allá de algunos intentos aislados, la información de la que se dispone sobre el sistema lipolítico responsable de la movilización de los lípidos de reserva de esta especie es prácticamente nula, motivos que decidieron la elección del material utilizado en el presente estudio y que persigue los siguientes objetivos específicos: 1. Conocer cómo progresa la degradación de los lípidos de reserva de las semillas de girasol durante la germinación de las mismas y establecer la correlación existente con la gluconeogénesis. 2. Comprobar la existencia de actividad lipolítica en semillas en dormancia y analizar la manifestación de la misma en el curso de la germinación. 3. Determinar la localización subcelular del sistema lipolítico y establecer sus condiciones óptimas de acción in vitro. 4. Estudiar el efecto de iones, detergentes e inhibidores enzimóticos sobre el comportamiento del sistema lipolítico. 5. Establecer si el sistema lipolítico manifiesta alguna especificidad por los triacilglicéridos que componen el aceite y por los ácidos grasos que forman parte de aquéllos.

En este trabajo analizamos el rol de TGF-β en la progresión tumoral, empleando dos modelos de adenocarcinoma murino, de mama y de pulmón. Nuestro modelo de tumor de mama está constituido por los tumores parentales M3 y MM3, poco y altamente metastásicos, respectivamente, y por las lineas celulares derivadas LM3 y LMM3, altamente invasivas y metastásicas. Todas las células de nuestro modelo expresan el sistema completo TGF-β y sus receptores específicos TβRs, y éste es funcional. Además, mediante estudios in vitro determinamos que TGF-β activa la vía de transducción de señales Smads y otras vias, como p38Mapk y MEK/ERK, en las células de carcinoma de mama de nuestro modelo. En cuanto a su acción biológica, TGF-β tiene un efecto antiproliferativo sobre los cultivos primarios de M3 y MM3, mientras que las líneas son resistentes a dicho efecto. Por otra parte, TGF-β induce la actividad de MMP-9 en todas las células de nuestro modelo. Determinamos por primera vez que las vías de señalización p38Mapk y MEK/ERK bloquean la inducción de MMP-9 por TGF-β y que los receptores de señalización TβRI y TβRII son esenciales en esta respuesta. Además, estudiamos el rol de TGF-β sobre la expresión y/o actividad de distintos componentes del sistema de activación del plasminógeno, incluyendo activadores como el uPA y el uPA unido a membrana, e inhibidores como PAI-1. Detectamos que TGF-β inhibe el balance neto de este sistema en las células poco metastásicas, mientras que lo estimula en las células de fenotipo más agresivo. Por otro lado, analizamos la función de TGF-β en la reorganización del citoesqueleto de acfina y determinamos que TGF-β no modula las tropomiosinas ni la proteina HSP27, moléculas relacionadas con actina. Sin embargo, demostramos por primera vez que la actividad del complejo Arp2/3, fundamental en la polimerización de actina, aumenta en respuesta a TGF-β,si bien su consecuencia biológica debe aún esclarecerse mediante otros estudios. Además, TGF-β induce una leve remodelación de la actina cortical en nuestro modelo, sin producir cambios fenotípicos como la formación de fibras de stress y la transición epitelio-mesenquimática como ocurre en sistemas epiteliales no-tumorigénicos. Asimismo, determinamos que la via de señaligación MEK/ERK bloquea la formación de fibras de stress en las células tumorales en estudio y que además está involucrada en la inducción de la migración celular por TGF-β, junto con la vía p38Mapk. Por otra parte, TGF-β estimula la capacidad invasiva in vitro de todas las células de nuestro modelo de tumor de mama. Observamos que la presencia de TβRI y TβRII funcionales, así como las vías de señalización p38Mapk y MEK/ERK, son esenciales en este proceso. Estos datos son muy novedosos, ya que no ha sido descripto previamente un mecanismo de acción de TGF-β en la invasión celular. Mediante estudios in vivo determinamos que TGF-β no modula la capacidad angiogénica en nuestro modelo. Por otro lado, empleando células LM3 transfectadas con formas dominantes negativas de los receptores de señalización de TGF-β, encontramos que la tasa de crecimiento tumoral y la capacidad metastásica de las células de adenocarcinoma mamario en estudio dependen de un sistema funcional TGF-β/TβRs. Por otro lado, estudiamos el sistema TGF-β/TβRs en la línea de adenocarcinoma de pulmón LP07, altamente metastásica. Encontramos que estas células han perdido la capacidad de expresar la proteina TGF-β, respecto del tumor P07 que le dio origen. Además, determinamos que las células LP07 expresan los receptores de señalización TβRI y TβRII. Por medio de estudios in vitro detectamos que si bien las células LP07 no producen TGF-β, la via de Smads y otras vías de transducción de señales pueden ser activadas por TGF-β, por lo que son capaces de responder a la citoquina. Así, TGF-β es un potente inhibidor del crecimiento de LP07. Además, TGF-β inhibe marcadamente la actividad de las proteasas uPA y MMP-2 en las células LPO7 y controla su motilidad in vitro. Y también es capaz de inhibir la angiogénesis in vivo de LP07. De este modo, nuestros resultados indican que TGF-β podría funcionar como un supresor tumoral en nuestro modelo de adenocarcinoma de pulmón, y que la pérdida de funcionalidad del sistema TGF-β/TβRs podria contribuir a la progresión tumoral en estas células.

Los prolactinomas son tumores benignos que en general responden bien al tratamiento con agentes dopaminérgicos. Sin embargo alrededor del 15% de estos tumores son resistentes y aún no existen terapias médicas alternativas. TGF-β1 es un inhibidor de las funciones del lactotropo, y un intermediario de la inhibición que ejerce la dopamina, por lo tanto, resulta un candidato atractivo como blanco terapéutico para prolactinomas resistentes. El objetivo de la presente tesis fue caracterizar el sistema TGF-β1 hipofisario y la regulación de sus componentes, incluyendo los niveles de citoquina total y activa, sus proteínas de latencia (LTBPs) y activadores locales, para evaluar su posible utilidad para el desarrollo de nuevas terapias. Utilizamos dos modelos experimentales de prolactinomas: 1) ratones hembra con mutación nula del receptor dopaminérgico D2 (Drd2-/-); y 2) ratas tratadas crónicamente con estrógenos. Nuestros resultados demuestran que el sistema TGF-β1 se encuentra inhibido en las hipófisis tumorales de ambos modelos. Describimos por primera vez en la literatura una regulación diferencial de los niveles de TGF-β1 activo hipofisario por dopamina y estrógenos que podría explicar en parte las diferencias sexuales en la formación de prolactinomas. Determinamos la expresión de las tres isoformas de LTBPs capaces de unir TGF-β1, y su regulación frente a estímulos con estrógenos y agentes dopaminérgicos. Por último, identificamos a trombospondina 1 (TSP1) y calicreína 1 (KLK1) como posibles activadores de TGF-β1 a nivel local. Asimismo, ensayamos la eficacia de un tratamiento con péptidos análogos de TSP1 (ABT-510 y ABT-898) en el modelo de ratas estrogenizadas. Este tratamiento logró disminuir los niveles de prolactina sérica y el tamaño hipofisario incrementados por los estrógenos. Nuestro estudio contribuye al conocimiento del sistema TGF-β1 hipofisario y su regulación local. Siendo TGF-β1 un inhibidor de la función del lactotropo, proponemos que la restauración de su actividad local podría ser efectiva para frenar el crecimiento de prolactinomas resistentes a los tratamientos clásicos.

Tesis (MCI Mención Recursos Hídricos)--FCEFN-UNC, 2017

Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Ciencias Veterinarias, de la Universidad de Buenos Aires, en 2016

La obtención natural o artificial de mutantes es una propiedad común a todos los virus. Estas mutantes se pueden caracterizar por su sensibilidad a la tenperatura, por su patogenicidad en diferentes animales, por su especificidad hacia un determinado huésped, etc.. Cepas atenuadas aisladas en distintos sistemas virales han sido utilizadas como agentes vacunantes con resultados muy alentadores. Actualmente, se están empleando en Venezuela cepas de virus de la fiebre aftosa atenuadas para bovinos en la producción de vacunas. Estas cepas han sido utilizadas teniendo en cuenta su bajo grado de patogenicidad y alta calidad inmunogénica. Sin embargo, el criterio por el cual fueron seleccionadas es altamente empírico ya que se conoce muy poco acerca del mecanismo de atenuación. Principalmente, habian sido estudiadas en cuanto a sus caracteristicas biológicas de multiplicación respecto de las cepas virulentas. En base a lo previamente expuesto, se plantearon los siguientes objetivos para este tema de tesis: 1°) El estudio de los factores celulares y/o virales que influyen en el mecanismo de atenuación. 2°) Las caracteristicas inhibitorias de la multiplicación del virus salvaje por las cepas atenuadas. Estos objetivos fueron enfocados a traves de tres puntos principales: - Caracterización biológica del virus atenuado (infecciosidad, ciclo de multiplicación, etc.). - Caracterización de la interferencia por el virus atenuado en la multiplicación del virus salvaje. - Caracterización fisiquuímica del virus atenuado y de sus componentes (coeficiente de sedimentación, densidad, análisis de su genoma).