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Fil:Ibañez, Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínas que se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). En el presente trabajo de tesis se caracterizaron y clonaron proteínas candidatas a participar en el control del ciclo celular de T. cruzi. Se secuenciaron en su totalidad los fragmentos de los genes obtenidos por doble híbrido y se los denominó TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Además se clonaron los genes completos y se secuenciaron. La secuencia predicha para las tres proteinas mostró similtud con ciclinas denominadas PHO, presentes en S. cerevisiae. TzCYC5 posee una región rica en histidinas próxima al amino terminal. Se determinó que los tres genes son de copia única mediante Southern blot y por rastreo de una biblioteca genómica. La expresión de los tres genes mostró variaciones particulares en distintos estadios de T. cruzi. TzCYC6 complementó una cepa mutante de S. cerevisiae, deficiente en las ciclinas de G1, demostrando que es una ciclina funcional. Se determinó el patrón de expresión de TzCRK3 en estadíos de T. cruzi. El ARNm de TzCRK3 es más abundante en el estadío amastigotes que en epimastigotes o tripomastigotes. Se obtuvo un suero específico contra TzCRK3, inmunizando conejos con la proteína recombinante expresada en bacterias. Ensayos de Western blot mostraron, en epimastigotes la presencia de una proteína del peso molecular esperado, 35 kDa. En amastigotes y tripomastigotes, se observaron bandas específicas de menor movilidad. Se estableció que la proteina identificada en epimastigotes se asocia a p13ˢͧͨ¹-agarosa, proteína con alta afinidad por CDK1. TzCRK3 endógena mostró actividad quinasa de histona H1 y fue inhibida por inhibidores de CDKs: flavopiridol, roscovitina y olomoucina. Flavopiridol inhibió el crecimiento de epimastigotes en cultivo, aunque no en forma total. La actividad quinasa de la TzCRK3 de dichos epimastigotes se inhibió en forma dosis dependiente. La actividad de quinasa de histona H1 asociada a p13ˢͧͨ¹ mostró las mismas variaciones estadío especificas y similar sensibilidad a los CK1s que TzCRK3. En los cultivos con flavopiridol el IC50 no mostró diferencias significativas con el de TzCRK3. La actividad de TzCRK3 en epimastigotes sincronizados mostró un pico en G2/M mientras que la actividad asociada a p13ˢͧͨ¹ aumentó al mismo tiempo pero no disminuyó hasta M. La expresión de TzCRK3 fue constante. Los patrones de actividad y expresión de TzCRK3 son tipicos de una CDK. Esta evidencia indica que TzCRK3 está involucrada en el control del ciclo celular de T. cruzi, controlando el pasaje de G2/M, aunque no se puede excluir la presencia de otra CDK. Se identificó un EST con alta similitud de secuencia con Lmmp12ͨᴷˢ¹, el gen homólogo a p13ˢͧͨ¹ en Leishmania mexicana. Se clonó el gen completo y se determinó que es copia única. La secuencia esperada de la proteína muestra una alta identidad de secuencia con la familia de proteinas CKS. Su expresión mostró variaciones estadío especificas. La proteina recombinante se expresó en bacterias, en fusión a histidinas, se la purificó y se inmunizaron conejos para obtener un anti suero.

Two CDC2-related protein kinase genes (crk), tzcrk3 and tzcrk1, were cloned from the parasite Trypanosoma cruzi. Recombinant proteins were used to raise specific antisera. Antibodies anti-TzCRK1 recognized a protein of 33 kDa in the three forms of the parasite. This antiserum showed that TzCRK1 is localized in the cytosol, kinetoplast and nucleus, and is constitutiver expressed though the cell cycle. Purified anti-TzCRK1 IgGs, immunoprecipitated a kinase activity which phosphorylated histone H1 and Rb. The recombinant GST-TzCRK1 had high in vitro kinase activity in the absense of regulatory proteins. CDC2 and CDKZ specific inhibitors could not abolish the TzCRK1 kinase activity. Transfection of COS-7 cells with tzcrk1 demonstrated for the first time that a CRK protein can bind mammalian cyclins; TzCRK1 co-immunoprecipitated with cyclins E, D3 and A suggesting a role for this kinase in cell cycle control. The TzCRK3 antisera recognized a 40 kDa protein in membrane and nuclear fractions and a 54 kDa protein in the citosolic fraction. The p13SUC1 protein coprecipitated a kinase activity from the citosol of the epimatigote stage. Yeast complementation assays showed that these T. cruzi CRKs, could not rescue the yeast CDC28 function. The two hybrid system was used to identify and clone proteins that associate to TzCRK1. Three clones were identified, which code for proteins with identity to cyclins from the PREG and PHo80 family. In other organisms, these cyclin like proteins are involved in the control of phosphate metabolism. In S. cerevisiae, PH080 binds to the CDK protein PHO85, which controls the transcription of the acid phosphatase gene and participates in the regulation of the cell cycle. These results suggest that TzCRK1 could be involved in cell cycle progression and/or in other processes such as phosphate metabolism.

Se ha postulado la hipótesis de un origen autoinmune para explicar la etiología de la enfermedad de Chagas. Este proceso autoinmune podría ser el resultado de una respuesta inmune cruzada contra componentes específicos de células cardíacas que comparten epítopes con antígenos de Trypanosoma cruzí (mimetismo molecular). En trabajos anteriores demostramos que los anticuerpos de pacientes crónicos, inmunopurificados con el péptido correspondiente a los 13 aa C-terminales de la proteína ribosomal P28 de T. cruzi (TcP2β),alteraron la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ya que también podían reconocer el segundo bucle de los receptores cardiacos (M2 muscarínicos y β-adrenérgícos). Lo mismo ocurrió con los inmunopurificados contra un péptido correspondiente a la proteína ribosomal P0 (TcP0). Tanto los epítopes parasitarios como los del hospedador reconocidos por estos anticuerpos estaban formados por secuencias aminoacídicas ácidas. En la búsqueda de nuevos antígenos que pudieran producir este tipo de reacción cruzada, se propuso el rastreo de ESTs (Expressed Sequence Tags) producidos en el Proyecto Genoma T. cruzi que codificaran para proteínas ricas en secuencias ácidas. De este modo se aisló un EST de 718 pb. Se obtuvo la secuencia completa del gen que denominamos garp (glutamic acid rich protein) de 3500 pb, que es de copia única y origina un único ARNm de aproximadamente 4 kb. Según la comparación de secuencias se encontró una identidad de hasta 72% con secuencias de T. brucei. La proteína es de 130 KDa, y según ensayos de Western blot e inmunofluorescencia se localiza en el citoplasma del parásito. Aproximadamente el 20% de los sueros de pacientes con la enfermedad de Chagas crónica fueron capaces de reconocer la proteína recombinante GARP, y todos ellos lo hicieron con la región más C-terminal de la proteína, que contiene los aminoácidos ácidos. La inmunización con la proteína recombínante GARP provocó la aparición de anticuerpos dirigidos contra toda la proteína. Estos anticuerpos no modificaron la frecuencia de latidos de los cardiocítos en cultivo, y consecuentemente los ratones no sufrieron alteraciones electrocardiográficas. Como un método alternativo de inmunización, ensayamos la metodologia de inmunización con ADN. Con esta técnica de inmunización se pretendía reflejar mejor la situación de la infección crónica, ya que la presentación constantes de los antígenos parasitarios por las células musculares del hospedador podría ser mas adecuada para estudiar la patogenicidad de la enfermedad. Para poner a punto esta metodología, realizamos inmunizaciones con las proteínas ribosomales TcP2β y TcP0. Las inmunizaciones de ADN con TcP2β ,TcP0 y GARP generaron anticuerpos capaces de reconocer epítopes diferentes a los reconocidos en la infección natural. Los anticuerpos no provocaron alteraciones en la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ni se observaron alteraciones electrocardiográficas tales como las ocurridas cuando ratones fueron inmunizados con proteínas recombinantes TcP2β y TcP0. Por tanto concluimos que la inmunización con ADN es capaz de generar anticuerpos que reconocen epítopes diferentes a los inducidos por inmunizaciones con proteínas recombinantes o por la infección natural, lo cual es de utilidad al momento de generar una vacuna contra T. cruzi.

En este trabajo se clonó y se caracterizó estructuralmente un gen de tomate (Asr2), homólogo a un cADN inducible por ácido abscísico (ABA), estrés hídrico y maduración (Asr1) previamente clonado. Por otro lado, se comprobó la existencia de una familia génica, de por lo menos tres miembros, localizada en el cromosoma 4 a la cual pertenecen Asr1 Asr2. Para conocer la funcionalidad de la región 5' de Asr 2 en la expresión génica, estas secuencias fueron fusionadas al gen de la Β-glucuronidasa (GUS). Con la construcción resultante, se llevaron a cabo ensayos de expresión transitoria en Carica papaya L. mediante cañón génico y se obtuvieron plantas transgénicas de papaya, tabaco y papa vía cañón génico y A. tumefaciens. Los resultados muestran que la región 5' de Asr2 posee funciones de promotor in vivo y que además el ABA modula la expresión de GUS en ambos sistemas, transitoria y estable.

La ubicuitina es una proteína de 76 residuos aminoacídicos altamente conservada en la escala evolutiva, que se encuentra en todos los organismos eucarióticos, libre o conjugada covalentemente a proteínas. La función fisiológica de ubicuitina está relacionada con el camino de degradación proteica dependiente de ATP por vía no lisosomal, con la regulación del ciclo celular y con la respuesta a diferentes condiciones de estrés. A pesar de que la ubicuitina está codificada por una familia multigenética, ninguno de ellos lo hace para la proteína madura, sino para un precursor en el que la ubicuitina se encuentra fusionada por su extremo C-terminal a si misma (arreglo en tándem cabeza-cola en poliubicuitina), o bien, a una secuencia aminoacídica no relacionada con motivos de unión a ácidos nucleicos. En Neurospora crassa, la inhibición parcial de la sintesis proteica por tratamiento con cicloheximida, pero no con puromicina, conducen a un aumento de la población de transcriptos de poliubicuitina. Otras situaciones de estrés como ayuno, crecimiento en presencia de análogos de aminoácidos, estrés térmico, tratamiento con arsenito de sodio, que son inductores en otros organismos de la transcripción de este gen, no tienen efecto en Neurospora crassa. En nuestro laboratorio se aislaron y caracterizaron dos genes de ubicuitina de Neurospora crassa que corresponden, i) al gen de poliubicuitina y ii) a un gen de fusión. Estos genes clonados reconocen especies de ARN de 1,3 y 0,7 Kb, respectivamente en Northern blots. Los análisis de Southern blots parecerían indicar la existencia de un locus único para el gen de poliubicuitina que contiene 4 repeticiones en tándem cabeza-cola con un aminoácido extra fusionado al C-terminal del último monómero. El gen de fusión de Neurospora crassa corresponde a una unidad que codifica para ubicuitina ligada a una extensión de 78 aminoácidos, y su expresión se encuentra particularmente aumentada en conidias germinadas y en fase logarítmica. Las extensiones de fusión de ubicuitina pertenecen a una familia de proteínas ribosomales que además, están involucradas en el procesamiento del rARN de ambas subunidades. En condiciones de mayor replicación celular, los mensajeros correspondientes a estos genes de fusión se expresan activamente, como se encontró en Neurospora crassa. Se comprobó que el transcripto de 0,7 Kb no sufre variación en respuesta a los estrés estudiados, y que su expresión se reduce por ayuno. La comparación de la secuencia aminoacídica codificada por estos genes con la encontrada en otros organismos, contribuye a confirmar la alta conservación evolutiva de esta proteína. Sin embargo, el comportamiento particular de la respuesta al estrés en este organismo, plantea algunos nuevos interrogantes respecto a la regulación de la expresión del gen de poliubicuitina.

El presente trabajo consta de 2 capítulos. El primer capítulo describe: • el clonado, la expresión y la purificación de la proteína LIC10365; • la producción de antisuero contra la proteína recombinante; • el análisis del grado de conservación y expresión de LIC10365 entre diferentes serotipos de leptospira; • el estudio de su expresión durante la infección in vivo; • el estudio de su capacidad para activar a la célula endotelial. El segundo capítulo describe: • la construcción de 1 clon codificante de la proteína CTB en fusión con LipL32; • la expresión y purificación de la proteína recombinante; • la producción de antisuero contra la proteína recombinante; • el análisis de la reactividad de la proteína recombinante contra sueros de pacientes convalecientes; • el estudio de la capacidad de la proteína recombinante para proteger a animales inmunizados con la misma frente a la infección con leptospiras patogénicas; • el análisis de la respuesta inmune de los animales inmunizados.

El metabolismo de polímeros de ADP-ribosa (PAR) está involucrado en múltiples funciones celulares, como la señalización y reparación del ADN, el mantenimiento de la integridad genómica, la decisión entre la supervivencia y muerte celular y el mecanismo de muerte. Poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) y poli(ADPribosa) glicohidrolasa (PARG) son las proteínas involucradas en esta vía metabólica. PARP es la enzima encargada de sintetizar al polímero, mientras que PARG es responsable de su degradación. En Trypanosoma brucei ambas proteínas, denominadas TbPARP y TbPARG, son codificadas por un gen de copia única. En la presente tesis se muestra la caracterización de la actividad de TbPARP in vitro en la reacción de PARilación. Estudios funcionales de TbPARP y TbPARG en el contexto del parásito permitieron identificar su localización subcelular en condiciones normales y de estrés oxidativo. También se describe aquí la cinética de aparición de PAR en el núcleo. Mediante la obtención de líneas transgénicas de parásitos procíclicos sobreexpresantes de TbPARP y silenciados (ARNi) para ambas enzimas se realizaron ensayos de supervivencia a distintas concentraciones del agente genotóxico H2O2. Los mismos presentaron diferentes grados de citotoxicidad y variaciones en el mecanismo de muerte celular de acuerdo a la presencia o ausencia de polímero en el núcleo. También se estudió el efecto de la acumulación nuclear del polímero sobre la progresión del ciclo celular en cultivos transgénicos sincronizados. Palabras claves: Trypanosoma brucei, PARP, PARG, PAR, ciclo celular, estrés oxidativo, Enfermedad del sueño.

En este trabajo se estudiaron distintos aspectos a nivel molecular del mecanismo catalítico de la nitrito reductasa de cobre (NirK), una enzima que cataliza la reducción de nitrito (NO2-) a óxido nítrico (NO) en la desnitrificación. Estas enzimas se clasifican de acuerdo a sus propiedades espectroscópicas en verdes y azules. El trabajo se desarrolló a partir del estudio de dos NirK producidas de manera recombinante, una verde obtenida del microorganismo Sinorhizobium meliloti 2011 (SmNirK), y otra azul obtenida de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (BjNirK). Los dos microorganismos son bacterias desnitrificantes de importancia económica para la región por su uso en la formulación de bioinoculantes. Ambas NirK presentan una estructura homotrimérica con dos sitios de cobre por monómero denominados T1Cu y T2Cu, en línea con la mayoría de las NirK caracterizadas. El centro T1Cu, el cual le confiere el color característico a la enzima, es un centro de transferencia electrónica (TE). El T2Cu es el sitio activo en donde ocurre la unión y reducción del sustrato. Las NirK requieren de un dador electrónico fisiológico para llevar a cabo la catálisis, los cuales también fueron producidos de manera recombinante y caracterizados. El dador electrónico fisiológico de la SmNirK es una proteína de cobre mononuclear denominada pseudoazurina (SmPaz), mientras que para BjNirK es un citocromo c (BjCitc550). El mecanismo catalítico de las NirK puede ser dividido en líneas generales en tres procesos. El primer proceso de TE resulta de la interacción de la NirK con el dador electrónico fisiológico. Esto implica la transferencia de un electrón desde el dador electrónico reducido al T1Cu de la NirK (TE interproteína). El segundo proceso de TE ocurre desde el T1Cu reducido al sitio activo T2Cu (TE intraproteína), lo que permite la reducción del sustrato (NO2-) unido al sitio y liberación del producto (NO) (tercer proceso). El proceso de TE intraproteína ocurre a través del puente estructural Cis-His que conecta los dos sitios de Cu en las NirK. En este puente coexisten dos vías estructurales que potencialmente pueden actuar como camino de TE. Una de estas vías involucra el camino covalente Cis-His, mientras que la segunda vía involucraría un camino mixto formado por enlaces covalentes y el puente de hidrógeno establecido entre el O del carbonilo de la Cis y el Nδ1 del imidazol de la His (Nδ1H...O=C). Sobre la base de estudios computacionales se ha propuesto que las NirK azules utilizarían la primer vía mientas que las verdes utilizarían la segunda. La determinación de los potenciales formales de reducción (E0’) de los centros de cobre de la forma as-purified de SmNirK mediante titulaciones potenciométricas permitió concluir que, en línea con la mayoría de las NirK, E0’ T1Cu > E0’ T2Cu. Estos valores definen un proceso de TE T1Cu→T2Cu termodinámicamente desfavorable en la enzima. Los resultados obtenidos a partir de ensayos de EPR sugieren que los valores relativos de los E0’ se invierten como consecuencia de la interacción SmPaz/SmNirK en presencia de sustrato favoreciendo el proceso de TE. La TE intraproteína en esta enzima también fue estudiado cambiando los aminoácidos del puente Cis-His mediante mutagénesis sitio dirigida. Las variantes obtenidas resultaron inactivas frente a SmPaz. Modelos estructurales obtenidos mediante estudios computacionales del tipo QM/MM, junto con los resultados experimentales, sugirieren que la falta de actividad se debería a una interrupción de la TE intraproteína, posiblemente por la ausencia del puente de hidrógeno Nδ1H...O=C.Los resultados obtenidos para las variantes de SmNirK derivaron en el estudio de la relevancia de la estructura Nδ1H...O=C en la TE intraproteína de las NirK verdes y azules y en la dependencia de la actividad catalítica de las NirK con el pH del medio. Esto fue realizado mediante estudios dependientes del pH en las dos NirK en los cuales se monitorearon los estados de oxidación de los dos centros mediante espectroscopía UV-vis y EPR luego de varios ciclos redox de la enzima en condiciones catalíticas. Los resultados más importantes de estos estudios mostraron que a pH 10, condición en la cual las NirK se vuelven inactivas, el T2Cu mantiene la capacidad de unir y reducir el sustrato aunque a una tasa no detectable por los ensayos cinéticos utilizados. Esto se atribuye a que el alto pH produce el desacople entre el proceso de TE intraproteina y del proceso de unión nitrito-T2Cu, lo cual se originaría por la ruptura del puente Nδ1H...O=C. Otro de los resultados relevantes es que en las dos NirK el puente Nδ1H...O=C se comportaría como el único camino de TE, lo que implicaría que la estructura electrónicas del T1Cu no determina el camino de TE.

Epimastigotes de Trypanosoma cruzi, el protozoo parásito que causa la enfermedad de Chagas, contienen dos glutamato dehidrogenasas diferentes (GluDHs), NAD y NADP dependientes. En este sentido los parásitos se asemejan a las bacterias, hongos y plantas y se diferencian de animales superiores que poseen sólo una enzima inespecífica para coenzima. La GluDH-NADP dependiente (EC 1.4.1.4) es un hexámero formado por subunidades idénticas de 47kDa, mostrando ser muy semejante a la correspondiente enzima de E. coli en cuanto a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal. La forma NADP dependiente podría ser biosintética mientras la forma NAD dependiente podría tener un rol catabólico. La GluDH-NADP dependiente fue purificada a homogeneidad proteica a partir de epimastigotes de Trypanosoma cruzi mediante un protocolo mejorado que incluye cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. Se determinó la secuencia de aminoácidos de 11 péptidos internos, obtenidos por digestión con BrCN, tripsina, endopeptidasa Arg-C o endopeptidasa Lys-C. Dichas secuencias, correspondientes aproximadamente al 30% de la molécula, mostraron una identidad del 74% con la enzima similar de E. coli. Utilizando un suero policlonal monoespecífico producido contra la proteína purificada se realizó el rastreo de una biblioteca de expresión genómica de T. cruzi en el vector λgt11. De esta forma pudo seleccionarse un único clon conteniendo 270 pb correspondientes al extremo 3' del gen que fue secuenciado completamente. Reacciones de PCR usando iniciadores construídos de acuerdo a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la enzima madura y con la secuencia del clon correspondiente al extremo C-terminal pudieron clonarse y secuenciarse dos ORFs completos (TcGluDH1 y TcGluDH2). Las secuencias obtenidas muestran mayor homología con la enzima de Escherichia coli (70-72% de identidad), y menor homologia (52-57%)con la correspondiente enzima de eucariontes inferiores. A partir de la secuencia de ADN se predijo una proteína que contiene 446 aminoácidos. Usando el gen TcGluDH1 como sonda se realizaron experimentos de Southern blot, usando fragmentos de restricción o cromosomas enteros separados por electroforesis en campo pulsado, indicando variaciones entre los diferentes clones y cepas de parásitos, sugiriendo la presencia de varios genes codificando para la GluDH-NADP. La expresión de la enzima resultó ser diferente en los distintos estadíos del desarrollo. La forma epimastigote presenta mayor cantidad de ARNm y proteína (a juzgar por la actividad enzimática y ensayos de Western blot), en comparación con otras formas del parásito. El gen clonado TcGluDH1 fue expresado en E. coli, produciendo una enzima recombinante activa con constantes cinéticas similares a la enzima natural. A pesar de que las evidencias bioquímicas sugieren que la enzima se localiza tanto en el citoplasma como en la mitocondria, nuestros resultados indican una localización exclusivamente citosólica para la GluDH-NADP.