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El objetivo delpresente trabajo de tesis fue analizar la influencia de la exposición perinatal a Bisfenol A (BPA) o Dietilstilbestrol (DES) sobre la diferenciación funcional de la glándula mamaria (GM) de la rata durante la preñez y la lactancia. Para esto ratas Wistar preñadas (F0) fueron expuestas a través del agua de bebida a 0, 0.6 y 52 ug de BPA/kg/día o 5 ug de DES/kg/día desde el día de gestación 9 hasta el destete. Luego de la pubertad, las hembras F1 fueron preñadas y las muestras fueron obtenidas para evaluar la influencia de la exposición perinatal a BPA o DES sobre la síntesis, composición y producción láctea, así como también los mecanismos moleculares involucrados en la regulación del gen beta-caseína al inicio de la lactancia. Nuestros resultados demuestran que la exposición a BPA no solo modifica la composición proteica de la leche, sino que también la síntesis y perfil de ácidos grasos de la leche, modificando la calidad de la leche y comprometiendo el normal crecimiento de las crías. Además, la menor expresión de beta-caseína inducida por la exposición a BPA durante la activación secretoria de la GM ocurre a través de diferentes mecanismos moleculares que actúan sinérgicamente. Siendo las modificaciones epigenéticas un potencial mecanismo de acción del BPA. En conclusión, estos resultados muestran la elevada sensibilidad de las crías a cualquier perturbación endocrina durante el período embrionario y neonatal, y las consecuencias a largo plazo producidas por su acción sobre la diferenciación funcional de la GM.

En esta tesis doctoral nuestra hipótesis general postula que la exposición a químicos clasificados como xenoestrógenos en períodos hormono-sensibles del desarrollo induce alteraciones en procesos críticos del desarrollo normal de las gónadas y el tracto reproductor femenino, impactando negativamente en la capacidad reproductiva en la vida adulta. Entre los xenoestrógenos más utilizados estudiamos al Bisfenol A (BPA) y al Dietilestilbestrol (DES). En el Capítulo 1: Disfunciones ováricas en ratas adultas nacidas de madres tratadas con bajas dosis de BPA por vía oral, nuestros resultados muestran que el BPA es capaz de afectar los estadíos tempranos del desarrollo ovárico con consecuencias en la edad adulta. En el Capítulo 2: Efectos del BPA sobre la respuesta ovárica al tratamiento con gonadotrofinas exógenas en ratas, demostramos que la exposición perinatal a BPA, condiciona la capacidad de respuesta del ovario a un tratamiento con gonadotrofinas exógenas. En el Capítulo 3: Acción del BPA en el ensamblado folicular en cultivos de ovarios enteros, demostramos que tanto en ratas como en ratones OCT4-GFP, el BPA es capaz de impactar de forma directa sobre el ensamblado folicular. Finalmente en el Capítulo 4: demostramos que la exposición neonatal a xenoestrógenos altera la respuesta ovárica al tratamiento con gonadotrofina en corderas. Los resultados detallados en esta tesis doctoral fundamentan la preocupación mundial por la creciente exposición a estrógenos ambientales, y demuestran que el desarrollo folicular y la síntesis esteroidogénica ováricas son un blanco de acción constante de los mismos.

El término perturbador endocrino (PE) refiere a sustancias con capacidad de imitar o antagonizar a las hormonas endógenas. Entre los más utilizados y estudiados podemos mencionar a dos xenoestrógenos sintéticos: Bisfenol A (BPA) y dietilestilbestrol (DES). El objetivo de esta tesis fue determinar si la exposición postnatal temprana a DES ó BPA altera el desarrollo del ovario de oveja lo que podría provocar consecuencias reproductivas durante la vida adulta. Se realizaron 3 experimentos:1) Se estudió mediante IHQ la ontogenia de los receptores de hormonas esteroides (REalfa, REbeta, RA) en muestras de ovario de corderas en los días postnatales 1, 5, 10 y 30. 2) Se determinaron los efectos de la exposición a los xenoestrógenos sobre el desarrollo del ovario en el día postnatal 30.Se evaluó: el peso del ovario; parámetros que determinan el desarrollo folicular (dinámica folicular, reserva total de ovocitos, incidencia de FMOs y porcentaje de folículos atrésicos. 3) Fue diseñado para investigar si la exposición postnatal a xenoestrógenos afecta la funcionalidad ovárica. Resultados: a) Las corderas expuestas a DES y BPA presentaron una disminución de la reserva de folículos primordiales y un aumento del desarrollo folicular. b) La exposición a BPA redujo el peso ovárico e incrementó la incidencia de FMOs. c) Las corderas expuestas a BPA o DES desarrollaron un menor número de folículos ≥2 mm y menor número de folículos atrésicos en respuesta al tratamiento con oFSH. La exposición postnatal a dosis bajas de BPA y DES alteró tanto el desarrollo como la funcionalidad ovárica en el modelo utilizado.

El sistema endocannabinoide (eCB), compuesto por los receptores cannabinoides (rCB1 y rCB2), ligandos endógenos (endocannabinoides), y enzimas de síntesis y degradación, está presente en el cerebro desde etapas muy tempranas de su desarrollo. En este periodo, el sistema eCB está involucrado en la regulación de la proliferación de progenitores neuronales, en la especificación, la migración y la diferenciación de neuronas piramidales e interneuronas y también en la sinaptogénesis. El consumo de marihuana durante la gestación representa un gran riesgo para el desarrollo del sistema nervioso central de los fetos, dado que el Δ9‐ tetrahidrocannabinol, el principal compuesto activo del cannabis, atraviesa la placenta y la barrera hemato‐encefálica. Estudios realizados en niños y adolescentes cuyas madres consumieron marihuana durante el embarazo, documentaron anormalidades cognitivas y comportamentales. En este trabajo se demostró la expresión del rCB1 durante la corticogénesis en neuronas postmitóticas en migración, así como en diversas poblaciones neuronales. Además, el presente trabajo aporta evidencias sobre los efectos que produce la exposición materna a un agonista cannabinoide sobre las neuronas postmitóticas en migración y la diferenciación de neuronas del linaje glutamatérgico. Estos resultados contribuyen al conocimiento sobre los sustratos neurobiológicos que determinarían los cambios neuro‐comportamentales que persistentes en las funciones cerebrales durante la vida postnatal. Asimismo, se demostró que ratones CB1 knockout mostraron una disminución en el número de progenitores intermedios y un aumento en el número de neuronas postmitóticas glutamatérgicas. Durante la vida postnatal, la deleción del rCB1 indujo una distribución de interneuronas anormal. En suma, los resultados obtenidos en este trabajo constituyen avances originales sobre el papel del sistema endocannabinoide en el desarrollo de la corteza cerebral.

Insecticidas organofosforados, carbamatos y neonicotinoides son comúnmente utilizados para el control de plagas en agricultura. Su mecanismo de acción, la inhibición dela enzima acetilcolinesterasa (organofosforados y carbamatos) o la unión a los receptores nicotínicos de acetilcolina (neonicotinoides), les confiere una toxicidad poco selectiva afectando también a especies no blanco. En el presente estudio, nos propusimos evaluar efectos subcrónicos de concentraciones ambientales de tres insecticidas (principios activos y formulaciones comerciales) utilizados en nuestro país en un gasterópodo nativo de agua dulce, Biomphalaria straminea. Se analizaron distintos biomarcadores bioquímicos y reproductivos y la supervivencia de juveniles. El organofosforado metilazinfos inhibió la actividad decarboxilesterasas (CEs) e incrementó las actividades de glutatión S-transferasa(GST) y catalasa (CAT), la producción de especies reactivas del oxígeno (EROs) y la capacidad antioxidante total. El insecticida no afectó los parámetros de reproducción y del desarrollo evaluados (alteraciones histopatológicas en la gónada, número y diámetro de oocitos, distribución de tallas oocitarias, número de puestas, número de huevos por puesta, número de huevos con embrión por puesta, desarrollo de los embriones, tiempo y éxito de eclosión de los huevos), pero provocó una importante disminución en la supervivencia de la descendencia de B. straminea. El carbamato carbaril produjo menos efectos tóxicos a las mismas concentraciones molares que el metilazinfos. Incrementó la actividad de superóxido dismutasa (SOD) y, la formulación comercial, además, elevó los niveles de glutatión (GSH) e inhibió la actividad de CAT. El blanco de acción primario del metilazinfos y el carbaril, la enzima colinesterasa (ChE), no se vio alterado. El neonicotinoide acetamiprid incrementó la actividad de CEs y el contenido de GSH, inhibió la actividad de SOD y disminuyó las EROs. La formulación, además, aumentó la actividad de GST e inhibió la actividad de CAT. El carbaril y el acetamiprid no afectaron los parámetros del desarrollo analizados ni la supervivencia de los juveniles. Concluimos que la respuesta tóxica frente a estos insecticidas está relacionada principalmente con la detoxificación y el metabolismo oxidativo de B. straminea. Las formulaciones comerciales de carbaril y acetamiprid presentaron una toxicidad mayor que el principio activo. Nuestros resultados confirman la importancia de evaluar efectos subcrónicos de contaminantes a través de la medición de una batería de biomarcadores. Este estudio aporta información novedosa sobre efectos adversos producidos por insecticidas utilizados en nuestro país en el organismo nativo B. straminea.

Trabajo Final (Especialización en Producción de Cultivos Extensivos) -- UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2018

El impacto de los hidrocarburos (HC) de origen petrogénico en ecosistemas acuáticos puede afectar seriamente a la flora y fauna local. La fracción hidrosoluble del petróleo (WSF) es la responsable de los efectos tóxicos, sobre todo la fracción correspondiente a los HC aromáticos. Los organismos expuestos a concentraciones subletales de dichos compuestos pueden sufrir cambios fisiológicos, lo que resulta en un cambio neto de la energía disponible para el crecimiento y la reproducción. Es por ello que las medidas bioquímicas de respuestas biológicas subletales “biomarcador”, son particularmente valiosas para monitorear exposiciones a estos contaminantes. En este sentido, la franja costera sur del Río de La Plata es la región más contaminada del país por HC, debido a las actividades industriales y portuarias que operan en la zona, existiendo una marcada falta de información acerca de sus efectos en las especies de la comunidad. Para obtener información relevante, es preferible seleccionar organismos nativos; por tal motivo en este trabajo estudiamos los efectos toxicológicos del petróleo sobre un organismo acuático autóctono, el crustáceo decápodo Macrobrachium borellii. Se seleccionó este organismo debido a que es un representante de un nivel trófico elevado en la comunidad, a su proximidad taxonómica con otras especies de acuicultivo económicamente importantes, fácil de capturar y mantener en el laboratorio y principalmente, a que se disponía de información sobre su biología y bioquímica. El objetivo de este trabajo de tesis se focalizó en dos aspectos: por un lado, estudiar el efecto de la fracción hidrosoluble de HC del petróleo sobre diferentes parámetros biológicos, bioquímicos y biofísicos. Por otra parte, se pudo avanzar en el estudio del metabolismo de lípidos en muchos aspectos poco conocidos en los crustáceos en general, así como incursionar en su sistema de defensa antioxidante. Como generalmente los organismos acuáticos suelen presentar sensibilidad diferencial a los tóxicos de acuerdo al estadio del ciclo vital, los experimentos se realizaron en organismos adultos y embriones.

El impacto de los hidrocarburos (HC) de origen petrogénico en ecosistemas acuáticos puede afectar seriamente a la flora y fauna local. La fracción hidrosoluble del petróleo (WSF) es la responsable de los efectos tóxicos, sobre todo la fracción correspondiente a los HC aromáticos. Los organismos expuestos a concentraciones subletales de dichos compuestos pueden sufrir cambios fisiológicos, lo que resulta en un cambio neto de la energía disponible para el crecimiento y la reproducción. Es por ello que las medidas bioquímicas de respuestas biológicas subletales “biomarcador”, son particularmente valiosas para monitorear exposiciones a estos contaminantes. En este sentido, la franja costera sur del Río de La Plata es la región más contaminada del país por HC, debido a las actividades industriales y portuarias que operan en la zona, existiendo una marcada falta de información acerca de sus efectos en las especies de la comunidad. Para obtener información relevante, es preferible seleccionar organismos nativos; por tal motivo en este trabajo estudiamos los efectos toxicológicos del petróleo sobre un organismo acuático autóctono, el crustáceo decápodo Macrobrachium borellii. Se seleccionó este organismo debido a que es un representante de un nivel trófico elevado en la comunidad, a su proximidad taxonómica con otras especies de acuicultivo económicamente importantes, fácil de capturar y mantener en el laboratorio y principalmente, a que se disponía de información sobre su biología y bioquímica. El objetivo de este trabajo de tesis se focalizó en dos aspectos: por un lado, estudiar el efecto de la fracción hidrosoluble de HC del petróleo sobre diferentes parámetros biológicos, bioquímicos y biofísicos. Por otra parte, se pudo avanzar en el estudio del metabolismo de lípidos en muchos aspectos poco conocidos en los crustáceos en general, así como incursionar en su sistema de defensa antioxidante. Como generalmente los organismos acuáticos suelen presentar sensibilidad diferencial a los tóxicos de acuerdo al estadio del ciclo vital, los experimentos se realizaron en organismos adultos y embriones.

Entre agosto de 2000 y febrero de 2005 se estudiaron la organización de los ensambles de aves en fragmentos de caldenal en la Estancia La Primavera, ubicada en el centro este de la provincia de La Pampa. Los objetivos generales de este trabajo fueron: 1) analizar los cambios en los ensambles de aves producidos por la fragmentación del bosque y por la incorporación de una matriz agrícola; y 2) determinar los efectos de borde tanto en sus aspectos abióticos (mediante análisis de variables microambientales), como bióticos (a partir del análisis de los ensambles de aves y de un experimento con nidos artificiales). Para ello se trabajó en seis fragmentos de bosque maduro cuyas superficies fueron: 2.1; 10.4; 13.6; 26.3; 27.9; y 117.6 ha. En la primera parte del trabajo se describe el área de estudio y cuales fueron las posibles causas de la fragmentación del caldenal. En la segunda parte del trabajo se evaluó la riqueza específica y la abundancia de las aves, en función del tamaño de los fragmentos y de la estructura de la vegetación de los mismos. La estructura gremial de los ensambles cambió entre estaciones, debido a las especies migratorias estivales. Tanto la densidad como la riqueza fueron afectadas por el área. Por otro lado la estructura de la vegetación fue un factor importante en la distribución de las especies en los fragmentos. En la tercera parte se analizaron los diferentes efectos de borde, en primer lugar se analizaron los cambios físicos ocasionados por éste. En este caso las temperaturas del aire, del suelo, la humedad ambiente y de la broza, la radiación fotosintéticamente activa y la lluvia fueron las variables que cambiaron conforme la distancia la borde aumentaba. Posterior a los cambios microambientales, se estudiaron los cambios en los ensambles de aves en función del efecto de borde como así también de la estructura de la vegetación. No hubo evidencia de un efecto de borde, ya que no se encontró ninguna especie rechazadora ni explotadora de borde. Como la estructura de la vegetación fue similar, tanto en el borde y en el interior, esta pudo haber sido la causa de la falta de efecto de borde. Por último en el Capítulo 6 se realizó una evaluación del efecto de borde a partir de un experimento con nidos artificiales. En este caso hubo un efecto de borde significativo, aunque sólo para los nidos ubicados en el suelo, mientras que los colocados en los árboles tuvieron una predación cercana al 100%. Si bien existieron varias especies de potenciales predadores, sólo se pudieron registrar tres mamíferos y tres aves. Los resultados en su conjunto indican que las aves que habitan en el caldenal se verían más afectadas por las variables microambientales, la estructura de la vegetación y la predación de nidos. Sin embargo, los efectos biológicos indirectos causados por las variaciones microambientales, el parasitismo de cría (ausente este estudio), la predación sobre nidos naturales, constituyen evaluar con mayor profundidad.

Esta tesis estudió los efectos directos del fitoestrógeno genisteína en varios modelos de isquemia-reperfusión: de no-flujo/reperfusión (I/R) en corazones enteros de rata y cobayo, y de hipoperfusión/reperfusión (HIP/R) en corazones enteros de rata. En estos modelos se generó una recuperación contráctil parcial durante la reperfusión, sin infarto, denominado “corazón atontado”. La disfunción contráctil en estos modelos está acompañada por una elevada liberación de calor que conduce a la disminución de la economía muscular total. Los cambios energéticos reflejan alteraciones en la contractilidad, en la regulación de la [Ca2+]i, en los mecanismos activos de remoción y liberación de Ca2+ al citosol, y en la actividad metabólica mitocondrial. Aunque el fitoestrógeno genisteína es considerado protector cardiovascular, sus efectos directos en el miocardio atontado no estaban establecidos. Conocerlos es de importancia para evaluar una posible acción preventiva de este fitofármaco que se emplea en estados post-menopáusicos y como componente dietético principalmente aportado en la soja. La tesis estudió los efectos de perfundir 2 y 20 μM de genisteína previo a la I/R en corazones de rata o cobayo, puesto que ambos difieren en el grado de participación de mecanismos sarcoreticulares y sarcolemales. Además, puesto que la genisteína es considerado un fitoestrógeno, se evaluaron las diferencias de respuesta entre los dos sexos, tanto en I/R como en HIP/R. Se estudiaron los efectos desarrollados por la perfusión de genisteína directamente en los corazones aislados y contenidos en el interior de un calorímetro de flujo. En otras series experimentales, se estudiaron los efectos producidos después de la administración in vivo de 5 mg/Kg vía intraperitoneal un día antes del experimento de I/R en el corazón aislado. Experimentalmente, se midieron simultáneamente la presión intraventricular izquierda (LVP en mmHg) y el flujo de calor total (Ht en mW/g tejido) de corazones enteros de rata y cobayo introducidos en la cámara interna de un calorímetro de flujo, en forma continua tanto durante la perfusión control (6 ml/min) como en isquemia de no-flujo (por corte global de la perfusión) o en hipoperfusión (por reducir el flujo a 1,2 ml/min). En los modelos de “atontamiento”, los períodos de I/R o de HIP/R se eligieron para lograr una recuperación de alrededor del 50% de la contractilidad inicial en condición control. En corazones de rata se estudió también un modelo de “atontamiento severo” en el que el control recuperó alrededor del 15% de la contractilidad inicial. Los corazones estabilizados dentro del calorímetro se expusieron a diversos protocolos de pretratamiento con genisteína (GST) y/o ciertos inhibidores selectivos de transportadores para evaluar su rol en el efecto. Se hallaron los siguientes resultados principales en los diferentes modelos: a) En el modelo de atontamiento por I/R: en corazones aislados de rata expuestos a 20 min I/45 min R a 37 ºC, GST 20 μM no cambió la recuperación contráctil post-isquémica (RCPI), pero aumentó la velocidad de relajación relativa (-dP/dt/P) de las contracciones en R. Además, mejoró la economía muscular total (P/Ht) sólo cuando estuvo presente desde antes de la I al final de la R. La perfusión de menor concentración de GST 2 μM a 37°C (descripta en plasma de pacientes que consumen fitoestrógenos en la dieta) tampoco modificó la RCPI ni la economía, observando similar efecto que a 20 µM aún en la relajación. Sin embargo, a 30 ºC, en los corazones expuestos a 45 min I/45 min R, GST 20 µM redujo la RCPI tanto en corazones de ratas como de cobayos macho (M), sin modificar la RCPI de las hembras (H), con similares comportamientos de la economía. La inhibición de tirosina fosfatasas con orto-vanadato (OVN) durante la perfusión con 20 μM GST previno la disminución de la RCPI en corazones de rata M, sugiriendo que el efecto inotrópico negativo de GST es debido a la inhibición de tirosina-quinasas (TK). Reperfundiendo los corazones isquémicos con Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+ se indujo una contractura dependiente del contenido de Ca2+ sarcoreticular, y una liberación de calor que representa el ciclaje de Ca2+ a través de los varios transportadores involucrados. La relajación de la contractura depende principalmente de la recaptación mitocondrial de Ca2+ en estas condiciones, y GST redujo esa velocidad de relajación a 30⁰C. En corazones de cobayo, GST 20 μM mantuvo la protección del precondicionamiento (PC) isquémico previo a los 30 min I/45 min R, pero ambos efectos fueron reducidos (cayó la RCPI) por el bloqueante selectivo de los canales de K+ mitocondriales (KATPm) 5-hidroxidecanoato, sugiriendo la participación de los KATPm en el efecto de GST y del PC. b) En cardiomiocitos aislados de rata y perfundidos en medio aeróbico, GST 20 μM previno el aumento en la fluorescencia de Rhod-2 ([Ca2+]m libre) y demoró la caída de la señal fluorescente de Fluo-4 ([Ca2+]i libre citosólico) ambos provocados por la perfusión de un Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+. c) Efectos de GST en el modelo de atontamiento con estimulación simpática: se encontró que 20 μM GST redujo la disfunción provocada por adrenalina en el modelo de atontamiento por I/R, mejorando la RCPI y la economía (P/Ht). Esta interacción sugirió que GST redujo la sobrecarga de Ca2+ inducida por adrenalina. d) En el modelo de atontamiento severo por I/R: en corazones aislados de rata a 37 ºC, GST 5 mg/Kg administrada vía intraperitoneal 24 horas antes del experimento mejoró la RCPI de corazones expuestos a 30 min I seguido de 45 min R, especialmente en corazones de rata macho. Este efecto no estuvo asociado a la inhibición de las tirosina-kinasas (no se modificaron por tratamiento previo con OVN), ni a cambios en el contenido de Ca2+ del RS (no alteró la contractura provocada por Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+). e) En el modelo de hipoperfusión/reperfusión (HIP/R): inicialmente se caracterizó el rol de los transportadores de Ca2+ mitocondriales en este modelo. Se logró mejorar la RCPI y la economía durante la hipoperfusión cuando se pretrataron con clonazepam 10 μM, el cual inhibe al NXCm, sugiriendo el rol cardioprotector de conservar más Ca2+ en las mitocondrias durante la hipoperfusión. Otros transportadores mitocondriales (UCam y KATPm) no ejercieron un rol cardioprotector en la HIP/R. Luego, 20 μM GST generó el mismo patrón de comportamiento que en el atontamiento por I/R a 37°C, es decir que M y H no alteraron la RCPI ni la economía. Pero al combinar la perfusión de GST luego y en simultáneo con la de clonazepam se observó una disfunción muy acentuada: reducción de RCPI y economía, y gran contractura. Esta disfunción fue atenuada por la simultánea perfusión de ciclosporina A, lo cual sugiere que hay una gran alteración en la homeostasis de Ca2+ con apertura del mPTP al interferirse los transportadores mitocondriales UCam y NXCm. Por otro lado, cuando el modelo de HIP/R se realizó 24 horas después de la administración IP de 5 mg/Kg de GST en corazones de rata macho, se obtuvo cardioprotección con aumentos de la RCPI y la economía (P/Ht). Estos resultados sugieren que GST actúa en varios mecanismos que regulan la homeostasis de calcio miocárdica y la energética durante la I/R, los cuales difieren con la temperatura y el género. Entre ellos, hemos caracterizado a los siguientes: a) Una inhibición del influjo de Ca2+ por canales L, más notoria en machos que en hembras y a baja temperatura (30 ºC), que es dependiente de la inhibición de TK. b) un aumento de la velocidad de relajación de las contracciones, posiblemente por aumentar la captación sarcoreticular de Ca2+, el cual fue evidente tanto a 30ºC como a 37ºC pero fue enmascarado por la acción lusitrópica propia de la adrenalina. d) un aumento del leak de Ca2+ del RS dependiente de la temperatura, ya que fue evidenciado por el aumento de la LVEDP durante la R en los corazones tratados con GST a 37 ºC, aun en las condiciones de cardioprotección. e) una disminución de la captación de Ca2+ mitocondrial, evidenciado en cardiomiocitos aislados y en corazones en I/R a 30 ºC, cuando se perfundieron con Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+. e) una acción cardioprotectora cuando se administró in vivo, que podría estar asociada a la interacción agonista competitiva con el estradiol endógeno a nivel de los receptores estrogénicos, puesto que la RCPI y la economía mejoraron mucho mas en el tratamiento in vivo de rata macho que en el de rata hembra. La dosis de 5 mg/Kg evaluada en esta tesis es comparable a la administrada en humanos terapéuticamente (70 mg/día de isoflavonas de soja). En conclusión, esta tesis valida el efecto benéfico de la administración in vivo de GST en un individuo, especialmente si tiene reducido nivel estrogénico, como preventivo del atontamiento miocárdico disparado por la reducción del flujo coronario. Además, establece algunos de los mecanismos determinantes de tal protección a nivel de la homeostasis de Ca2+ y la energética miocárdica.