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Tesis de Doctorado

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Agropecuarias, de la Universidad Nacional de Córdoba, en 2013

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Agropecuarias, de la Universidad Nacional de Córdoba, en 2013

Un problema fundamental en la biología de desarrollo es entender los mecanismos que contribuyen a generar la extensa diversidad celular en el sistema nervioso. En los últimos años, se ha profundizado en el conocimiento de cómo grupos de neuronas se generan a partir de progenitores organizados especialmente en el tubo neural embironario. Sin embargo, pocos trabajos han indagado acerca del origen de la diversidad astrocítica. El objetivo de esta tesis es definir la identidad de las células originadas tardíamente de un dominio restringido de progenitores ventriculares, y establecer si los mecanismos que sirvieron en la especificación neuronal contribuyen al desarrollo glial. Mediante experimentos de marcación genética se encontró que los progenitores p0 de la médula espinal del ratón producen un subgrupo de astrocitos, además de las interneuronas premotoras V0. Los astrocitos ventrales derivados del dominio p0, denominados Av0, se localizan exclusivamente en la región intermedia de la médula espinal postnatal. Su diferenciación se inicia en el estadio embrionario E14.5, incrementándose en número mientras migran lateralmente hacia la sustancia blanca. La población Av0 postnatal está constituida por células con características morfológicas distintivas: astrocitos fibrosos (mayoritariamente en la materia blanca), protoplasmáticos (ubicados en la sustancia gris) y una proporción menor que conserva una morfología radial contactando la pía. La especificación de los astrocitos Av0 es regulada por el factor de transcripción Dbx1, que se expresa en progenitores p0. En ratones Dbx1 mutantes se encontró un aumento de Av0 a expensas de las interneuronas V0. La manipulación de la vía de señalización por Notch, en conjunto con la alteración de sus ligandos en la médula espinal de embriones Dbx1-/-, sugieren que Dbx1 controla el balance neurogénesis-glicogénesis modulando la interacción celular dependiente de Notch en progenitores p0. En resumen, este trabajo demuestra que dominios restringidos de progenitores en eje dorso-ventral producen subgrupos de células astrocíticas que se asientan en macrodominios definidos del sistema nervioso maduro.

El propósito de este trabajo es mostrar y proponer un camino posible para la transformación de una aplicación Web tradicional a RIA, haciendo uso de técnicas y herramientas para especificar el viejo y nuevo estado de la misma, dando una completa visión de los cambios arquitecturales y adaptaciones en las aplicaciones desarrolladas, con y sin patrones de diseño.

El uso de diferentes métodos y herramientas que asistan en la organización y el control de procesos, ha tomado relevancia debido a la necesidad constante de eficiencia por parte de la industria y a la adecuación de sus prácticas a las emergentes y novedosas técnicas de desarrollo y producción. Como producto de estas necesidades, diversos lenguajes para la descripción de procesos de negocios capturaron el interés tanto del sector productivo, para su aplicación en sus actividades, como así también del sector académico, con el fin de aportar conocimiento y generar nuevas herramientas para tal fin. Si bien la mayor parte de los lenguajes para la especificación de procesos de negocios son informales, existen algunos fundados en formalismos matemáticos. Esto brinda a estos lenguajes formales para procesos de negocios la eliminación de ambigüedades en la interpretación de especificaciones, y la posibilidad de realizar diferentes análisis formales, como chequeos de sanidad. Sin embargo, las alternativas existentes poseen en general limitaciones, o bien en poder expresivo, o, para las alternativas más expresivas, la imposibilidad de realizar algunas tareas de análisis automáticamente. En este trabajo presentamos un enfoque formal para la especificación y el análisis de procesos de negocios, que permite dar semántica a construcciones complejas de procesos de negocios, a la vez que admite el análisis de chequeos de sanidad usuales de manera automática mediante model checking. Más aún, nuestra propuesta abarca la posibilidad de que el usuario especifique y analice propiedades de interés acerca de las especificaciones, mediante lógicas temporales, un mecanismo con frecuencia ausente en los lenguajes existentes. Además del desarrollo de una semántica formal para un lenguaje de proceso de negocios sumamente expresivo, nuestro trabajo toma como base para la especificación de propiedades de procesos de negocios el uso de lógicas temporales. Identificamos algunos elementos que hacen particularmente complicada la expresión de algunos tipos de propiedades, en particular cuando las mismas demandan expresar repeticiones de eventos o tareas, y proponemos una lógica temporal que permite describir tales propiedades con mayor facilidad. Con el fin de no perder capacidad de análisis, desarrollamos traducciones que nos permiten capturar los elementos novedosos de esta lógica en términos de otros elementos, soportados por lógicas temporales tradicionales, con soporte de herramientas. Por otra parte, observamos la tendencia de los lenguajes de descripción de procesos de negocios a no tratar formalmente la descripción de los productos que manipulan. Tomamos un formalismo excepcional en este sentido, PPML, y definimos a partir del mismo un lenguaje de especificaciones, una semántica simplificada para el mismo, y una técnica de análisis de especificaciones basada en una caracterización de sus modelos en UPPAAL. Nuestro enfoque está claramente orientado a la producción de herramientas de soporte al proceso de especificación. Para los lenguajes tratados brindamos herramientas de especificación y análisis de procesos de negocios, como así también la posibilidad de construir descripciones de procesos de negocios a partir de las propiedades que los mismos deben cumplir. Estas tareas son evaluadas en este trabajo a través del desarrollo de casos de estudio tomados de la literatura del área, en lo que respecta a descripción de procesos y chequeos de sanidad de los mismos, y en base a variantes de estos casos en las cuales se enfatiza la necesidad de contar con propiedades descriptas por el usuario, y de dar más relevancia a la descripción de los productos manipulados por los procesos de negocios.

La tarea de desarrollar software paralelo que sea eficiente, lógicamente correcto y económico desde un punto de vista de costo-beneficio es compleja. Diversos problemas potenciales pueden causar comportamientos incorrectos y performance pobre. El diseño de software basado en patrones puede ayudar a cubrir los requisitos de correctitud y de escalabilidad. Sin embargo, éste tiene diversos problemas: (a) muchos de los patrones no están disponibles en los modelos y lenguajes actuales de programación paralela; (b) frecuentemente es difícil implementar y utilizar el patrón más apropiado para el problema a resolver; y (c) muchos patrones no proveen fácilmente la capacidad de componerse entre sí, dificultando el soporte para procesamiento paralelo sobre arquitecturas heterogéneas. Con el objetivo de ayudar a solventar estas deficiencias, las contribuciones de esta tesis son tres. Primero, se presenta un nuevo patrón genérico de procesamiento paralelo llamado PCR [43], que consiste en una combinación de elementos productores, consumidores y reductores que operan de manera concurrente sobre un conjunto de datos de entrada. Se provee una definición matemática de la semántica de dicho patrón en términos del formalismo FXML. Se muestra además que los PCRs pueden componerse y comprenden otros patrones de programación paralela conocidos, proveyendo así un entorno compatible con diseños heterogéneos. Segundo, se muestra formalmente que el patrón PCR puede ser implementado de manera correcta en términos de un modelo de concurrencia más concreto a modo de implementación. Tercero, se provee una librería multiplataforma de plantillas C++ que permite expresar instancias concretas del patrón PCR. Se presenta un prototipo de compilador basado en reescritura de plantillas que genera de manera automática implementaciones paralelas y distribuídas de PCRs basándose en la librería de concurrencia Intel Concurrent Collections. El entorno de programación y generación de código se ilustra con diversos casos de estudio. En resumen, el entorno propuesto provee medios para mejorar la calidad y productividad del desarrollo de software paralelo mediante una metodología basada en construcciones de programación de alto nivel e independientes de la plataforma y una infraestructura de compilación para generar código ejecutable portable.

La Proteína Quinasa dependiente de cAMP (PKA) participa en una amplia variedad de procesos fisiológicos. En Saccharomyces cerevisiae un único gen codifica para la subunidad regulatoria (BCY1) y tres genes para las subunidades catalíticas (TPK1, TPK2 y TPK3). El desarrollo de esta tesis permitió comprender parte del mecanismo por el cual la vía de transducción de señales cAMP-PKA logra especificidad espacio-temporal en respuesta a variaciones en el medio ambiente. Particularmente, nos propusimos establecer si las tres isoformas de PKA son reguladas diferencialmente por fosforilación y localización subcelular en respuesta a diferentes condiciones nutricionales y de estrés. Hemos determinado que Tpk2 y Tpk3, pero no Tpk1, se localizan en gránulos de procesamiento de mRNA en respuesta al arresto traduccional evocado por estrés nutricional y fase estacionaria. Estos resultados sugieren que la vía de PKA conecta el estado nutricional de la célula con la regulación de la traducción de proteínas. Además hemos identificado a Pkh1 como una quinasa común a Tpk1, Tpk2 y Tpk3 cuya fosforilación diferencial regula la interacción con la subunidad regulatoria y la localización subcelular. Los resultados obtenidos en esta tesis contribuyen a ampliar el conocimiento sobre la especificidad temporal y espacial de la vía de transducción de señales.

Durante este trabajo se estudio la regulación tejido especifica de dos genes mediante la utilización de ratones transgénicos. l) Se estudio con que eficacia un fragmento de 3,8 kb del promotor bovino de β-caseina puede dirigir una expresión tejido especifica a la glándula mamaria. El patrón de expresión espacial, temporal y hormonal del gen de fusión, resultó altamente regulado y confinado estrictamente a celulas epiteliales de la glándula mamaria lactante. En estudios previos realizados sobre una línea celualar de glándula mamaria de ratón, se había demostrado que con 1,7 kb del promotor bovino de β-caseína era posible obtener expresión celular específica, a su vez regulada hormonalmente. Esta misma construcción no funcionó al intentar dirigir la expresión específica a glándula mamaria de ratones transgénicos. En este trabajo utilizamos un promotor de mayor tamaño del mismo gen, 3.8 kb, para direccionar la expresión del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) a glándula mamaria de ratones transgénicos. Por medio de un ensayo de Northern blot se determinó la presencia de ARNm de hGH únicamente en glándula mamaria de hembras en período de lactancia. Este ARNm no se detectó en glándula mamaria de hembras vírgenes. Un análisis durante el desarrollo de la glándula mamaria demostró que el transgén sigue un patrón de expresión que se asemeja mucho más al bovino que al murino. En estudios de hibridización in situ, realizados sobre secciones de glándula mamaria, se observó que el patrón de expresión del transgén resultó homogeneo en todos los lóbulos, tanto en animales heterocigotas como homocigotas. La cantidad de granos de plata contados sobre tejido mamario se correlacionó áltamente con el contenido de hGH en leche, previamente determinado por radioinmunoensayo (r=0 996). Por lo tanto, las 3,8 kb del promotor bovino de β-caseína pueden direccionar altos niveles de expresión de proteínas terapéuticas a la glándula mamaria de ratones transgénicos con especificidad celular y regulación correcta durante el desarrollo. 2) Se evaluó la expresión celular especifica del gen de Pro-Opiomelanocortin (POMC) en neuronas. El gen de POMC se expresa en una serie de neuronas del hipotálamo y tracto solitario, y en corticotrofos y melanotrofos hipofisarios. En estudios previos se determinó que una porción proximal del promotor de POMC de rata o ratón era suficiente para dirigir expresión celula-específica, regulada hormonalmente y en forma correcta durante el desarrollo, a melenotrofos y corticotrofos, pero no a neuronas. Más recientemente se identificó la presencia de posibles activadores de la transcripción dentro de una zona de 11 kb en la región 5’flanqueante del gen de POMC (entre —13kb y —2kb). En el presente trabajo, por medio de un análisis delecional se ubicó el elemento neuronal específico a una resolución de 4 kb. Se generaron 3 construcciones conteniendo secuencias genómicas de POMC (6 kb de la unidad transcripcional y 2 kb de la región 3’flanqueante) con diferentes longitudes de la región 5’flanqueante, 13 kb (-13/+8POMC-EGFP), 9 kb (—9/+8POMC-EGFP) y 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). A estas secuencias se les introdujo en el exón 2, previo al sitio ATG, una versión mamiferizada de la proteína verde fluorescente de medusa (EGFP). Esta innovación permitió visualizar la expresión transgénica en el cerebro e hipófisis en forma inmediata luego de realizar los cortes de los tejidos. En tres de un total de cuatro lineas de animales transgénicos generados para las construcciones -5/+8POMC-EGFP y -9/+8POMC-EGFP se observó fluorescencia en corticotropos y melanotropos. Estos transgenes se expresaron en neuronas. Contrariamente, la construccion -13/+8POMC-EGFP se expresó correctamente en hipófisis y neuronas de POMC Este resultado nos sugiere que la presencia del elemento neuronal específico buscado se encuentra entre —9 y —l3kb del inicio de la transcripción. En experimentos futuros, nuestro objetivo será clonar e identificar el factor de transcripción neuronal que interactúa con los elementos en cis. Nosotros proponemos inmortalizar un linea celular neuronal que exprese POMC mediante oncogénesis dirigida en ratones transgénicos. Hemos generado 4 lienas de ratones transgénicos con una construcción similar a —l3/+8POMC-EGFP, pero conteniendo una versión termo-sensible del antígeno T largo (AgT-tsA58) insertada en el segundo exón del gen de POMC de ratón. En estas 4 líneas se desarrollaron tumores prematuramente en la región hipofisaria-lúpotalámica, a pesar de que la temperatura corporal del ratón es no permisiva. Tres de estos ratones murieron antes de reporoducirse. Sólo una líena pudo ser mantenida con un programa de aparcamientos utilizando machos jóvenes. En estudio realizado con un Northern blot se observó una expresión considerable de POMC en esos tumores. En próximos experimentos evaluaremos la prsencia de marcadores neuronales e hipofisafios para determinar la naturaleza de dichos tumores.

El desarrollo de este trabajo se enmarca dentro de la temática general del duelo, y más específicamente del duelo por la pérdida de una figura significativa en la infancia, preguntándose por las características particulares que pueden presentarse en las modalidades de sostén adulto para con el proceso duelante del niño, dentro de un medio cultural específico.