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Título de Acceso Abierto

Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal Fc-5.01, reactivo con cáncer de mama, melanoma y otros tumores humanos

María Marcela Barrio José Mordoh

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Con el objeto de producir anticuerpos monoclonales (AMCs) dirigidos contra antígenos (Ags) expresados por células tumorales indiferenciadas, los cuales podrían ser comunes a varias neoplasias, se utilizaron las células IIB-BR-G como inmunógeno. Esta línea celular de carcinoma mamario presenta características sumamente indiferenciadas y fue derivada de un tumor primario de mama altamente indiferenciado, que no expresa receptores hormonales. Se seleccionó un AMC denominado FC-5.01 (lgG2a), el cual reconoce distintos carcinomas humanos y el 100% de los melanomas malignos. Su reactividad con la mayoría de los tejidos normales es escasa, ya que FC-5.01 reconoce algunas células del sistema neuroendócrino, macrófagos y algunos túbulos contorneados proximales en el riñón, mayormente con un patrón intracelular. A nivel bioquímico, el Ag reconocido por FC-5.01 es una glicoproteína heterogénea (banda ancha con un peso molecular de 30-60 kDa) en melanomas y carcinomas humanos. El epitope reside en el núcleo protéico (25kD) y es presumiblemente conformacional, con puentes disulfuro implicados en el reconocimiento del AMC. En esta Tesis se demuestra que FC-5.01 reacciona con el Ag CD63, inicialmente descripto como un Ag asociado a melanoma, y miembro de la superfamilia Tetraspan o Tetraspaninas. La reactividad de FC-5.01 con CD63 se demostró por Western blot, con ensayos de inmunodepleción con otro anticuerpo anti-CD63 y por análisis de FACS (fluorescence activated cell sorting) de la línea celular de melanoma KM3 (CDGB-negativa) luego de la transfección con la copia genómica de CD63. El epitope reconocido por el AMC FC-5.01 es diferente del reconocido por otro AMC anti-CD63 (ME491), como se demostró por un radioimmunoensayo de inhibición cruzada. Opuestamente a lo propuesto para el AMC ME491, no se observaron diferencias significativas en Ia expresión de CD63 entre melanomas primarios y metastásicos usando AMC FC-5.01, por medio de inmunohistoquímica. Por inmunofluorescencia indirecta realizada a 4°C con células vivas, se determinó que el Ag reconocido por FC-5.01 está presente en las membranas plasmáticas de células IIB-BR-G y otras células neoplásicas. En células permeabilizadas, FC-5.01 co-localiza con el colorante naranja de acridina en vesículas acídicas (compartimiento lisosomal/endosomal). Por análisis de Scatchard realizado con células IB-BR-G, se calculó una constante de afinidad de 1.4 ± 0.4 x 10^7 M^-1 y 2.1 x 10^6 sitios antigénicos por célula. El AMC FC-5.01 no media reacciones citotóxicas contra células CD63+ (fijación de complemento ni ADCC= antibody dependent cellular cytotoxicity), pero el complejo FC-5.01-CD63 es eficientemente internalizado hacia vesículas intracitoplasmáticas, como se observó en un ensayo de inmunofluorescencia posterior a la incubación a 37°C. El catabolismo celular del AMC unido por las células IIB-BR-G se estudió usando [125I]-FC-5.01. Luego de 18 hs a 37°C, >70% de la radioactividad se encontró en el sobrenadante del cultivo como fragmentos degradados (TCA-solubles). En células IIB-BR-G se demostró rápida re-expresión del Ag luego de la internalización. El AMC FC-5.01 disminuyó la migración de células CD63+ en un ensayo de cámara de Boyden. Estas propiedades permitirían el uso del AMC FC-5.01 como un vehículo para dirigir diferentes compuestos dentro de células CD63+. Luego de haber logrado la radioinmunolocalización de xenotransplantes de carcinoma mamario humano creciendo en ratones nude (IIB-BR-GNUDE ) con [125I]-FC- 5.01, se formuló un kit de marcación en un paso, para obtener [99mTc]-FC-5.01, con posible utilidad en diagnóstico por imágenes. Este kit se preparó por reducción del AMC con 2-mercaptoetanol y la adición de difosfonato de metileno (MDP) como ligando transquelante. Luego de la marcación con [99mTc] eluído de generador, las especies marcadas se analizaron por ITLC (instant thin layer chromatography) y HPLC (high performance liquid chromatography). La eficiencia de marcación fue superior al 90% y la conservación de la inmunoreactividad se verificó con células IIB-BR-G. En el modelo IIB-BR-GNUDE se realizaron biodistribuciones e imágenes en cámara gamma con [99mTc]-FC-5.01. A las 24 hs la radioactividad se incrementó en los tumores (14.4 ± 5.3 % de la dosis inyectada/ gr tumor) y disminuyó en la sangre y los principales órganos, y los tumores se radioinmunodetectaron perfectamente en la cámara gamma. Los controles de calidad demostraron que el kit resulta estable por un período de hasta 120 días. Alícuotas de este mismo kit se inyectaron a dos pacientes con melanoma maligno (0.5 mCi/paciente), y en uno de ellos fue posible localizar, a las 24 hs, una metástasis en un gánglio linfático axilar, que ya había sido detectada por medio de tomografía computada. Este kit preparado para radioinmunodetección (RID) in vivo podría ser utilizado en el futuro con fines diagnósticos en pacientes con melanoma u otros tumores CD63+. Dados estos resultados, se utilizó el mismo modelo in vivo para experimentos de radioinmunoterapia (RIT). Se investigó la capacidad de [131I]-FC-5.01 para controlar el crecimiento de los tumores IIB-BR-GNUDE. En un primer experimento de RIT se observó una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0.05) en animales portadores de tumor, tratados con [131I]-FC-5.01(900 μCi) fraccionados en tres dosis semanales, respecto de los animales control. Se observó cierto grado de toxicidad hematológica (pérdida de peso corporal, hipoplasia de la médula ósea, bajos recuentos de leucocitos totales). No se observaron regresiones o curas. También se observó incremento de la probabilidad de supervivencia debida al tratamiento con [131I]-FC-5.01 en uno de los experimentos. El nivel de toxicidad fue disminuído reduciendo la dosis de [131I]-FC-5.01 y por administración de G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) como complemento de la RIT.
Palabras clave – provistas por el repositorio digital

ANTICUERPO MONOCLONAL FC-5.01; AG CD63; INTERNALIZACION RADIOINMUNODETECCION; RADIOINMUNOTERAPIA; mAB FC-5.01; CD63 AG; RADIOINMUNODETECTION; RADIOINMUNOTHERAPY INTERNATION

Disponibilidad
Institución detectada Año de publicación Navegá Descargá Solicitá
No requiere 1998 Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) acceso abierto

Información

Tipo de recurso:

tesis

Idiomas de la publicación

  • español castellano

País de edición

Argentina

Fecha de publicación

Información sobre licencias CC

https://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar/