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Título de Acceso Abierto
La estabilidad térmica de la bomba de calcio de membrana plasmática
Valeria Levi Juan Pablo F.C. Rossi
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El estudio estructural y funcional de las proteínas de membrana se ve dificultado por la gran complejidad de los sistemas en las cuales éstas se hallan insertas, y porque, en general, estas proteínas se inactivan espontáneamente. La estructura tridimensional de una proteína está determinada por la interacción entre los grupos que componen la cadena polipeptídica, y entre estos grupos y el medio en el cual se halla inserta. Estas fuerzas intra e intermoleculares también definen su estabilidad. Además, para que una proteína cumpla su función biológica, se requiere que conserve su estructura nativa. Estas observaciones muestran una estrecha relación entre la estructura, la estabilidad y la función de las proteínas, y sugieren que se pueden evaluar características estructurales y funcionales de las mismas a partir del estudio de su estabilidad. Este enfoque fue empleado en el estudio de la bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA), una proteína integral de membrana, de Mr 134000, responsable del transporte de Ca2+ hacia el exterior de células eucariotas. La energía requerida para esta función proviene directamente de la hidrólisis del ATP. En una primera etapa, determinamos que la pérdida espontánea de la actividad Ca2+-ATPasa de la bomba de calcio purificada y reconstituida en micelas de fosfolípidos y detergente, sería consecuencia de la desnaturalización de la proteína. La inactivación siguió una cinética de pseudo-primer orden, que estaria asociada a una transición entre dos estados y ocurriría a través de un único mecanismo en el intervalo 33-45 °C. Dado que el proceso es irreversible, el coeficiente cinético de la inactivación es inversamente proporcional a la estabilidad de la enzima. Una vez caracterizado este proceso, estudiamos los cambios en la disposición estructural de la enzima durante la desnaturalización térmica. Para ello empleamos un análisis combinado que incluyó el análisis de la fluorescencia de un conjunto de sondas específicas y ensayos de actividad enzimática. Establecimos que el dominio de unión a calmodulina se desnaturaliza antes que el dominio catalítico, en tanto que el dominio transmembránico permanece plegado durante la desnaturalización térmica. Como la función vinculada a los distintos dominios es afectada por ligandos específicos de la enzima, exploramos el efecto de éstos en la estabilidad. Determinamos que Ca2+, calmodulina y un análogo no hidrolizable del ATP estabilizan al dominio catalítico. Exploramos además el efecto de un ligando cuya relevancia sobre la estructura y función de la bomba no ha sido determinada, i.e., la propia bomba de calcio. La dimerización fue caracterizada empleando la transferencia de energía entre la bomba de calcio marcada con la sonda fluorescente FITC y la marcada con EITC. El mecanismo molecular de la dimerización fue estudiado determinando la eficiencia de la transferencia de energía entre FITC-PMCA y EITC-PMCA luego de desplegar distintas regiones de la enzima. Estos ensayos permitieron definir que la dimerización involucra la interacción entre el dominio de unión a calmodulina y dos segmentos de la bomba a las cuales se une el péptido C28W cuya secuencia se encuentra incluida en la del mencionado dominio. La relevancia biológica del proceso de dimerización fue estudiada determinando la dependencia de la estabilidad de la bomba de calcio con su concentración. El análisis teórico de los resultados obtenidos permitió determinar que la estabilidad de la bomba de calcio dimérica es 200 veces mayor que la monomérica. La estructura y función de las proteínas de membrana se encuentran íntimamente relacionadas con los sistemas micelares en el cual se hallan insertas. Por este motivo, exploramos la dependencia de la estabilidad de la bomba purificada con la composición de las micelas. Basándose en los resultados obtenidos en tres sistemas micelares diferentes, postulamos un modelo que propone que la estabilidad de la enzima aumenta a medida que la monocapa de anfifilos que recubre la superficie hidrofóbica del dominio transmembránico se enriquece en fosfolípidos. La composición de la monocapa está relacionada con la afinidad de los fosfolípidos respecto a la del detergente por esta superficie (KLD). Desarrollamos un método que permite determinar KLD utilizando transferencia de energía entre los residuos triptofano de la PMCA y un fosfolípido marcado con pireno. Los valores de KLD obtenidos por este procedimiento son consistentes con los determinados a partir del modelo. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis sugieren que el estudio de la estabilidad de proteínas podría constituir una metodología general de gran utilidad para explorar aspectos estructurales y funcionales de una amplia gama de proteínas.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
PROTEINA DE MEMBRANA; ESTABILIDAD ESTRUCTURAL; BOMBA DE CALCIO; ATPASA; DESNATURALIZACION TERMICA; MEMBRANE PROTEIN; STRUCTURAL STABILITY; CALCIUM PUMP; ATPase; THERMAL DENATURATION
Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 2001 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
2001
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