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Naturaleza de las relaciones antígenicas entre Arenavirus del viejo y del nuevo mundo
Elba Laura Weber Michael J. Buchmeier Mercedes C. Weissenbacher
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
En nuestro laboratorio se obtuvieron anticuerpos monoclonales (AcMs) contra la glicoproteína GP-2 del virus de la coriomeningitis linfocitaria, LCM, prototipo de la familia Arenaviridae. Los AcMs 33.6 y 83.6, no neutralizantes, reaccionaron con todos los miembros de la familia en reacciones de inmunofluorescencia, inmunoprecipitación y ELISA. Un tercer ACM, 9-7.9, reaccionó con el arenavirus africano Mopeia, no patógeno, que es indistinguible por métodos serológicos del patógeno Lassa, pero no dio reacción con este último. El análisis topográfico realizado "a posteriori" en el laboratorio demostró que 33.8 y 83.6 definen un único antígeno, conservado en todos los arenavirus, que se donominá GP-2A, y que el epitope definido por 9-7.9, denominado GP-2B, se superpone parcialmente con el anterior. Los arenavirus se clasifican en dos subgrupos: arenavirus del Viejo Mundo y del Nuevo Mundo, según su distribucion geográfica y las relaciones antigénicas que existen entre ellos. GP-2A es el primer antígeno conservado en la glicoproteína de ambos subgrupos que se describe. Los dos epitopes son importantes ya sea desde el punto de vista de la evolución de esta familia viral como desde un punto de vista práctico: Como en la familia se encuentran patógenos humanos (Junin y Machupo, agentes de la Fiebre Hemorragíca Argentina y Boliviana respectivamente, además de los mencionados LCM y Lassa), un epitope conservado como el GP-2A puede eventualmente servir como herramienta para el diagnóstico de infecciones con estos virus; GP-2B tiene la propiedad de diferenciar a un arenavirus patógeno de otro que no lo es, lo que lo hace un probable marcador de atenuación para los arenavirus africanos. Ei objetivo de este trabajo fue definir, a nivel de secuencia de aminoácidos, ambos epitopes sobre GP-2. Con este fin se trabajó con péptidos sintéticos, producidos sobre la base de la secuencia de aminoácidos predicha para la porción correspondiente a GP-2 de GPC, el glicopéptido intracelular de 498 residuos precursor de las glicoproteínas estructurales GP-1 y GP-2 de LCM. Se determinó la reactividad en ELISA de los AcMs con 18 péptidos correspondientes a la mencionada secuencia, y se encontró que sólo uno, que abarcaba los residuos 370-382 de GPC, reaccionaba con los tres AcMs. La secuencia dc 370-382 es 37°CNY SKFWYLEHAK^382; aminoácidos subrayados estan conservados en los arenavirus LCM, Lassa, Pichindé y Tacaribe, unicos cuya secuencia se conoce. Posteriormente se trabajó también con la secuencia 368-382, debido a que los residuos 368PY369, también están conservados. Los AcMs reaccionaron específicamente con la secuencia 370-382 en ELISA y en solución, no habiendo reacción con las secuencias adyacentes 353-370 y 378-391. La reactividad en solución se determinó midiendo la capacidad de la secuencia de bloquear la unión a la glicoproteína de LCM (arenavirus del Viejo Mundo) en reacciones de inmunofluorescencia, ELISA de viriones intactos y "Western blot". En todos los casos hubo bloqueo total de la unión de los AcMs a GP-2 cuando los mismos habían sido preincubados con 370-382, mientras 353-370 y 378-391no tuvieron efecto bloqueante. La secuencia 370-382 también bloqueo la unión de 33.6 a la glicoproteína de los virus Junín y Tacaribe, del Nuevo Mundo, confirmando 1a presencia del epitope GP-2A en este subgrupo. Con el objeto de determinar cuáles son los límites de los epitopes GP-2A y GP-2B en la secuencia 368-382 se determinó la reactividad en ELISA y en solucion de los AcMs con los siguientes péptidos: 368PYCNYSKFWYLEHAK382 370CNYSKFWYLEHAK382 372YSKFWYLEHAK382 374KFWYLEHAK382 376WYLEHAK382 368PYCNYSKFWYL378 370CNYSKFWYL378 372YSKFWYL378 Todas las secuencias excepto 374-382 y 378-382 reaccionaron con 33.6 y 9-7.9 en ELISA y en solución. 374-382 reaccionó con 33.6, pero el grado de reacción con 9-7.9 (medido segun el título en ELISA y según la capacidad de bloquear la unión del AcM a la glicoproteína) fue menor. 376-382 no reaccionó con ninguno de los AcMs. Es decir que todos los péptidos con la secuencia 372-378 completa contienen residuos pertenecientes tanto a GP-2A como a GP-2B. Los aminoácidos EHAK no parecen influir directamente sobre ninguno de los epitopes, cuyo grado de superposición cs muy alto, ya que sus limites no pudieron definirse. Con el objeto de analizar las bases moleculares de la falta de reactividad dc 9-7.9 con Lassa y Pichindé se trabajó con los péptidos (a) CNYTKFWYLEHAK y (b) CNYSKYWYLEHAK, donde los residuos subrayados corresponden a sustituciones naturales que aparecen en Pichindé y Lassa, respectivamente, en la zona conservada de la secuencia. El péptido (a) se comportd igual que 370-382, es decir que el reemplazo Ser por Thr no tuvo efecto sobre la reactividad; el péptido (b), en cambio, reaccionó con 33.6 pero no lo hizo con 9-7.9, lo que sugiere que el reemplazo de Phe por Tyr, que ocurre naturalmente en Lassa, sería suficiente para destruir el epitope en este virus. Como la sustitución correspondiente a Pichindé en la zona de superposición de GP-2A y GP-2B no afectó la reactividad de 9-7.9, se determinó el grado de reacción de este AcM con secuencias que involucraban residuos ubicados fuera de la zona conservada 368-378, ya que podria ocurrir que el epitope fuera discontinuo. Las secuencias probadas fueron: Píchindé: 1) AKICNYTKFWYINDTI 2) CNYTKFWYINDTI LCM: 3) MGVCNYSKFWYLEHAK 4) CNYSKFWYLEHAK(370—382) Los titulos de 9-7.9 en ELISA fueron menores con las secuencias de Pichindé. pero en solución sólo hubo una pequeña diferencia con la secuencia 1), sugiriendo que los residuos 365AKI367 influyen en GP-2B. En todos los casos se hicieron simultáneamente los ensayos con 33.6, y no hubo diferencias en la reactividad. Con el objeto de evaluar la posible utilidad de la secuencia 370-382 como reactivo de diagnóstico se ensayó su reactividad en ELISA y en solución de sueros hiperinmunes contra arenavirus del Viejo y del Nuevo Mundo, obteniéndose resultados positivos. Cuando se determinó la reactividad en ELISA del suero anti-LCM con los péptidos con deleciones y los correspondientes a secuencias de Lassa y Pichindé, el suero hiperinmune disminuyó significativamente el titulo con respecto al título con 368-382 y 370-382, demostrando su mayor especificidad. Cuando se realizaron los correspondientes ensayos en solución con las secuencias de Lassa y Pichíndé, la especificidad de la reacción del anticuerpo policlonal fue total: este "vio" en las secuencias mencionadas las diferencias que los AcMs no "veían", probablemente debido a la presencia de anticuerpos contra otro/s epitope/s virales, por ejemplo el GP-2C, definido por otros AcMs obtenidos en nuestro laboratorio. Se realizaron ensayos con sueros de convalescientes de infecciones con diferentes arenavirus; en estos casos la reactividad de 370-382 no fue significativa, pero si lo fue la de 368-382. Se ensuyaren 36 muestras, con resultados positivos en más del 90% de las mismas. Con el objeto de dilucidar la función biológica de la secuencia 370-382 se realizaron diferentes ensayos: para determinar si 33.6 tiene influencia en la neutralización de la infectividad viral dependiente de complementoo en la neutralización mediada por otros AcMs. Los resultados fueron negativos en todos los casos. Para estableccr si la secuencia está involucrada en la inmunidad celular se inmunizaron cobayos con la secuencia 370-382. Los animales desarrollaron anticuerpos contra el péptido y contra el virus, medidos por ELISA. Los ensayos preliminares de linfoproliferación de los esplenocitos de estos cobayos indican que probablemente la secuencia 370-382 está relacionada con fenómenos de inmunidad celular. La conservación de la secuencia 368-382 en los arenavirus del Viejo y del Nuevo Mundo, así cono su innunodominancia, sugieren que puede ser un componente de importancia estructural o funcional en el virión, y apoyan la hipótesis de que los arenavírus derivan de un ancestro común. Por otra parte, la unión de anticuerpos policlonales a la misma le asigna una utilidad potencial como reactivo para la detección de anticuerpos contra arenavirus.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1989 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1989
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