Catálogo de publicaciones

Las leguminosas establecen una asociación simbiótica fijadora de nitrógeno con bacterias del suelo conocidas como rizobios. Cuando la planta crece en condiciones limitantes de nitrógeno comienza un intercambio de señales químicas con especies de rizobios compatibles presentes en la rizósfera, que permite un reconocimiento mutuo muy específico. La bacteria se adhiere a la punta de los pelos radicales, y la planta genera una estructura tubular llamada hilo de infección que permite el avance de la bacteria hacia las células del córtex. Allí se activan las divisiones celulares formando un nuevo órgano llamado nódulo, donde los rizobios son internalizados al citoplasma de las células vegetales y se lleva a cabo la fijación de nitrógeno atmosférico a formas fácilmente asimilables por la planta. Phaseolus vulgaris (poroto) es una leguminosa de origen americano que ha diversificado genéticamente en dos centros geográficos independientes, el Andino y el Mesoamericano. El estudio molecular de la diversidad de rizobios presentes en nódulos ha permitido determinar que Rhizobium etli es la especie que ocupa predominantemente los nódulos de P. vulgaris. A su vez, los cultivares de origen Mesoamericano nodulan preferentemente y de manera más eficiente con cepas que poseen el alelo tipo α en el gen nodC, mientras que las plantas de origen Andino nodulan más eficientemente con cepas con un alelo tipo δ. Este sistema representa un excelente modelo experimental para el estudio de los determinantes moleculares que participan en el reconocimiento específico entre ambos simbiontes y lleva al establecimiento de una interacción preferencial y más eficiente. Estudios previos de nuestro laboratorio permitieron identificar y caracterizar a nivel funcional distintos genes implicados en esta respuesta. Uno de ellos codifica para la subunidad C1 del factor de transcripción NF-Y, el cual es un regulador transcripcional requerido tanto para la infección bacteriana y la organogénesis del nódulo, como para la nodulación preferencial por cepas nodC-α. La subunidad NF-YC1 interacciona con las subunidades NF-YA1 y NF-YB7 formando un trímero funcional en la simbiosis. A su vez, NF-YC1 interacciona físicamente con un factor de transcripción de la familia GRAS denominado SIN1, el cual es requerido para la infección y organogénesis del nódulo, así como también para el desarrollo de raíces laterales, siendo un excelente ejemplo de la interconexión de programas transcripcionales en el desarrollo de dos órganos diferentes. En la presente Tesis doctoral se abordó la caracterización de las bases moleculares de una interacción simbiótica eficiente mediante el análisis transcriptómico por secuenciación masiva de ARN de raíces de plantas de poroto de origen Mesoamericano y Andino inoculadas con cepas tipo nodC-α, nodC-δ o con medio de cultivo a modo de control. Este análisis permitió identificar genes que se expresen de manera diferencial frente a las cepas más eficientes, y además, distinguir las respuestas moleculares específicas de cada cultivar frente a cada cepa. Estos genes codifican proteínas involucradas en diferentes procesos de percepción y señalización, regulación de la transcripción, procesos rédox y en modificaciones de la pared celular y la membrana plasmática, los cuales son requeridos para la iniciación y progresión de los hilos de infección. En una segunda etapa de este trabajo de Tesis se identificaron genes que son regulados de manera directa por los factores de transcripción NF-YC1, NF-YA1 y SIN en etapas tempranas de la simbiosis entre P. vulgaris y R. etli. Para ello se utilizaron plantas que expresan de manera ectópica y constitutiva estos factores de transcripción como fusiones traduccionales al epitope FLAG, las cuales se utilizaron en experimentos de inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR (ChIP-PCR) para identificar genes regulados directamente por dichos factores transcripcionales. Esta aproximación experimental permitió identificar genes que participan en la activación de las divisiones mitóticas y de la infección rizobiana. Por último, para profundizar en el conocimiento sobre la vía de transducción de señales que involucra a NF-YC1, en nuestro laboratorio se realizó un screening de una biblioteca de doble híbrido de levadura para identificar proteínas que interaccionen físicamente con NF-YC1. Uno de los clones identificados codifica una proteína quinasa, a la cual denominamos NF-YC1 Interacting Protein Kinase (NIPK). La interacción física entre NF-YC1 y NIPK fue confirmada mediante ensayos de doble híbrido, complementación bimolecular de fluorescencia y ensayos de co-inmunopreciptación. Posteriormente se caracterizó la localización subcelular de NIPK detectándose tanto en el citoplasma como en la membrana plasmática. La caracterización fenotípica de plantas de P. vulgaris silenciadas en NIPK utilizando dos RNA de interferencia (RNAi) dirigidos a diferentes regiones del mRNA, revelaron que NIPK sería requerido para la organogénesis y desarrollo de los nódulos, así como también la frecuencia de la infección rizobiana. El conjunto de resultados obtenidos en este trabajo de Tesis no sólo contribuyen a comprender en mayor detalle los mecanismos moleculares que gobiernan el establecimiento de una simbiosis fijadora de nitrógeno eficiente entre P. vulgaris y R. etli, sino que también sienta las bases para futuros proyectos de investigación y desarrollo que permitan optimizar la fijación de nitrógeno en una planta de interés agronómico y alto valor social para los pueblos del Noroeste Argentino.

Los virus fitopatógenos producen alteraciones en el metabolismo y la fisiología de sus huéspedes provocadas principalmente por alteraciones en la expresión génica durante las infecciones. Numerosos cambios están asociados a respuestas de estrés y defensa y sus efectos secundarios son probablemente causantes de los síntomas. El uso de plantas transgénicas que expresan proteínas virales constituye un sistema útil para estudiar la complejidad de la interacción planta-virus. Con el fin de determinar patrones de expresión génica alterados, se emplearon líneas que expresan proteínas del TMV sin función supresora del silenciamiento: la proteína de cápside mutada (CPT42W), la proteína de movimiento (MP)y una línea co-expresante (MPxCPT42W)que mostró alteraciones morfológicas (semejantes a síntomas)y de acumulación de miARNs. Se realizó un microarreglo para detectar cambios transcripcionales asociados a la coexpresión de CPT42W y MP, utilizando como control una línea isogénica con ambos transgenes silenciados y fenotipo normal (mpxcpT42W*). Se estudiaron procesos biológicos cuyos genes mostraron alteraciones por la co-expresión de CPT42W y MP, focalizando en vías relacionadas a estrés oxidativo, inmunidad innata y vías degradación de ARN. Se demostró que CPT42W y MP modularon la defensa innata de un modo complejo: MP parecería actuar como inductor de defensa, alterando los niveles de ERO y SA mientras que CP jugaría un rol antagónico, inhibiendo la expresión de PR-1 y RDR1. Por otro lado, estudios funcionales en vías de degradación de ARN, demostraron que genes componentes del ARN exosoma, inducidos por la expresión de MP y CPT42W, estarían implicados en la alteración de miARNs y constituirían mecanismos alternativos subyacentes a la generación de síntomas en infecciones virales. Este trabajo constituye un importante aporte al entendimiento de los mecanismos de defensa antiviral y de producción de síntomas, proporcionando herramientas para diseñar nuevas estrategias biotecnológicas de control de virosis en cultivos de interés agronómico

En esta tesis doctoral se abordó el estudio de los parámetros que regulan las reacciones de transferencia electrónica (TE) en sistemas proteicos dentro del marco teórico desarrollado por Marcus. Para ello se emplearon métodos espectroscópicos, electroquímicos, espectroelectroquímicos y computacionales. En particular, se investigaron dos componentes de la cadena de transporte respiratorio: el citocromo c (Cyt), un transportador soluble de electrones y el centro de CuA, el aceptor primario de la citocromo c oxidasa. En primer lugar, se estudió el rol de la dinámica proteica del Cyt y su modulación por campos eléctricos de relevancia biológica. Se verificó que dicha dinámica es crucial en la regulación de las reacciones de TE que tienen lugar en la cadena de transporte de electrones a través de la modulación del acoplamiento electrónico entre donor y aceptor. Por otro lado, se encontró evidencia de que el campo eléctrico regularía la alternancia entre dos conformaciones del Cyt que difieren principalmente en la magnitud de la energía de reorganización. Finalmente, se constató el rol fundamental de las fluctuaciones térmicas y la dinámica proteica para las reacciones de TE en centros de CuA. Dichos centros podrían alternar entre dos estados electrónicos distintos, en los cuales el balance entre la energía de reorganización y el acoplamiento electrónico permitiría conferir direccionalidad a las reacción de TE a pesar de presentar un ΔG≈0. El conjunto de los resultados obtenidos sugiere que los procesos de TE en sistemas biológicos se encuentran finamente regulados, y en particular nos permiten postular un mecanismo de retroalimentación negativa cuyo actor principal es el campo eléctrico interfacial.

Fil:Chazenbalk, Gregorio Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las señales de luz y temperatura proveen información a las plantas acerca del ambiente circundante. En respuesta a estas señales las plantas modulan su metabolismo y desarrollo. Estas dos variables ambientales suelen estar fuertemente interrelacionadas en la naturaleza. Sin embargo, hasta el momento no se han hecho estudios exhaustivos de sus efectos conjuntos. El objetivo de este trabajo es estudiar la percepción de estas señales combinadas y su interacción a nivel molecular. En particular, nos centraremos en la función del receptor fitocromo B y la vía de señalización controlada por este durante el desarrollo de plantas de Arabidopsis thaliana. El fitocromo B fue caracterizado como un receptor de luz roja y rojo lejana, y es uno de los fotorreceptores más relevantes en el control de la fotomorfogénesis. Dependiendo de la calidad de luz incidente se modulan los niveles de su forma activa y se modula una cascada de señalización que involucra una fuerte regulación del transcriptoma. Entre los procesos controlados por este receptor se encuentra la elongación del tallo (hipocotilo) y la posición de las hojas. A mayor actividad de fitocromo B, más inhibida se ve la elongación y las hojas adquieren una posición menos erecta. La temperatura también regula estos procesos, observándose una mayor elongación del hipocotilo y una posición más erecta de las hojas a mayor temperatura. Sin embargo, hasta el momento no se conocía el receptor involucrado en la percepción de esta señal. En este trabajo pudimos determinar que el fitocromo B funciona como un sensor conjunto de luz y temperatura. Debido a esto no sólo percibe la calidad de la luz sino también cambios en la irradiancia. En concordancia con esta observación, proteínas previamente descriptas como parte de la vía de transducción de la señal de luz, también demostraron estar reguladas por la temperatura ambiente. Esto pone de manifiesto la fuerte integración de señales que realizan las plantas, lo cual les permitiría lograr una mejor adaptación al ambiente donde se desarrollan.

Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos, una enfermedad endémica en nuestro país. Xac es capaz de desarrollar biofilms in vitro y sobre hojas, propiedad importante para el desarrollo de esta enfermedad. En esta tesis se buscaron nuevos genes involucrados tanto en la adhesión como en el desarrollo del biofilm. Para esto, se realizaron mutantes en genes candidatos y se utilizó una biblioteca de mutantes generadas al azar. Mediante mutagénesis dirigida se estudiaron los roles del flagelo, de la adhesina FhaB y de los dos sistemas de secreción de tipo II presentes en la bacteria. Todas las mutantes deficientes en estos sistemas tuvieron problemas en la adhesión in vitro. Se observó que las bacterias mutantes en el gen que codifica para las proteínas que conforman el gancho flagelar además presentaron dificultades en el desarrollo del biofilm in vivo y deficiencias en la patogenicidad. A través de la realización de un screening donde se utilizó una colección de mutantes generadas al azar, mediante la inserción del transposón Tn5, se encontraron genes cuya participación en el desarrollo del biofilm de Xac ya se conocía: gumB (codifica para una proteína involucrada en la exportación del xantano), xcsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xcs), xpsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xps). También se encontraron nuevos genes implicados en la adhesión de esta bacteria, algunas de estas mutantes presentaron además una importante disminución en su patogenicidad. Se siguió caracterizando en mayor profundidad a una de ellas. La mutante posee una inserción en el gen hrpM, que codifica una glucosiltransferasa implicada en la síntesis de glucanos lineales, de acuerdo a lo que se conoce en otras bacterias. Se observó que esta mutante tiene disminuida su patogenicidad y además es incapaz de sintetizar glucanos cíclicos.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

En Argentina la vacunación contra la tos convulsa comienza en los años setenta con la incorporación masiva de la vacuna celular triple bacteriana (DTP – Difteria, Tétanos y Pertussis) en el Calendario Nacional de Vacunación con tres dosis a los 2, 4 y 6 meses y un refuerzo a los 18 meses. La situación epidemiológica de la enfermedad motivó en los años ochenta la incorporación de un refuerzo al ingreso escolar y en el año 2009 un refuerzo en la población adolescente. Se espera que estas estrategias mejoren el control de esta enfermedad que para Argentina, al igual que para otros países, continúa siendo un problema para la salud pública. Varias son las hipótesis respecto de las causas de la situación epidemiológica actual de la enfermedad, la mayoría de ellas están asociadas a las vacunas: coberturas subóptimas, relativa baja efectividad de las vacunas en uso, corta duración de la inmunidad conferida por las vacunas ya sean celulares o acelulares, adaptación del agente causal a huéspedes inmunes, o combinaciones de cualquiera de las anteriores. En este contexto dentro de los objetivos planteados en el desarrollo de este trabajo de Tesis se encuentra la caracterización de la población de Bordetella pertussis circulante en nuestro país. En particular, nos dedicaremos a la evaluación de su divergencia y de su polimorfismo respecto de ciertos factores de virulencia implicados en la protección. Estos objetivos se extendieron a las cepas vacunales ya que nuestro grupo de investigación está involucrado de manera directa con un proyecto que persigue la reactivación de la producción nacional de vacunas. De manera complementaria a estudios realizados previamente en nuestro grupo, evaluamos la implicancia de la divergencia genómica en la funcionalidad bacteriana focalizando los estudios a las cepas vacunales, en particular a cuatro cepas con potencialidad de ser incluidas en una formulación producida en nuestro país. Para una mejor compresión de los experimentos realizados y los resultados alcanzados comenzaré este trabajo con una reseña histórica de la tos convulsa y con una descripción de las principales características de su agente causal. Me referiré luego a las vacunas anti-pertussis desarrolladas y empleadas para el control de la enfermedad. Presentaré datos sobre la epidemiología actual de pertussis en el mundo y en nuestro país y discutiré las hipótesis hasta ahora planteadas para explicar las causas de la resurgencia de la enfermedad de forma que a partir de allí se puedan plasmar los objetivos específicos abordados durante mi trabajo de Tesis. En los capítulos siguientes a la introducción presentaré los resultados alcanzados esperando que los mismos confluyan a las conclusiones finales de mi trabajo las cuales espero contribuyan al conocimiento sobre esta patología y sobre las estrategias de control hoy en uso.

El sistema de producción invernal de frutilla, dominado por 'Camarosa'., tiende a ampliar su espectro varietal. Las recomendaciones actuales de fertilización no consideran particularidades genéticas ni eficiencia en el uso de los nutrientes (EUNu). Los objetivos de este trabajo de tesis son: estudiar la respuesta de cultivares de frutilla contrastantes en morfología y fisiología a incrementos en la fertilización NPKCaMg, determinar e interpretar índices de EUNu y cuantificar efectos ambientales, genotípicos y nutricionales sobre los atributos de calidad de frutos. Se evaluaron 'Camarosa'., 'Camino Real', 'Sabrosa' y 'Ventana' ante incrementos en la fertilización, a partir de un tratamiento testigo '1' (120N, 30P, 186K, 31Ca y 12Mg kg/ha)proporcionalmente a '1,5' en 2006, '1,33' y '1,66' en 2007, '1,5' y '2' en 2008. Esto determinó una respuesta genotípica diferencial cuadrática que definió dosis óptimas: 'Camarosa' 15 por ciento a dosis 1,53, 'Camino Real' 6 por ciento a dosis 1,36, 'Sabrosa' 4 por ciento a dosis 1,29 y 'Ventana' 19 por ciento a dosis 1,59. A mitad del ciclo, el número de hojas se correlacionó con el rendimiento total y los cultivares de mayor respuesta mostraron mayor K y menor Ca foliar, acentuado al aumentar la fertilización. La productividad del nutriente aportado (rendimiento/fertilización)resultó mayor en cultivares más productivos y de mayor respuesta. El balance de nutrientes (absorción/fertilización)dependió de la interacción genotipo por ambiente. La eficiencia de recuperación (absorción/fertilización)fue proporcional a la respuesta a la fertilización. Los coeficientes de eficiencia interna (biomasa/absorción y rendimiento/absorción)resultaron diferentes entre cultivares y consistentes entre tratamientos de fertilización. Peso de fruto y sólidos solubles totales variaron con la interacción genotipo por ambiente; firmeza, tono de color, y acidez con el genotipo y el ambiente; ninguno de ellos varió la nutrición. Los resultados sientan bases nutricionales para el cultivo de frutilla, en cuanto a la absorción genotípico-diferencial de nutrientes y sus efectos en el crecimiento, producción y EUNu.

La humedad de grano a cosecha es de vital importancia para la producción de maíz, ya que afecta la calidad de la semilla y los costos de producción. Uno de los principales objetivos del mejoramiento es reducir el contenido de agua del grano a cosecha para disminuir el impacto económico del secado artificial. Además del momento en el que tiene lugar la madurez fisiológica, la tasa de secado después de la misma tiene un alto impacto en la humedad a cosecha. La tasa de secado es de difícil fenotipificación a campo, por lo que asociar el secado con otros caracteres de fácil determinación es de gran utilidad. Asimismo, determinar las bases genéticas (QTL) de estos caracteres es de gran interés para el mejoramiento. Finalmente, evaluar estos caracteres y sus bases genéticas no sólo en líneas sino también en híbridos derivados es relevante para su aprovechamiento en mejora genética. Los objetivos de la presente tesis fueron (i) caracterizar fenotípicamente una población de líneas e híbridos derivados para tasa de secado y diversos caracteres potencialmente asociados con la tasa de secado (tiempo a antesis, stay green, largo y número de chalas), (ii) establecer la correlación entre la tasa de secado en líneas e híbridos, y su relación con los otros caracteres fenotípicos medidos, y (iii) estudiar las bases genéticas (QTLs) de la tasa de secado tanto en líneas como en híbridos. Para cumplir estos objetivos se sembró una población biparental de líneas recombinantes (RlLs, n=129) y sus híbridos derivados de la cruza por un tester (n=129) en dos ambientes (fechas de siembra temprana y tardía) en Venado Tuerto. La tasa de secado se determinó ajustando un modelo lineal a mediciones periódicas de humedad post-madurez fisiológica en cada genotipo. Para la detección de QTLs se utilizó un modelo multi-atributo multi-ambiente para el conjunto de genotipos con regresión por mapeo de intervalos compuestos (CIM) en base a un mapa con más de 3000 SNPs. La variabilidad fenotípica en líneas e híbridos para tasa de secado fue menor que para el resto de los caracteres, lo que determinó una baja heredabilidad. La influencia del ambiente en la tasa de secado fue muy importante. Se encontraron correlaciones significativas entre la tasa de secado y caracteres como el tiempo a antesis y el stay green en la fecha de siembra tardía, lo que sugiere que ciertos atributos del genotipo serían importantes en ambientes que limiten la desecación. No se pudo establecer una relación entre las líneas y sus híbridos derivados para la tasa de secado. Se encontraron QTLs para algunos caracteres estudiados como tiempo a antesis, y número de chalas, y sólo uno para tasa de secado en líneas, aunque no fue consistente entre ambientes. Se concluye que la mejora genética para tasa de secado se ve limitada por su difícil fenotipificación y fuerte interacción con el ambiente. La elección de la población de mapeo es asimismo sumamente importante para asegurar el éxito de los resultados en este tipo de atributos.