Este trabajo de Tesis tuvo por objeto e] estudio del plasma seminal humano y sus glicoproteínas antigénicas. En él se presentan: 1.- Una introducción donde se discuten las investigaciones realizadas hasta ese momentoen el P.S.H. Estos antecedentes son fundamentalmente de tipo clínico e inmunológico, y recién a partir de 1974 comenzaron a aparecer unos pocos estudios de tipo químico. Estos trabajos estuvieron destinados principalmente a la evaluación de la fertilidad masculina y no a la búsqueda del origen de los problemas de infertilidad. 2.- Dada la complejidad del P.S.H. y la diversidad de sus componentes, se incluye una descripción del órgano que los produce, el aparato reproductor masculino, no sólo en su aspecto morfológico sino también fisiológico. 3.- Los estudios realizados sobre los componentes macromoleculares y de bajo peso molecular del P.S.H.. En el primer caso se trató, asimismo, de ejemplificar con algunos casos de deficiencias orgánicas y, a partir de los estudios llevados a cabo con dadores sanos y fértiles, se postuló la necesidad de que en el futuro se proceda también a investigar los eyaculados humanos provenientes de distintos casos patológicos. 4.- Para una mejor comprensión del tema de investigación y en razón de tratarse de un tema relativamente reciente, poco desarrollado, que requiere el uso de numerosos conocimientos teóricos, se procedió a 1a revisión de los mismos. Esta revisión se efectuó dentro del margen mínimo compatible con dicha comprensión y sólo se incluyeron los aspectos considerados indispensables. Este resumen teórico abarca: a.- Una descripción sobre las glicoproteínas y su importante papel biológico: la inducción de la conformación proteica, la protección de la proteína contra el ataque proteolítico, el control de la permeabilidad de membrana, y su función como señal de reconocimiento. Se presenta también un estudio sobre la estructura primaria de n-glicanos e isoglicanos, la determinación de la estructura por espectroscopía de r.m.n.-¹H, y la conformación espacial de los glicanos. b.- Un estudio de las uniones hidratos de carbono-proteína más importantes, haciendo énfasis en las O-glicosídicas dado que son las usualmente encontradas en secreciones como el P.S.H. Se indican asimismo, los tipos de ruptura, los métodos de determinación de aminoácidos olefínicos y los efectos de la degradación alcalina sobre las cadenas de hidratos de carbono. c.- Se presenta con cierto detalle un análisis sobre las distintas lectinas empleadas en este trabajo, ya que el estudio de estos compuestos ha demostrado en los últimos años su extraordinaria importancia, por ejemplo, en la investigación sobre la naturaleza y estructura de las cadenas de hidratos de carbono. d.- Se discuten las ventajas de la cromatografía de afinidad sobre los métodos cromatográficos convencionales para el aislamiento y purificación de las glicoproteínas, y las características de la lectina empleada en este caso, la Con A inmovilizada sobre Sepharosa 4B. e.- Se analiza la posibilidad que ofrece la cromatografía de interacción hidrofóbica una separar los componentes del P.S.H. en base a las diferentes fuerzas de interacción hidrofóbica entre éstos y los grupos hidrofóbicos de la fase no cargada (Octyl-Sepharosa). 6.- Las características del estudio realizado y la gran variedad de datos obtenido determinaron que, para lograr una mayor claridad en la descripción y discusión de los resultados, se hiciera necesario separar la presentación de los estudios del plasma seminal entero del de las fracciones glicoproteicas obtenidas a partir del mismo. El resumen de dichos estudios se indica a continuación: I.- Plasma seminal humano. La composición en monosacáridos del P.S.H.D. presentó las características propias de las glicoproteínas de tipo O-glicosídico, es decir, N-acetiigaiactosamina, galactosa, fucosa y ácido N-acetilneuramínico, y también se encontraron monosacáridos de glicoproteinas N-glicosídicas, como manosa y N-acetilglucosamina. Esto nos llevó a suponer que el P.S.H. podia estar constituído por glicoproteínas de ambos tipos (mucinas y séricas). Por otra parte, los aminoácidos determinados en el P.S.H.D. no eran ni los de las mucinas ni los de las glicoproteínas de tipo sérico; para interpretar este hecho se tuvo en cuenta que el P.S.H. contiene fluido prostático que es rico en proteasas que hidrolizan los componentes protéicos del mismo, siendo un fenómeno visible de esta proteólisis la licuefacción del coágulo luego de la eyaculación. Se demostró también la presencia de lipoproteínas en el P.S.H.D. La inmunodifusiones contra antisuero de conejo (A.P.S.H.D.) presentaron una distribución compleja de, por los menos, seis bandas definidas y un fondo difuso. La alta velocidad de difusión indicó un bajo peso molecular para los antígenos. En la inmunoelectroforesis contra A.P.S.H.D. no se observó la presencia de albúmina ni de los componentes de mayor movilidad catiónica o aniónica. Aparecen, por lo menos, siete líneas de precipitación; la posición de los arcos, un poco deformados, indicó la heterogeneidad carga/masa de los antígenos y la similitud de las propiedades de difusión. Los resultados de la ultracentrifugación del P.S.H.D. en un medio de alta fuerza iónica y en un medio altamente disociante, mostraron la formación de un único pico, y en ambos casos se observó una polidispersión del peso molecular. La obtención de un pico más agudo y simétrico en el medio conteniendo detergente, indicó una distribución más estrecha del peso molecular. Los diagramas de elución de 1as cromatografías sobre Sephadex G-100 indicaron una complejidad creciente al incrementar la fuerza iónica del medio, aunque la distribución total no varió demasiado, observación que no se repitió al cromatografiar en un medio con detergente donde el diagrama de elución resultó más compiejo, con la aparición de nuevos picos; la adición de una sal caotrópica a dicho medio redujo la complejidad. Al cromatografiar sobre Sephadex G-15, los diagramas más complejos se obtuvieron nuevamente en medio con detergente. La cromatografía sobre Octyl-Sepharosa reveló la diferente hidrofobicidad de los componentes del P.S.H.D. En 1a electroforesis sobre gel de poliacrilamida se encontró una distribución nuevamente compleja de los componentes, con varias bandas, bien definidas, y pesos moieculares aparentes comprendidos entre 1os 10.000 y 93.000 da1tons. Al disminuir la concentración de la muestra se observaron solamente dos bandas, gruesas, y otras más débilmente coloreadas y sus pesos moleculares fueron de 10.000 a 16.000 daltons. Los estudios de las estructuras de los oligosacáridos del P.S.H.D. por reacción con lectinas mostraron que estos componentes dan reacciones positivas con todas las lectinas seleccionadas para este trabajo, tanto antes como después del tratamiento con neuraminidasa. Este estudio permitió determinar los extremos terminales no reductores de las cadenas de oligosacáridos, asi como algunas de las unidades subterminales a los mismos. La determinación de los aglutinógenos indicó que el P.S.H.D. presenta actividad de grupos sanguíneos A, B y 0, lo que demostró la presencia de los correspondientes determinantes antigénicos. II.- Fracciones glicoproteicas del P.S.H.D. El estudio de las cromatografías de afinidad del P.S.H.D. sobre Con A-Sepharosa permitió deducir que las glicoproteínas eluídas con el buffer de fosfato a volúmenes de elución correspondientes a los marcadores no interactuantes, no contenían grupos terminales no reductores o de interior de cadena con la configuración adecuada para interaccionar con la lectina. Dado que estos componentes no eran eluídos en un solo pico, se sugirió que la separación se debia a interacciones débiles entre éstos y la Con A-Sepharosa. La posterior elución con buffer de borato seguida de buffer de fosfato conteniendo α-D-metil-giucósido hizo posible la elución de materiales que interaccionaban con la lectina. Fue posible asimismo correlacionar el efecto de la variación en la concentración del buffer de borato con los cambios de temperatura de ios sistemas cromatográficos, y deducir que el tener en cuenta solamente la especificidad de la lectina no bastaba para explicar el fraccionamiento cromatográfico sobre Con A-Sepharosa del P.S.H.D. La purificación de las fracciones se llevó a cabo por cromatografía sobre Sephadex G-15 y por ultrafiltración. Se verificó que un alto porcentaje de los componentes de las fragciones (no en F1) difunden en la malla del gel G-15 y, por lo tanto, se pudo afirmar que la parte proteica debe estar presente en forma de péptidos de bajo peso molecular, que provienen de la proteólisis del P.S.H.D. Este hecho está de acuerdo con la idea de la formación de agregados moleculares por la afinidad de unión que presentan estos péptidos en las mucinas. El análisis de los hidratos de carbono mostró que las distintas fracciones presentan cantidades variabies de los mismos. Así, entre las F, la F1 posee un 44,5% mientras que la F2 sólo un 3,2%, lo cual explicaría, al menos en parte, el comportamiento diferencial en la cromatografía de afinidad. Si bien la F2 contiene un 24,2% de manosa, no se une a la Con A-Sepharosa, aunque sí reacciona con a Con A soluble. Esto llevó a suponer que la manosa se encuemra en este componente en forma de residuos internos de cadena y que, por impedimentos estéricos debidos a la inmovilización de la Con A en la Sepharosa, presenta un comportamiento diferente en la cromatografía. La fracción B1 también contiene manosa (2,1%) pero no reacciona con la Con A y por lo tanto en esta fracción la presencia de este azúcar podría deberse a una contaminación por la no completa remoción de las glicoproteínas de tipo sérico. Todas las fracciones contienen los monosacáridos comunes a las mucinas, así como la N-acetilglucosamina que se encuentra usualmente en las glicoproteínas de tipo sérico. La reacción con 1a lectina de germen de trigo (w.G.A.) dio una línea de precipitina sólo para la F1 y la B2, pero éstas al ser tratadas con neuraminidasa, mostraron una nueva banda lo que sugirió que la N-acetilglucosamina no es terminal pero sí es subterminal al ácido N-acetilneuramínico. La composición en monosacáridos de estas fracciones no explicaba el comportamiento diferencial de los componentes glicoprotéicos en las cromatografías de afinidad, razón por la cual se intentó encontrar una expiicación en base a las partes protéicas de los mismos. Las fracciones aisladas, si bien contenían los mismos aminoácidos, diferían en los porcentajes de los aminoácidos ácidos, básicos e hidrofóbicos. Este análisis nos llevó a proponer que los agregados están formados por un núcleo de fragmentos hidrofóbicos junto con fragmentos de bajo peso molecular y/o aminoácidos retenidos por interacciones polares. Este modelo es consistente con los resultados obtenidos en la cromatografía de interacción hidrofóbica. III.- Se llevaron a cabo también estudios para determinar el tipo de unión entre las cadenas de hidratos de carbono y la proteína. Los resultados obtenidos, tanto con el P.S.H.D. como con las fracciones componentes, indicaron la existencia de la unión 0-glicosídica entre la N-acetilgalactosamina y el grupo hidroxilo de la serina (treonina), característica de las mucinas. El bajo porcentaje de N-acetilgalactosamina sugirió además, por analogía con lo encontrado en otras mucinas, que este monosacárido estaría presente mayoritariamente en los puntos de unión. La reacción de β-eliminación observada con los β-hidroxiaminoácidos serina y treonina da como productos 1los ácidos 2-amino-2-propenoico y 2-amino-2-butenoico, cuyos productos de reducción son la alanina y el ácido α-aminobutírico. Los resultados obtenidos con el P.S.H.D. y las fracciones F2 y B2 por determinación de la variación del contenido en serina, treonina y alanina, antes y después del tratamiento alcalino, demostraron que el 65-80% de los residuos de serina y el 40-70% de los residuos de treonina estarían involucrados en los puntos de unión de las cadenas de hidratos de carbono a la proteína. IV.-Se llevaron a cabo estudios sobre la descomposición de la fucosa en el medio de hidrólisis, y se efectuó una modificación al método de Dische para la determinación de fucosa en polisacáridos y glicoproteínas que resuelve el problema de la valoración del contenido real de este monosacárido por su destrucción en medio ácido. V.-Se presentan las conclusiones más importantes de este trabajo de Tesis sobre el estudio del plasma seminal humano y de sus glicoproteínas antigénicas, que nos ha permitido asimismo, plantear una hipótesis para los distintos problemas de la biología y la inmunología de la reproducción. 7.- La descripción de las técnicas experimentales utilizadas, así como la adaptación o puesta a punto de las mismas cuando correspondiera, junto con su aplicación al análisis de las glicoproteínas del plasma seminal humano.